丹蛭降糖膠囊對db/db 小鼠攝食行為及腦攝食中樞α-MSH、AgRP 的調節作用研究

畢 正，魯云霞，張銀玉，李金菊，周 恒，呂溪娟，方朝暉

（1. 安徽中醫藥大學，合肥 230012；2. 安徽醫科大學，合肥 230031；3. 安徽中醫藥大學第一附屬醫院，合肥 230031）

糖尿病流行病學調查研究[1]顯示，我國糖尿病患者已超過1.5 億人。糖尿病群體的不斷擴大給疾病的防治帶來新的挑戰與要求。糖尿病患者中90%以上的患者都是2 型糖尿病[2]，而2 型糖尿病的病因極為復雜并且受多種因素的影響，其中長期過量進食引起的肥胖是2 型糖尿病發生發展的重要因素之一[3]。

丹蛭降糖膠囊（Danzhi Jiangtang Capsule，DJC）是安徽中醫藥大學第一附屬醫院的一款院內制劑，用于2 型糖尿病患者的治療已有30 年歷史。課題組前期研究發現丹蛭降糖膠囊能夠改善糖尿病患者的多食行為，具有降低體質量，調節血脂，降低BMI 指數等功效[4-6]。db/db 小鼠是是瘦素受體基因（Obese Gene Receptor，OB-R）純合突變小鼠，具有“體質量快速增長，活動量少，高血脂，高血糖，高血壓及肥胖等特點”，是模擬肥胖型2 型糖尿病的高保真動物模型[7]。本研究旨在觀察丹蛭降糖膠囊對db/db 小鼠體質量及攝食量的干預作用及對下丘腦攝食中樞關鍵因子的調節作用進行研究。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗動物均購自江蘇集萃藥康集團，分別購入SPF 級雄性db/db 小鼠18 只及SPF 級雄性db/dm 小鼠9 只，周齡均為5 周，db/db 小鼠體質量在30 ～35 g 之間，db/dm 小鼠體質量在15 ～20 g 之間。動物到達后飼養于安徽醫科大學中心動物房SPF 級動物房層流架，飼養環境維持12 h 晝夜交替，溫度為（22±2）℃，濕度為50%～55%，動物自由攝食飲水，普通飼料喂養，均使用刨花墊料。本研究已通過安徽醫科大學倫理委員會審批（倫理號：LLSC20200932）。

我國是農業大國，對農機設備有很高的要求。隨著農機總量的不斷擴大，新的農機裝備也在不斷涌現，導致我國的農業生產方式逐漸由人畜生產力向機械生產力轉移，基本上擺脫了幾千年的勞動力作業形式，但是，這樣勢必會給整個農機安全監理帶來巨大的壓力和挑戰。

1.2 試劑與耗材

血糖儀、 血糖試紙（Roche； 國械注進20142404948、國械注進20162402313）； Rabbit-Anti-AgRP Antibody（Abcam；ab254558）、Rabbit-Anti-α-MSH antibody （Bioss；bs-1848R）； 小 鼠α-MSH ELISA 試劑盒、小鼠AgRP ELISA 試劑盒、（晶美生物技術有限公司；96T；JM-12489M1、JM-13042M1）；免疫組化二步法試劑盒（中杉金橋；PV6000）；SweScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（Servicebio；G3337-100）；EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司；B618583]；2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal；RK21203），qRT-PCR 儀（ABI；StepOne Plus）。

2 實驗方法

2.1 入組及飼養

見表5。

見圖2、表4。

2.2 檢測方案

然而，目前的文獻多是純粹的飛行器或無人潛艇的路徑規劃問題，缺乏對信息采集結合路徑規劃的研究。飛行器上搭載信息采集設備不僅需要飛行器在飛行過程中規避障礙物，還需要確保信息采集設備能夠采集到相應的數據信息。

2.3 麻醉及采血

飼養結束后在無菌環境下使用0.3%戊巴比妥鈉0.1 ～0.2 mL·10 g-1腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰臥位固定小鼠四肢，常規消毒后經腹中線開腹并開胸，使用1 mL 注射器經右心室直刺入3 mm 見針管回血停止進針，緩慢抽取血液，取血完畢經無菌EP 離心管壁緩慢注入并室溫靜止1 h，后放入離心機經3 500 rpm·5 min-1分離血清，新管-80℃保存備用。

見表6。

2.4 樣本采集

小鼠采血完畢，分離頭頸，剝離頭皮，使用彎頭眼科剪插入頭骨前囟1 ～2 mm，鈍性分離頭骨，取出完整腦組織，石蠟包埋樣本放入10%甲醛固定液，第2 天換液固定1 周，取出腦組織修塊后脫水包埋下丘腦部分；其余小鼠腦組織使用凍存管保存與液氮過夜，第2 天放入-80℃冰箱保存備用。

Xiao課題組設計合成了一種雙光子汞離子探針SPF-TSA(見圖5)。在加入一定濃度的汞離子后，縮硫醛與汞離子作用轉化成醛基，在DMSO∶水=1∶1的溶液中，其檢測限為28 nmol/L。在800 nm波長的雙光子激發下，探針的雙光子截面為248 GM，探針與汞離子反應之后，雙光子截面為686 GM，說明探針與汞離子作用后，具有較好的雙光子性能，將該探針成功應用于雙光子細胞成像。

2.5 觀察指標及檢測方法

2.5.1 HE 染色 蠟塊切片3 μm，常規脫水后入蘇木素染30 s，流水沖洗10 min 反藍，再入伊紅10 s后烘干，中性樹脂封片烘干后光鏡下觀察組織病理學改變。

見表2。

2.5.2 免疫組化 蠟塊切片3 μm，常規脫水后入檸檬酸鹽緩沖液，放入微波爐高火10 min，冷卻5 min，再高火3 min 進行抗原修復，根據組化試劑盒說明書進行，一抗（α-MSH 1:250、AgRP 1:100）4℃過夜，最后用DAB 顯色10 min，自來水沖洗后烘干，中性樹脂封片。選取3 塊不同區域，以平均光密度AOD 作比較，AOD = IOD/Area。數據保留小數點后4 位。

2.5.3 qRT-PCR 提取RNA 后使用試劑盒進行逆轉錄得到樣本cDNA，然后使用試劑盒配制反應物，詳細操作按照說明書進行。qRT-PRC 反應程序為預變性95 ℃3 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s 循環反應，次數為40 次，熔解曲線由機器自設。以Actin 為內參。2-△△CT為結果。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5.4 ELISA 具體方法按照說明書進行，檢測血清α-MSH、AgRP 含量，剝離凍存腦組織下丘腦后使用電子天平稱重，稱量同質量組織檢測下丘腦α-MSH、AgRP蛋白濃度，血清及腦組織樣本稀釋倍數均為5倍。

2.6 統計學方法

使用SPSS 24.0 進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異使用單因素方差分析進行檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。數據可視化采用GraphPad Prism 8 處理，組化定量使用Imgae J 處理。

每日測量每籠盒所剩飼料，以1 周為記錄點進行統計。每周對每只小鼠的體質量測量1 次。

3 結果

3.1 各組體質量周變化情況比較

為了促進喂養工作的科學合理化，在實際執行中，要按照一定標準喂養飼料，保證定時、定量和定位、定質，按照具體的營養需求科學配料，以促進飼料利用效率的提升。還要保證飼料養殖人員技術水平的提升，避免飼料浪費。科學喂養在能夠降低生產成本的條件下，為實際的養殖工作提供更高的發展效益。

表2 各組體質量周變化情況比較（±s ，n = 9） g

表2 各組體質量周變化情況比較（±s ，n = 9） g

注：與db/dm 組比較，### P ＜0.001；與db/db 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

周齡db/dm 組db/db 組DJC 組619.83±0.6533.03±1.03###32.49±1.05 721.16±1.3837.29±1.32###36.26±1.07 821.74±1.4539.80±2.85###37.31±1.81△922.41±1.9742.29±3.36###38.10±1.67△△1022.86±1.7943.80±4.84###39.31±2.38△△1123.29±1.7845.78±6.72###38.80±3.22△△1224.03±2.1347.58±7.80###38.58±3.94△△1324.44±1.9950.54±10.04###36.96±5.02△△△1425.33±1.9852.00±11.32###35.54±6.10△△△1525.90±1.5254.02±12.85###35.36±6.57△△△1626.53±2.0155.57±14.00###34.76±5.74△△△1726.69±1.8656.87±14.19###34.76±5.52△△△1826.99±1.6158.13±14.65###34.70±5.84△△△

3.2 各組攝食量周變化情況比較

見表3。

表3 各組攝食量周變化情況比較（±s ，n = 3） g

表3 各組攝食量周變化情況比較（±s ，n = 3） g

注：與db/dm 組比較，### P ＜0.001；與db/db 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

周齡db/dm 組db/db 組DJC 組756.70±1.40112.70±6.13### 98.33±4.83△△868.00±1.81125.23±2.00### 107.37±11.82△971.23±1.90126.03±6.38### 99.33±5.53△△1074.00±1.30125.10±11.98### 101.43±6.60△1175.43±1.95125.33±8.40### 95.73±9.33△△1273.90±3.60115.63±6.61### 92.30±3.22△△1375.97±2.08124.70±3.40### 96.03±2.37△△△1474.83±2.50119.03±6.99### 102.83±2.87△△△1573.73±0.85119.60±2.05### 96.73±4.78△△△1671.03±1.81121.13±1.50### 96.97±1.14△△△1772.37±1.51125.23±2.29### 97.40±1.59△△△1871.67±1.27117.83±6.02### 95.03±1.48△△△

3.3 各組病理形態學變化情況比較

HE 染色顯示，db/dm 組下丘腦病理改變不明顯，細胞形態完整，間質血管無明顯充血及出血現象；db/db 組可見大量細胞核深染、固縮且空泡化嚴重，膠質細胞增生侵蝕；DJC 組較db/db 組病理改變減輕，可見少量細胞核深染，少量空泡變性。見圖1。

圖1 各組病理形態學顯微圖（HE 染色，400x）

3.4 各組免疫組化及定量比較

除此以外，未來，貨幣政策仍需繼續發力。業內人士表示，從央行三季度貨幣政策執行報告以及各方數據來看，市場流動性相對充裕，但金融機構的風險偏好仍偏低，放貸意愿不足，繼續穩定融資、疏通貨幣政策傳導機制已經并將持續成為下一步政策的重點。宋清輝認為，未來貨幣政策應該重點關注小微企業和“三農”領域等，并通過實施定向降準政策，保持流動性合理充裕。同時，貨幣政策方向應該朝民營企業傾斜，消除“梗阻”同時刺激金融市場對于民企的支持力度。

圖2 各組免疫組化及定量圖（400x）

表4 免疫組化定量數據（±s，n = 3）

表4 免疫組化定量數據（±s，n = 3）

注：與db/dm 組比較，## P ＜0.01；與db/db 組比較，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

項目db/dm 組db/db 組DJC 組α-MSH0.100 2±0.006 20.022 9±0.013 4##0.145 1±0.020 2△△△AgRP0.033 4±0.004 80.048 3±0.000 7##0.035 3±0.002 4△△

3.5 qRT-PCR

小鼠到達后經無菌通道進入SPF動物房檢疫室，經1周適應性飼養后轉移至小鼠專用飼養室層流架。轉入層流架后禁食6 h 候采取尾尖采血快速檢測血糖，db/db 小鼠空腹血糖≥11.1 mmol·L-1時分入db/db 組及DJC 組，db/dm 組全部入組并檢測空腹血糖以作對照。DJC 組按體表面積計算每只灌胃630 mg·kg-1·d-1[8]，db/db 組及db/dm 組按同質量每日灌胃純凈水。按種屬隨機分入飼養籠盒，每籠3 只小鼠。飼養周期為12 周。

表5 各組mRNA 相對表達量數據（±s ，n = 8）

表5 各組mRNA 相對表達量數據（±s ，n = 8）

注： 與db/dm 組比較，### P ＜0.001； 與db/db 組比較，△△△P ＜0.001

項目db/dm 組db/db 組DJC 組α-MSH 1.00±0.310.26±0.08###0.60±0.15△△△AgRP1.01±0.252.87±0.70###1.42±0.41△△△

3.6 ELISA

基于增加資源數量，提高資源質量，改善資源功能的邏輯，推動礦業供給側改革。由煤、鐵等大宗礦產的開采向稀土、鎢、鋰等新興戰略性、高技術礦產資源開采轉變，將共伴生稀土礦、鎢礦等納入總量控制指標管理。推動非煤能源如天然氣、地熱、頁巖氣、煤層氣等相對環保型資源的開發使用，優化資源使用結構。

表6 Elisa 檢測定量數據（±s ）

表6 Elisa 檢測定量數據（±s ）

注：與db/dm 組比較，### P ＜0.001；與db/db 組比較，△△△P ＜0.001

項目例數db/dm 組db/db 組DJC 組血清α-MSH/（μg·L-1）9 8.33±0.35 6.37±0.17### 7.40±0.22△△△血清AgRP/（pg·mL-1）9108.67±4.60182.84±10.39###141.41±8.46△△△下丘腦α-MSH/（μg·L-1）8 8.11±0.36 5.85±0.34### 6.98±0.16△△△下丘腦AgRP/（pg·mL-1）8100.75±4.94175.68±8.27###137.96±7.14△△△

4 討論

在過去30 年里，全球糖尿病患者人數近乎增長了2 倍之多，因糖尿病引起的各種并發癥導致的死亡，也排在人類死亡因素的第9 名[2]。我國糖尿病人群的患病率連年攀升，近年的數據顯示我國糖尿病的患病人群已超過1.5 億人[1]。這不但給患者及患者家屬帶來巨大經濟及生活負擔，也使得我國衛生健康防治壓力急劇增高。

糖尿病作為一種患病率居高不下的疾病，自古以來便被多種書籍所記載?！端貑枴て娌≌摗酚涊d：“帝曰：有病口甘者，病名為何？何以得之？岐伯曰：此五氣之溢也，名曰脾癉。夫五味入口，藏于胃，脾為之行其精氣，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所發也。此人必數食甘美而多肥，肥者令人內熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴?！贝擞浭鲈敿毭枥L了多食導致肥胖，而肥胖又引起脾癉，進而發展為消渴的過程[9]。即不節制的飲食會引起人體肥胖，而肥胖會導致現代醫學所說的糖尿病前期，進而會發展為糖尿病。

中醫學將食欲亢進的病位定于胃，而又與心、肝、脾等臟器相關[10]。DJC 包含太子參、生地黃、牡丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭六種中藥顆粒。藥理學研究表明，澤瀉能夠促進胰島素受體底物1（Insulin Receptor Substrate-1，IRS-1）磷酸化，形成磷酸化的胰島素受體底物1（phospho-IRS1，p-IRS1），從而降低血糖，減輕胰島素抵抗[11]，同時，澤瀉能夠通過削弱游離脂肪酸的作用，從而減少肝細胞內三酰甘油和總膽固醇的沉積[12]，預防肥胖；太子參能夠通過改善2 型糖尿病患者HIF-1α 及SIRT1 的表達，從而減輕胰島素抵抗，減少脂肪沉積，發揮調節血糖及血脂的作用[13]；地黃所含地黃低聚糖能夠降低db/db小鼠體內α-葡萄糖苷酶活性，降低餐后血糖[14]，抑制肝糖異生，減少三酰甘油的生成[15]；菟絲子能夠經JAK-STAT 通路調節機體的糖脂代謝，降低胰島素敏感性[16-17]；水蛭能夠通過抑制脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，Fas）等脂肪合成相關酶發揮作用，從而減少膽固醇和脂肪酸的合成，降低血脂[18]。

肥胖的本質是能量攝入與消耗之間的失衡[19]，過多的食物進入腸道后被分解為葡萄糖，以肝糖原的形式進行存儲，糖酵解生成的磷酸二羥丙酮轉化形成甘油，糖氧化分解生成的乙酰CoA 合成脂肪酸，進而形成脂肪存儲于全身[20]。攝食行為的控制中樞位于下丘腦弓狀核（Arcuate nucleus，ARC），該區域主要含有能夠增強食欲的神經肽Y（Neuropeptide Y，NP-Y）和刺鼠相關肽（Agouti-related peptide，AgRP）以及抑制食欲的促阿片-黑素細胞皮質素原（Pro-opiomelanocortin，POMC）[21]。其中AgRP與POMC 是一對相互拮抗的神經元物質，分別發揮著促進食欲和抑制食欲的作用[22]。脂肪細胞來源的瘦素（Leptin）與其長亞型瘦素受體[23]（leptin receptor long isoform， LepRb）結合后激活Janus 激酶 2（Janus Kinase 2，JAK2），形成磷酸化的Janus激酶 2（phospho-JAK2，p-JAK2），p-JAK2 又進一步激活STAT3，STAT3 的激活會使得IRS-1 磷酸化為p-IRS1，最終抑制刺激食欲的POMC 及其衍生物α-MSH 的生成并刺激增強食欲AgRP 的生成[24]。

例19中作者將“一帶一路”受到歐洲各國的歡迎預設為既成事實，從而關閉了對話空間。從上下文看，例20中的“indeed”既強調了事實本身又透露出一種驚訝和嘲諷的態度。

db/db 小鼠作為一種leptin-R 缺失動物模型，能夠在高保真情況下模擬肥胖癥、2 型糖尿病等疾病的發生發展過程。STAT3 通路作為經典的瘦素通路，上游靶點leptin-R 的缺失導致瘦素無法與受體結合，進而影響下游通路的激活，最終使得STAT3 無法促進POMC 的分泌，進而POMC 衍生物α-MSH 的生成無法得到保證，同時也無法抑制AgRP 的分泌，形成了過多的AgRP，最終導致食欲的增高，并發生瘦素/胰島素抵抗[25-26]。

課題組前期已經在GK 大鼠模型上證明DJC 能夠提高胰島素受體底物IRS1 的表達[27]，也能夠提高SD 大鼠STAT3 的表達并促進其磷酸化[28]。本研究證實了DJC 能夠促進下丘腦α-MSH 的分泌并抑制下丘腦AgRP 的分泌；也證實了db/db 小鼠相較其野生同型對照db/dm 小鼠，下丘腦存在更多的AgRP 蛋白且存在更少的α-MSH 蛋白，而這種趨勢被DJC 所改善；同時，在mRNA 層面也觀察到了相同的趨勢，即db/db 小鼠較db/dm 小鼠含有更多的AgRP mRNA，更少的α-MSH mRNA，這種趨勢同樣被DJC 所改善；使用免疫組化方法進行的相關抗原定量得到了相同結果。以上這些結果與db/dm 組、db/db 組及DJC 組所表現出的體重趨勢，進食趨勢相符合。由此，我們認為DJC 能夠通過促進α-MSH的表達并抑制AgRP 的表達來改善小鼠進食行為，減輕體質量，從而改善小鼠的肥胖狀態，進而降低糖尿病的發生風險。