亮菌口服溶液對結(jié)腸癌、黑色素瘤轉(zhuǎn)移和肉瘤的保護研究

韓丹陽，王晨莉，時美伶，蘇兆鐸，杜寶珍

（北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，北京 100075）

天然來源的多糖類藥物在發(fā)揮抗腫瘤效果的同時，表現(xiàn)出低細胞毒性或無細胞毒性的顯著優(yōu)勢[1]。研究[2]已經(jīng)表明，多糖類藥物能夠通過激活巨噬細胞和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。提示多糖可能具有免疫保護的能力。亮菌口服液（Armillariella oral solution，AOS）作為擁有完全知識產(chǎn)權(quán)的中成藥，亮菌多糖是其核心成份，臨床上被用于改善慢性胃炎、腸炎的臨床癥狀和體征[3]、放化療引起的白細胞減少[4]和結(jié)直腸癌的抗腫瘤治療[5]。尤其Cheng HR 等報道，亮菌多糖中的β-1，6-葡聚糖，即AAMP-A70，能激活巨噬細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并將促瘤的M2 型巨噬細胞轉(zhuǎn)化為抑瘤的M1 型巨噬細胞，發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。此外亮菌多糖還具有更高的利用率、更低的生產(chǎn)成本和更高的回收率，有利于在工業(yè)規(guī)模上的擴大生產(chǎn)。然而，亮菌多糖能否對結(jié)腸癌、黑色素瘤和肉瘤等惡性腫瘤是否有保護作尚未有報道。本研究分別從離體（采用人結(jié)腸癌細胞系HCT 116 細胞和鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系B16-F10 細胞）和在體（構(gòu)建肉瘤荷瘤小鼠）兩個層面，檢測亮菌多糖的對結(jié)腸癌/黑色素瘤腫瘤細胞的毒性、抗增殖活性和對肉瘤荷瘤小鼠外周血的血小板計數(shù)、總白細胞計數(shù)、白細胞分型計數(shù)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和尿素水平（UREA）的含量以及肝、腎、脾的組織病理學(xué)的影響。以期為亮菌口服液療效的開發(fā)和臨床合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取6 ～8 周齡Balb/c 雌性小鼠24 只，隨機分為對照組（Control 組）、低劑量組（亮菌多糖25 mg·kg-1）和高劑量組（亮菌多糖50 mg·kg-1）。小鼠平均體質(zhì)量（28±2）g，購自北京維通利華公司[合格證號：SCXK（京）2014-0001]。飼養(yǎng)溫度26 ～28℃，光照12 h，均自由采食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究符合倫理學(xué)相關(guān)標準，且經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理會審核批準（批號：20210503096），并遵循了有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定[7]。

1.2 試劑及儀器

亮菌口服溶液，購自四川先通藥業(yè)有限責(zé)任公司（口服，1 次10 ～20 mL，每日3 次，國家準字號：H51023188，規(guī)格：10 mL，無糖型）。氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、半胱氨酸、木瓜蛋白酶、TRISHCl、EDTA （pH 7.4）、MTT [3-（4，5-二甲基噻唑-2-甲基）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]均購自美國Sigma公司，人結(jié)腸癌細胞系HCT 116 細胞和鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系B16-F10 細胞購自中國典型培養(yǎng)物保存中心，酶標儀（Biotek H1，美國），光學(xué)顯微鏡（Leica DM4 B&DM6 B，德國），恒溫震蕩培養(yǎng)箱（SL- 222，SOLAB，巴西），高效液相色譜（島津，京都株式會社，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 亮菌多糖的提取及結(jié)構(gòu)鑒定[8]取15 mL 亮菌口服液加入丙酮中，4℃下充分混合24 h。將析出物在60℃下干燥成干亮菌粉，懸浮析出物加入提取緩沖液（0.1 M 氫氧化鈉，5.0 mM 乙二胺四乙酸和5.0 mM 半胱氨酸，1.0 g 木瓜蛋白酶，pH 6.0）中，并在60℃下以200 rpm 攪拌孵育12 h。然后將培養(yǎng)混合物離心（2 500 g，室溫下20 min），并保存上清液。將殘余物重新懸浮在相同的提取緩沖液中，利用DMB 在 A525 條件下的異染特性進行查驗，直到上清液中沒有亮菌多糖為止。將對異染特性敏感的上清液合并，稱之為粗制物，并在乙醇存在下沉淀亮菌多糖（最終濃度分別為9%、23%、45%和75%）。將每種沉淀的多糖透析、冷凍干燥并在-20℃下儲存。在這些步驟后獲得約0.26 g（干重）的總粗多糖和0.19 g F9（產(chǎn)率分別為1.7%和1.3%），使用以下等式計算：產(chǎn)率（m/m，%）=總粗多糖重量（g） / 干亮菌粉重量（g）×100%。此外，F(xiàn)9 中存在的硫酸化多糖的含量為2.9%，使用以下等式計算：亮菌多糖的產(chǎn)率（%）=硫酸化多糖的生化劑量（g）/干亮菌粉的重量（g）×100%。

1.3.2 亮菌多糖的純化 將乙醇條件下沉淀的亮菌多糖溶解在5 mL 20 mM TRIS-HCl 和50 mM EDTA（pH 7.4）混合的緩沖液中，然后通過上述溶液平衡的DEAE-纖維素柱（10.0 cm×2.0 cm）純化，并用50 mL 上述緩沖液洗滌。柱的流速為0.5 m·min-1。收集1.0 mL 樣品后用DMB 和電導(dǎo)率異染分析法測定亮菌多糖。在平衡、洗脫、收集和餾分檢查相同的條件下，將DEAE-纖維素（亮菌多糖）獲得的峰應(yīng)用于高效液相色譜。

1.3.3 腫瘤細胞培養(yǎng) 采用人結(jié)腸癌細胞系HCT 116 細胞和鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系B16-F10 細胞檢測亮菌多糖的細胞毒性。HCT 116 細胞在裝有RPMI-1640 培養(yǎng)基的塑料燒瓶中生長，含有10%胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、100 g·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素，并在37℃和5% CO2條件下孵育。注射肉瘤細胞到小鼠的腹膜腔中以進行體內(nèi)抗腫瘤檢測。從供體動物的腹腔收集腹水，并制備含有5 mL乳酸林格氏液、0.2 mL 慶大霉素（5 mg·mL-1）和0.5 mL 腹水的懸浮液。受體動物腹腔接種2×106cells/0.5 mL。該過程每10 d 進行1 次。

1.3.4 MTT 法檢測細胞毒性 通過MTT [3-（4，5-二甲基噻唑-2-甲基）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]測定法進行評估。HCT116 和B16-F10 細胞以每孔4×104的密度接種在96 孔板上，培養(yǎng)基為200 μL。加入亮菌多糖的濃度分別為10 μg·mL-1、100 μg·mL-1和250 μg·mL-1。 以二甲基亞砜（DMSO，0.05%）為陰性對照，以抗腫瘤化合物阿霉素（0.016 ～50 μM）為陽性對照。處理后，將培養(yǎng)基重新放入含有MTT 溶液（0.5 mg·mL-1）的新鮮培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)3 h。然后，取出MTT 溶液，將平板在35℃條件下干燥30 min。將甲瓚產(chǎn)物溶解在150 μL 二甲基亞砜中，在570 nm 讀取吸光度。使用GraphPad Prism 6.1 軟件，通過非線性回歸的算法將標準化吸光度數(shù)值轉(zhuǎn)化為生長抑制百分比，計算抑制濃度均值（IC50）及其95%置信區(qū)間（CI 95%）。

1.3.5 肉瘤動物模型構(gòu)建 將8 日齡肉瘤腹水腫瘤細胞稀釋在乳酸林格氏液中，經(jīng)皮下植入小鼠左腋窩（2×106cells/500 μL）。腫瘤移植后24 h，腹腔注射溶于鹽水或無菌鹽水的亮菌多糖（25 mg·kg-1或50 mg·kg-1）。腹腔注射7 d 后，從小鼠眼眶后叢收集外周血樣本。并對動物實施安樂死，切除腫瘤、肝臟、脾臟和腎臟，稱重并固定在10%甲醛中。腫瘤生長抑制率由下式計算：抑制率（%）=[（A-B）/A]×100%，其中A 為陰性對照的腫瘤重量平均值，B 為治療組的腫瘤重量平均值。在腫瘤移植當天和治療的最后1 d 測量體質(zhì)量。血樣用于血液和生化分析。

1.3.6 生化分析 血液2 500 rpm·min-1離心15 min后，對所獲得的血清樣品進行生化分析。測定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和尿素水平（UREA）的含量。

1.3.7 血液分析 每只小鼠取外周血500 μL 置于乙二胺四乙酸中，在光學(xué)顯微鏡下通過標準手動程序進行各種血液學(xué)參數(shù)（血小板、總白細胞、淋巴細胞和單核細胞計數(shù)）的記錄。

1.3.8 組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)分析 用甲醛固定后，大體檢查腫瘤、肝臟、脾臟和腎臟的大小、顏色變化以及出血情況。然后，將腫瘤、肝、脾和腎切成5 μm 厚度的切片，對組織切片進行蘇木精和伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡進行組織學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

以SPSS 22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示，組間比較進行單因素方差分析，進一步2 組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亮菌多糖對離體條件下腫瘤細胞增殖的影響

在體外檢測亮菌多糖對結(jié)腸癌B16-F10 細胞和黑色素轉(zhuǎn)移瘤HCT116 細胞的抗增殖作用，不同濃度（10 μg·mL-1、100 μg·mL-1和250 μg·mL-1）的硫酸化亮菌多糖均未發(fā)揮細胞毒性作用，均未能顯著抑制上述腫瘤細胞系生長（P＞0. 05）。見圖1。

2.2 亮菌多糖對在體條件下腫瘤細胞增殖和器官重量的影響

在給予亮菌多糖治療后，小鼠肉瘤的生長顯著延遲。對照組的肉瘤重量為（2.09±0.42）g，而劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1亮菌多糖治療組的小鼠的肉瘤重量分別為（1.15±0.27）g 和（1.01±0.19）g。與對照相比，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的亮菌多糖對腫瘤生長抑制百分比分別為42.32%（P＜0.05）和51.26%（P＜0.05），見圖2A。與對照組相比，亮菌多糖劑量依賴性地增加小鼠的相對脾臟重量，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1劑量的亮菌多糖分別誘導(dǎo)脾臟重量增加39.70%（P＜0.05）和70.51%（P＜0.05），見圖2B。亮菌多糖處理后的小鼠腎臟重量與對照組相比顯著增加（P＜0.05），見圖2C。但亮菌多糖處理后小鼠肝臟重量與對照組相比無顯著變化（P＞0.05），見圖2D。

圖2 亮菌多糖對在體條件下腫瘤細胞增殖和器官重量的影響

2.3 亮菌多糖對荷瘤小鼠外周血和生化參數(shù)的影響

與對照組相比，劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的亮菌多糖處理組外周血的血小板計數(shù)均顯著增加（P＜0.05），見圖3A；而總白細胞計數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的百分比沒有顯著差異（P＞0.05），見圖3B-E。與對照組相比，劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的亮菌多糖處理組的血漿尿素水平無顯著差異（P＞0.05），但丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著增加（P＜0.05），見圖4。

圖3 亮菌多糖對小鼠外周血中血小板計數(shù)、總白細胞計數(shù)、嗜中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的影響

圖4 亮菌多糖對小鼠的血漿尿素（UREA）水平和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平的影響

2.4 亮菌多糖對荷瘤小鼠腫瘤、脾、肝和腎組織病理形態(tài)的影響

腫瘤的組織病理學(xué)分析顯示對照組和亮菌多糖治療組之間的荷瘤模式未見差異。各組均出現(xiàn)惡性腫瘤，并伴有強烈的細胞解體（圖5A-C）。各組腫瘤中伴有大量有絲分裂像、骨骼肌浸潤和凝固性壞死。各組動物脾臟的組織病理學(xué)分析顯示白髓增生、卵泡解體和巨核細胞的存在。劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠的脾臟均顯示出強烈的卵泡解體（圖5D-F）。各組的小鼠腎臟組織病理學(xué)分析顯示腎小球保存良好，并有輕度出血。劑量為25 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠腎臟呈現(xiàn)管狀上皮的小空泡化和壞死點，而劑量為50 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠僅呈現(xiàn)管狀上皮的空泡化。各實驗組均出現(xiàn)腎小管上皮細胞中度腫脹以及腎小球和腎小管出血（圖6D-F）。對小鼠肝臟的組織病理學(xué)評估顯示，各組均存在庫普弗細胞增生和細胞腫脹。對照組顯示肝細胞中度細胞腫脹。劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠肝臟均呈現(xiàn)局灶性炎性病灶和棕色色素沉積，提示上述劑量亮菌多糖處理都造成小鼠肝臟膽紅素的產(chǎn)生（圖6A-C）。

圖5 亮菌多糖對荷瘤小鼠腫瘤和脾的影響

圖6 亮菌多糖對荷瘤小鼠腎臟和肝臟的影響

3 討論

CIUREA 等[9]報道，抗癌治療通常會伴發(fā)血小板減少癥，最終導(dǎo)致出血和死亡。本研究發(fā)現(xiàn)亮菌多糖治療會引起荷瘤小鼠外周血血小板計數(shù)增加。這提示亮菌多糖在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時，還能有效避免血小板減少癥的出現(xiàn)，進而對腫瘤患者發(fā)揮保護作用。LIU 等[10]研究表明當歸根多糖通過PI3K/AKT 途徑促進小鼠造血和血小板生成。此外，荷瘤小鼠經(jīng)亮菌多糖處理后，沒有顯著的白細胞計數(shù)改變。而白細胞減少也是臨床使用的一些抗腫瘤藥物的常見副作用。

此外，通過對小鼠臟器的組織病理學(xué)和生物化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)亮菌多糖處理的小鼠沒有表現(xiàn)出生物學(xué)相關(guān)的肝或腎毒性。而RAMOS 等[11]報道，用松葉提取物處理后，荷瘤小鼠外周血的AST 水平增加2 ～3 倍，尤其是小鼠發(fā)生肝細胞空泡化和肝脂肪變性，雖然亮菌多糖處理的荷瘤小鼠血清AST 水平升高，但肝臟結(jié)構(gòu)未見顯著變化。而抗癌治療對健康組織毒性很大，過大的副作用會直接影響到療效。因此，亮菌多糖與化療的聯(lián)合應(yīng)用可能會改善化療的副作用。

本項研究中的所有小鼠都移植了腫瘤，也包括對照組，因此高劑量亮菌多糖對外周血單核細胞計數(shù)的影響與腫瘤的存在無關(guān)。先天或適應(yīng)性免疫反應(yīng)依賴于粒細胞穿過血管，髓樣細胞正是由于對腫瘤微環(huán)的境刺激十分敏感，才成為癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。所有降低腫瘤微環(huán)境的促瘤特征或激發(fā)免疫反應(yīng)是當今主流的抑制腫瘤增殖的策略。在亮菌多糖處理的小鼠中觀察到的單核細胞數(shù)量減少以及腫瘤生長延遲可能與單核細胞活化有關(guān)，值得進一步研究。本研究結(jié)果提示高劑量亮菌多糖誘導(dǎo)有可能發(fā)揮宿主依賴性抗腫瘤作用。