腫瘤相關(guān)糖類抗原Tn在子宮內(nèi)膜癌中異常表達(dá)及其生物學(xué)意義

茹曉莉,曹廣明,劉崇東

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 婦產(chǎn)科,北京100020)

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年增高并有年輕化趨勢,臨床治愈率低[1-3]。目前對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未闡明;實(shí)現(xiàn)早期診斷和有效預(yù)防子宮內(nèi)膜癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是提高其預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié),這要求我們必須從更深層面研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

黏蛋白型O-聚糖(Mucin-type O-glycans)是指由多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAc-Ts)催化合成的一類糖復(fù)合物,也是正常子宮內(nèi)膜表面覆蓋的黏液層的主要成分,其功能主要是修飾糖蛋白發(fā)揮重要的生理性保護(hù)作用[4-5]。在腫瘤中常伴隨黏蛋白型O-聚糖結(jié)構(gòu)及數(shù)量發(fā)生異常改變,形成不成熟、截短的O-聚糖結(jié)構(gòu),其中最重要的就是腫瘤相關(guān)糖類抗原-Tn的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜癌病人中常檢測到Tn抗原,表明存在異常O-型糖基化,但目前尚不清楚Tn抗原介導(dǎo)的異常O-型糖基化在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的具體生物學(xué)作用。本研究首先采用免疫組化技術(shù)檢測Tn抗原在子宮內(nèi)膜癌病人組織、子宮內(nèi)膜非典型增生組織和正常人子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)狀況;然后采用CRISPR/Cas9技術(shù)特異性敲除兩株人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1B的Cosmc基因,以誘導(dǎo)Tn抗原表達(dá),進(jìn)而探討Tn抗原對子宮內(nèi)膜癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床病理標(biāo)本

收集2015年5月至2022年9月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科就診而診斷為子宮內(nèi)膜癌的患者手術(shù)后石蠟組織,一共168例;所有患者術(shù)前未接受過放療或化療;所有腫瘤標(biāo)本均經(jīng)病理鑒定證實(shí)。另外收集正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本12例,非典型增生子宮內(nèi)膜組織25例。

1.2 細(xì)胞系及試劑

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(Ishikawa和HEC-1B)購自美國ATCC;人胚胎腎HEK293T細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院惠贈;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素混合液、嘌呤霉素等購自美國Gibco公司;Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司;LentiCRISPv2、psPAX2和pMD2G質(zhì)粒購自美國Addgene公司;Transwell小室購自美國Corning公司;小鼠抗Tn IgM單克隆抗體購自美國GeneTex公司,小鼠IgM Isotype抗體購自美國Santa Cruz公司;鼠抗人Cosmc、鼠抗人E-cadherin、兔抗人N-cadherin、Vimentin、GAPDH等抗體均購自美國CST公司;超敏ECL檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1免疫組化染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、沖洗,進(jìn)行抗原修復(fù)和阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后,分別加入小鼠抗人Tn IgM一抗(20 μg/mL)和羊抗小鼠IgM二抗(5 μg/mL)進(jìn)行免疫組化反應(yīng),最后PBS清洗,DAB 顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。最后在光鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集和結(jié)果判讀。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 使用含有10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,在37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至75%以上進(jìn)行傳代處理。與此同時(shí),我們使用CRISPR/Cas9-sgRNA設(shè)計(jì)工具,設(shè)計(jì)一對靶向Cosmc基因的sgRNA(single guide RNA),由上海生工生物工程有限公司合成,其序列如下:F:5′-CACCGTGTGCTTTGATCACTATGCT3′;R:5′AAACAGCATAGTGATCAAACACAC-3′。將退火后形成的雙鏈sgRNA產(chǎn)物和經(jīng)酶切過的LentiCRISPRv2質(zhì)粒連接,并利用Lipofectamine 3000將含有Cosmc sgRNA的重組質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒分別與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞,制備慢病毒溶液;然后以慢病毒溶液加入預(yù)先培養(yǎng)的細(xì)胞中,經(jīng)嘌呤霉素篩選至少一周,最后得到Cosmc敲除細(xì)胞。

1.3.3流式細(xì)胞技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的Tn抗原表達(dá) 取對數(shù)生長期的Cosmc敲除組和對照組細(xì)胞消化并制成單細(xì)胞懸液,用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞,然后加入小鼠抗Tn IgM單克隆抗體(10 μg /mL)、同時(shí)設(shè)置空白對照組和同型對照組(10 μg /mL小鼠IgM Isotype抗體),將抗體與細(xì)胞懸液輕柔混勻,在4℃孵育2 h;然后用PBS清洗細(xì)胞3次,加入PE標(biāo)記的羊抗小鼠IgM二抗,在避光條件下置于4℃孵育1 h。最后以PBS清洗細(xì)胞后使用流式細(xì)胞儀(Canto Ⅱ,BD Bioscience)檢測Cosmc敲除組和對照組細(xì)胞的Tn抗原表達(dá)情況,分別標(biāo)記為Tn+、Tn-細(xì)胞。

1.3.4Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實(shí)驗(yàn):取對數(shù)生長期的Tn+、Tn-細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化、中和、離心去除培養(yǎng)基后,再用無血清DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,然后將200 μL細(xì)胞分別接種在Transwell上室(1×106個/室),下室加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,置于37℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;取出小室,去除培養(yǎng)基,用PBS清洗小室2～3次,然后用無水乙醇固定30 min,PBS清洗之后再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞,PBS清洗殘余細(xì)胞后置于顯微鏡下觀察。侵襲實(shí)驗(yàn)是在遷移實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,向小室內(nèi)預(yù)鋪一層按1∶8比例稀釋的Matrigel膠,置于37℃孵箱內(nèi)凝固至少6 h,然后以相同的細(xì)胞數(shù)量和操作方式檢測細(xì)胞侵襲能力。

1.3.5Western blot法檢測Tn抗原對腫瘤細(xì)胞EMT信號通路的影響

分別收集對數(shù)生長期的Tn+、Tn-細(xì)胞,加入含有1 mM蛋白酶抑制劑和1 mM PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解,在4℃高速離心后分離上清液并采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量;取40 μg/孔蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,然后分別加入下列抗體:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH,在4℃孵育過夜(抗體稀釋比例為1∶1000)。將膜以TBST漂洗3次后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗在室溫下孵育1 h(二抗稀釋比例為1∶8000);再次用TBST漂洗后,使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色,凝膠成像分析系統(tǒng)掃描圖像,分析蛋白條帶灰度值,以GADPH作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tn抗原在子宮內(nèi)膜癌病人中高表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示,在正常人子宮內(nèi)膜組織中未檢測到Tn抗原(0/12),在不典型增生子宮內(nèi)膜組織中檢測到Tn抗原呈低表達(dá),陽性率為20%(5/25);而在子宮內(nèi)膜癌病人組織中Tn抗原呈高表達(dá),陽性率為73%(123/168),明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織及非典型增生子宮內(nèi)膜組織;Tn抗原陽性染色主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中,并有向管腔彌散表達(dá)的現(xiàn)象。

2.2 靶向敲除腫瘤細(xì)胞Cosmc可誘導(dǎo)Tn抗原異常表達(dá)

本研究中我們采用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除兩株人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的Cosmc基因以誘導(dǎo)Tn抗原表達(dá);我們首先利用Western blot法檢測Cosmc的表達(dá)水平,如圖2A顯示:與對照組相比,敲除組細(xì)胞的Cosmc表達(dá)水平明顯下降,證實(shí)Cosmc被有效敲除。隨后流式細(xì)胞技術(shù)檢測顯示,對照組細(xì)胞未檢測到Tn抗原表達(dá),而Cosmc敲除組細(xì)胞大量表達(dá)Tn抗原;這個結(jié)果證實(shí)了Cosmc敲除能直接誘導(dǎo)Tn抗原的異常表達(dá)(圖2B)。

圖2 Western blot法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Cosmc的腫瘤細(xì)胞的Cosmc和Tn抗原表達(dá)

2.3 Tn抗原異常表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力

我們利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測了Tn抗原表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞中,Tn抗原陽性表達(dá)均能顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力,這個結(jié)果說明Tn抗原介導(dǎo)的異常O-型糖基化能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為(圖3)。

圖3 Transwell法檢測Tn抗原對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

2.4 Tn抗原顯著激活了EMT信號通路

我們進(jìn)一步檢測Tn+和Tn-細(xì)胞的EMT信號通路相關(guān)分子以探討Tn抗原生物學(xué)作用的分子機(jī)制。Western blot結(jié)果顯示:在Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞中,與Tn-細(xì)胞相比,Tn+細(xì)胞的上皮相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)水平明顯下調(diào),而間質(zhì)相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平則明顯升高(圖4)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Tn抗原異常表達(dá)能激活EMT信號通路,這可能是Tn抗原介導(dǎo)的異常O-型糖基化促癌作用的分子機(jī)制。

圖4 Western blot法檢測Tn抗原對腫瘤細(xì)胞EMT信號通路的影響作用

3 討論

糖基化反應(yīng)是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,不僅增加了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性,而且對蛋白質(zhì)的生物、物理及功能特性均具有重要調(diào)控作用。O-聚糖(O-glycans)介導(dǎo)的糖基化反應(yīng)是蛋白質(zhì)糖基化修飾的主要形式,對體內(nèi)多數(shù)蛋白質(zhì)特別是跨膜蛋白和分泌型蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都有重要影響,參與和調(diào)控許多生理病理過程[4-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞癌變過程中常伴有O-型糖基化異常反應(yīng),表現(xiàn)為O-聚糖結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生異常,導(dǎo)致腫瘤相關(guān)糖類抗原-Tn呈現(xiàn)陽性表達(dá)。Tn抗原是指N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)與肽鏈上的絲氨酸和蘇氨酸殘基以O(shè)-連接的方式共價(jià)連接形成的糖基結(jié)構(gòu),是一種殘缺的O-聚糖結(jié)構(gòu),也是O-型糖基化異常反應(yīng)的標(biāo)志物[6-7]。生理狀態(tài)下Tn抗原在相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下被催化合成復(fù)雜完整的O-聚糖,因此在正常細(xì)胞/組織中不表達(dá);而Tn抗原一旦表達(dá)陽性,則表明O-聚糖鏈合成障礙,糖基化修飾反應(yīng)異常。大量研究顯示,在結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等上皮來源性腫瘤中能檢測到高表達(dá)的Tn抗原,并且與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有相關(guān)性,因此Tn抗原常作為腫瘤相關(guān)糖類抗原(Tumor Associated Carbohydrate Antigen,TACA)用于此類腫瘤的檢測[8-10]。但Tn抗原在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況及其生物學(xué)作用目前尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)中,我們首先采用免疫組化染色技術(shù)檢測了Tn抗原在正常子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:Tn抗原在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織及非典型增生子宮內(nèi)膜組織;Tn抗原在非典型增生子宮內(nèi)膜組織中有一定陽性率(20%),但Tn抗原在正常子宮內(nèi)膜組織中未見表達(dá)。Tn抗原陽性表明在細(xì)胞癌變中存在異常O-型糖基化反應(yīng),但其是否存在直接的促癌效應(yīng)尚需深入探討。

Cosmc是T合酶的分子伴侶,在O-型糖基化反應(yīng)中起著不可或缺的重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Cosmc功能異常如基因突變、缺失和高甲基化等,都可以導(dǎo)致T合酶功能失活,致使糖基化修飾過程發(fā)生障礙,最后誘導(dǎo)Tn抗原異常表達(dá)[10-11]。因此,Cosmc分子功能異常是Tn抗原表達(dá)的重要機(jī)制。基于此,本研究應(yīng)用基因編輯技術(shù)特異性敲除Cosmc基因以制備Tn抗原陽性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系,然后探討Tn抗原對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響作用。由于人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(Ishikawa、HEC-1B)并不表達(dá)Tn抗原,我們采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除這兩株細(xì)胞的Cosmc,發(fā)現(xiàn)確實(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)大量Tn抗原;然后通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力,發(fā)現(xiàn)Tn抗原陽性表達(dá)的兩株細(xì)胞均顯著促進(jìn)了遷移和侵襲等惡性表型,這一結(jié)果證實(shí)Tn抗原介導(dǎo)的異常O-型糖基化能增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌的惡性程度。

研究表明,EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition)是上皮來源性腫瘤獲得侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的重要生物學(xué)過程,在腫瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[12]。鑒于我們觀察到Tn抗原明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的遷移和侵襲,我們擬探索Tn抗原是否通過EMT進(jìn)行分子層面的調(diào)控。研究結(jié)果顯示,與對照組Tn-細(xì)胞相比,Tn+細(xì)胞的上皮類分子標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平明顯下調(diào),而間質(zhì)類分子標(biāo)志物(Vimentin和N-cadherin)的表達(dá)水平則顯著升高,表明Tn抗原可激活EMT信號通路,這可能是其調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制。

綜上所述,Tn抗原在子宮內(nèi)膜癌病人中異常高表達(dá),可能參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),Tn抗原通過激活EMT相關(guān)信號通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究為深入探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制和干預(yù)靶點(diǎn)等開辟了新的視角。