ZWINT和CDK2在乳腺癌中的表達及與臨床病理特征的關系和診斷價值

張芳芳?韓一菲?王靖楠?鄒炎?應莉?李娜

【摘要】 目的 探討ZW10結合因子（ZWINT）和細胞周期蛋白依賴激酶2（CDK2）的相關性及其在乳腺癌病理診斷中的價值。方法 通過GEPIA數據庫分析ZWINT 在乳腺癌和正常乳腺組織之間的表達差異，以及在乳腺癌中ZWINT和CDK2表達的相關性。通過Kaplan-Meier Plotter數據庫預測ZWINT的表達與乳腺癌患者預后的關系。收集84例乳腺癌及其配對癌旁組織石蠟包埋病理標本和20例乳腺癌及其配對的癌旁組織新鮮標本，通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和免疫組織化學檢測乳腺癌和癌旁正常乳腺組織中ZWINT和CDK2 的mRNA及蛋白的表達，分析ZWINT和CDK2與乳腺癌臨床病理特征的關系，并采用關聯分析分析ZWINT和CDK2的相關性；采用受試者操作特征（ROC）曲線評估ZWINT和CDK2在乳腺癌病理診斷中的價值。結果 數據庫分析結果顯示， ZWINT在乳腺癌組織中高表達，在乳腺癌中ZWINT和CDK2的表達呈正相關（rs = 0.600，P < 0.001），ZWINT的表達與乳腺癌患者的預后相關（P均< 0.05）。84例病例檢測結果顯示，在乳腺癌組織中ZWINT和CDK2 的mRNA及蛋白的表達均高于癌旁組織（P均< 0.05），并且其高表達均與腫瘤大小、分期和淋巴結轉移相關（P均< 0.05）。關聯分析結果顯示，對稱測量下的Φ、Cramer V系數檢驗的關聯程度相同，為0.322（P = 0.003），而列聯系數為0.306（P = 0.003），ZWINT蛋白和CDK2蛋白表達密切相關。ZWINT和CDK2的ROC曲線的曲線下面積分別為0.886和0.818，對乳腺癌均具有較高的診斷價值。結論 ZWINT和CDK2與乳腺癌的發生發展及預后相關，檢測ZWINT和CDK2有助于乳腺癌的病理診斷。

【關鍵詞】 乳腺癌；ZW10結合因子；細胞周期蛋白依賴激酶2；臨床病理特征；診斷價值

Relationship between ZWINT and CDK2 expression and clinicopathological features and their diagnostic values in breast cancer Zhang Fangfang△， Han Yifei， Wang Jingnan， Zou Yan， Ying Li， Li Na.△The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College， Xinxiang 453003， China

Corresponding author， Li Na， E-mail： lina@xxmu.edu.cn

【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of Zeste White 10 interactor （ZWINT） and Cyclin-dependent kinase 2 （CDK2） and clinicopathological features in breast cancer， and evaluate their pathological diagnostic values in breast cancer. Methods GEPIA database was utilized to analyze the difference in the expression of ZWINT between breast cancer and normal breast tissues and assess the correlation between ZWINT and CDK2 expression in breast cancer. Kaplan-Meier Plotter database was employed to predict the relationship between ZWINT expression and clinical prognosis of breast cancer patients. Paraffin-embedded pathological specimens of 84 cases of breast cancer and paired paracancerous tissues and fresh specimens of 20 cases of breast cancer and paired paracancerous tissues were collected. Quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-qPCR） and immunohistochemical staining were used to detect the expression levels of ZWINT and CDK2 mRNA and protein in breast cancer and paracancerous normal breast tissues， to analyze the relationship between ZWINT and CDK2 expression levels and clinicopathological features of breast cancer. Association analysis was used to analyze the correlation between ZWINT and CDK2. Receiver operating characteristic （ROC） curve was delineated to evaluate the values of ZWINT and CDK2 in the pathological diagnosis of breast cancer. Results The results of database analysis showed that ZWINT was highly expressed in breast cancer tissues and there was a positive correlation between the expression of ZWINT and CDK2 in breast cancer （rs = 0.600，P < 0.001）. The expression of ZWINT was closely correlated with clinical prognosis of breast cancer patients （all P < 0.05）. The test results of 84 cases showed that the expression

levels of ZWINT and CDK2 mRNA and protein in breast cancer tissues were higher than those in para-carcinoma tissues （both P < 0.05）， and high expression was closely correlated with tumor size， tumor stage and lymph node metastasis （all P < 0.05）. Association analysis revealed that the degree of association of Φ and Cramer V coefficient test under symmetric measurements was the same as 0.322 （P = 0.003）， while the column linkage number was 0.306 （P = 0.003）. The expression levels of ZWINT and CDK2 proteins were closely correlated. The areas under the ROC curve of ZWINT and CDK2 were 0.886 and 0.818， which yielded high diagnostic values for breast cancer. Conclusions ZWINT and CDK2 expression levels are closely correlated the occurrence， development and prognosis of breast cancer. Detection of ZWINT and CDK2 contributes to pathological diagnosis of breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； ZWINT； CDK2； Clinicopathological feature； Diagnostic value

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，2020年全球乳腺癌新發病例高達226萬例，已成為女性排名第一的惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的健康［1-2］。

因此，尋找乳腺癌診斷和預后評估的基因生物學標志物具有重要的臨床價值。ZW10結合因子（ZWINT） 是有絲分裂紡錘體檢查點的重要組成部分，在染色體有絲分裂精準分離中發揮著重要作用，參與細胞周期、細胞分裂和信號轉導等信號通路的調控［3-4］。研究顯示，ZWINT在多種人類腫瘤中高表達，并且與患者臨床預后密切相關［5］。細胞周期蛋白依賴激酶2（CDK2）是一種細胞周期依賴性激酶（CDK），參與調控細胞周期進展、信號轉導、DNA和RNA代謝等生物學過程［6］。研究表明，CDK2高表達會促進腫瘤的異常增殖［7］。ZWINT和CDK2在乳腺癌臨床組織樣本中的表達與臨床病理特征的關系以及兩者的相關性如何，ZWINT和CDK2在原發性乳腺癌的病理診斷與預后中是否有應用價值，筆者均未見文獻報道，本研究就此進行了探討，為將兩者應用于乳腺癌的診療提供新的依據。

對象與方法

一、研究對象

1.標本來源

收集新鄉醫學院第三附屬醫院2020年1月至2022年12月接受手術切除且經病理學檢查確診的84例乳腺浸潤性癌及與其配對的84例癌旁組織（距癌灶邊緣5 cm）的石蠟包埋病理標本，所有患者術前均未接受化學治療、放射治療或免疫治療。病理標本來源病例資料：均為女性，年齡33～88歲、中位數55歲；腫瘤直徑≤2 cm 22例，>2 cm 62例；參照2019年版WHO乳腺癌組織病理分級分類法，Ⅰ級26例、Ⅱ級35例、Ⅲ級23例；參照2019年版TNM臨床分期標準，TNM Ⅰ期20例、Ⅱ期14例、Ⅲ期50例；有腋窩淋巴結轉移56例，無腋窩淋巴結轉移28例。收集2022年1月至12月接受手術切除且經病理學檢查確診的20例乳腺浸潤性癌及其配對癌旁組織（距癌灶邊緣5 cm）新鮮標本，所有病例均由2名以上病理醫師確診。本研究方案經新鄉醫學院第三附屬醫院醫學研究倫理委員會批準（批件號：K2023-041-01），所有參與者知情同意。

2.生物信息學數據

納入GEPIA數據庫中1 085例乳腺癌患者和291例正常乳腺者的乳腺組織，分析ZWINT的表達差異及其與CKD2的相關性。納入Kaplan-Meier Plotter數據庫中4 929例乳腺癌患者生存預后的數據，分析ZWINT與乳腺癌患者預后的相關性。

二、主要試劑

ZWINT兔抗人多克隆抗體（美國Santa公司），CDK2兔抗人多克隆抗體（美國Proteintech公司），二抗及二氨基聯苯胺（DAB）（福州邁新生物技術開發有限公司），ZWINT和CDK2引物（上海生物工程有限公司）。

三、實驗方法

1.生物信息學分析

在GEPIA數據庫中分析ZWINT mRNA在乳腺癌和正常乳腺組織之間的表達差異，預測乳腺癌中ZWINT和CDK2 mRNA表達之間的相關性；通過Kaplan-Meier Plotter臨床芯片數據庫在線分析ZWINT的表達與乳腺癌患者預后的關系。

2.免疫組織化學（免疫組化）染色法檢測

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（SP法），ZWINT和CDK2一抗稀釋比例分別為1∶200和1∶100，實驗步驟按試劑盒說明書進行，用二氨基聯苯胺顯色、蘇木精復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。ZWINT和CDK2免疫組化評分標準：在雙盲條件下由2名病理科醫師閱片，當免疫組化結果判斷不一致時，共同討論決定。ZWINT和CDK2陽性定位均位于細胞核，采用半定量法進行評分，根據染色強度和陽性細胞百分比對結果進行判讀，染色強度評分如下：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比評分如下：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。綜合評分結果判定：細胞染色強度和陽性細胞百分比得分相乘，積分<4為ZWINT和CDK2低表達（低表達組），積分≥4為 ZWINT和CDK2高表達（高表達組）。

3.實時熒光定量PCR檢測（RT-qPCR）

使用Trizol試劑盒按照說明書提取20例乳腺癌和配對癌旁組織中的總RNA，測定RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA；使用10 μL體系按照SYBR Green I Master Mix說明書以β-actin為內參進行標準RT-qPCR。引物序列如下：

ZWINT-F：AACTCCGGGAAGCCTTTGAG，ZWINT-R：TTCTGGACTGCTCTGCGTTT；CDK2-F：ATGCCTGATTACAAGCCAAGTTTCC，CDK2-R：ACAAGCTCCGTCCATCTTCATCC；β-actin-F：CCTGGCACCCAGCACAAT，β-actin-R：GGGCCGGACTCGTCATAC。使用2-ΔΔCT法計算ZWINT和CDK2 mRNA的相對表達量。

四、統計學處理

采用SPSS 26.0處理數據，免疫組化表達計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ 2檢驗，相關性采用分類變量的關聯分析，非正態分布的變量數據使用Spearman相關性分析。應用GraphPad Prism 9.5進行圖形繪制，RT-qPCR檢測數據采用計量資料，以表示，2組間比較采用配對t檢驗。P < 0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、GEPIA數據庫中ZWINT在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達差異及其在乳腺癌中的表達與CDK2的相關性

在GEPIA數據庫中進行檢索及分析，共檢索到1 085例乳腺癌組織和291例正常乳腺組織，結果顯示，乳腺癌組織中ZWINT表達量高于正常乳腺組織（P < 0.05）；ZWINT與CDK2之間存在相關性（rs=0.600，P < 0.001），見圖1。

二、Kaplan-Meier Plotter數據庫中ZWINT的表達與乳腺癌患者預后的關系

通過Kaplan-Meier Plotter數據庫中的乳腺癌（mRNA）數據集進行生存分析，結果顯示，在所有乳腺癌患者中ZWINT高表達組患者預后較差，其總生存期（OS，HR=1.64，P < 0.001）、無復發生存期（RFS，HR=1.87，P < 0.001）、無遠處轉移生存期（DMFS，HR=1.90，P < 0.001）和進展后生存期（PPS，HR=1.41，P = 0.015）均低于ZWINT低表達組患者，見圖2。

三、ZWINT和CDK2的mRNA和蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達水平

本院20例乳腺癌組織和癌旁組織的RT-qPCR檢測結果顯示，在乳腺癌組織中ZWINT mRNA和CDK2 mRNA的相對表達水平均高于癌旁組織（P均< 0.05），見圖3A。84例乳腺癌組織和癌旁組織的免疫組化檢測結果顯示，在乳腺癌組織中ZWINT蛋白的高表達率為85.7%（72/84），高于癌旁組織中的高表達率29.8%（25/84），在乳腺癌組織中CDK2蛋白的高表達率為81.0%（68/84），亦高于癌旁組織中的高表達率33.3%（28/84），2組間比較差異均有統計學意義（P均< 0.05），見圖3B。

四、ZWINT和CDK2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關系

本院84例乳腺癌組織免疫組化檢測結果和臨床病理資料分析結果顯示，ZWINT和CDK2蛋白高表達組均與腫瘤大小、分期和淋巴結轉移密切相關，比較差異有統計學意義（P均< 0.05）；兩者蛋白的表達與乳腺癌的分級無關，比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表1。

五、乳腺癌組織中ZWINT和CDK2蛋白表達的相關性分析

在72例ZWINT蛋白高表達的乳腺癌組織標本中，CDK2蛋白高表達的標本有62例（86.1 %）；在12例ZWINT蛋白低表達的標本中，CDK2蛋白低表達的標本有6例（50.0 %）。由對稱測量下的Φ、Cramer V系數檢驗結果顯示，2種檢測方法的關聯程度相同，均為0.322（P = 0.003），而列聯系數為0.306（P = 0.003），ZWINT蛋白和CDK2蛋白表達密切相關，見表2。

六、ZWINT蛋白和CDK2蛋白表達的受試者操作特征（ROC）曲線

通過統計分析本院84例乳腺癌組織的免疫組化檢測結果，制作ZWINT蛋白和CDK2蛋白在乳腺癌組織中的ROC曲線，預測ZWINT和CDK2在乳腺癌中的診斷價值。結果顯示，ZWINT蛋白的曲線下面積（AUC）為0.886（95%CI 0.837～0.936），敏感度為76.2%，特異度為88.1%；CDK2蛋白的AUC為0.818（95%CI 0.755～0.881），敏感度為71.4%，特異度為77.4%，見圖4。ZWINT蛋白和CDK2蛋白表達在診斷乳腺癌能力方面均有較高價值。

討 論

中國乳腺癌的發病率和病死率逐年上升，高浸潤、高轉移和高復發是乳腺癌患者死亡的主要原因，因此尋找乳腺癌的發病機制至關重要［1， 8］。

ZWINT是調控著絲粒分裂的重要蛋白，主要由278個氨基酸組成，主要功能是監管調控細胞周期和促進細胞增殖的作用，能夠促進染色體運動和有絲分裂的進程［9］。當ZWINT缺失時會促進染色體異常分離和降低染色體穩定性，ZWINT高表達與多種腫瘤發生發展和患者預后密切相關［10］。有研究顯示，ZWINT是一個促癌基因，在大多數腫瘤中高表達，可以調控腫瘤細胞的生長與增殖，并且ZWINT高表達的患者預后更差［11］。ZWINT在肺癌組織中的表達上調，敲低ZWINT可以降低肺癌細胞的增殖和侵襲能力，并且與肺癌患者的預后密切相關［12］。ZWINT在胰腺癌組織中高表達，可通過激活核因子κB信號通路或P53/P21信號通路促進胰腺癌細胞的增殖、侵襲和存活［13］。ZWINT mRNA和蛋白在肝細胞癌組織和細胞系中的表達也上調，ZWINT高表達與患者臨床病理特征、生存期和較高的腫瘤復發率均密切相關，通過細胞分裂和免疫抑制調控肝細胞癌的進展，并且ZWINT的表達促進了多種細胞周期蛋白的表達［14］。有報道顯示，ZWINT mRNA和蛋白質水平在膠質母細胞瘤中均過表達，敲除ZWINT能有效抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤在體內的生長，因此ZWINT可成為膠質母細胞瘤新的潛在治療性標志物［15］。本研究通過多個數據庫分析并且通過RT-qPCR和免疫組化檢測結果進行了驗證，ZWINT的mRNA和蛋白在乳腺癌中的表達高于癌旁正常乳腺組織，并且其蛋白高表達與腫瘤大小、分期和淋巴結轉移密切相關。預后分析發現，ZWINT的表達與乳腺癌患者的各種生存期密切相關，這與文獻報道其他腫瘤的結果一致，提示ZWINT可作為乳腺癌發生、發展和預后評估的標志物之一。

CDK2是CDK家族重要一員，主要由298個氨基酸組成，是控制細胞由G0/G1期向S期過渡，維持S期正常進展的重要激酶，當CDK2與細胞周期蛋白結合時可調控細胞周期的進展［16］。研究顯示，CDK2蛋白在多種腫瘤中過表達，如膀胱癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌［17］。CDK2是多種致癌信號通路的關鍵調節劑，其高表達促進了腫瘤的發生發展和異常增殖［6-7］。本研究顯示，CDK2的mRNA和蛋白在乳腺癌組織中的表達高于癌旁正常乳腺組織，并且其高表達與腫瘤大小、分期和淋巴結轉移均密切相關，與上述研究結果一致。表明CDK2可加速S期進程，使細胞過度增殖，在乳腺癌的發生發展中發揮一定作用。關聯分析顯示，ZWINT和CDK2表達密切相關，并且ZWINT和CDK2蛋白表達對乳腺癌診斷的敏感度和特異度均較高，在診斷乳腺癌方面均有較高價值。由此推測，ZWINT的高表達，可能通過調節CDK2等細胞周期相關因子的表達而調節細胞周期，進而促進乳腺癌的增殖。然而由于腫瘤發病機制復雜，乳腺癌中ZWINT異常高表達的分子機制及調控腫瘤發生發展的分子機制仍未明確。因此，后續還需要不斷完善實驗設計，擴大樣本量等對ZWINT進行突破性的研究，旨在為腫瘤的治療提供新的方向和思路，為臨床提供更為可靠的參考。

綜上所述，ZWINT和CDK2的異常表達與乳腺癌的發生和發展密切相關，兩者可能存在相關調控機制，檢測上述蛋白有助于乳腺癌的病理診斷。本研究不但表明檢測乳腺癌中的ZWINT和CDK2有助于判斷乳腺癌的發生和發展，還為乳腺癌發病機制的探討提供了一定的參考依據。

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（收稿日期：2023-09-25）

（本文編輯：洪悅民）