miR-101-3p與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性的關系研究

崔伯陽,尺寶進,張赫巖,劉任功,劉 鵬,高 祥

(1.佳木斯大學,黑龍江 佳木斯150000;2.佳木斯大學附屬第一醫院 泌尿外科,黑龍江 佳木斯150000;3.齊齊哈爾市第一醫院南院 泌尿外科,黑龍江 齊齊哈爾161000)

膀胱癌是起源于膀胱的惡性腫瘤,占我國泌尿生殖系腫瘤發病率的第一位,膀胱癌的病因復雜,目前對于膀胱癌發生發展機制的研究十分有限[1-2]。miR-101-3p能調節細胞的多種生物學活動,在腫瘤的生長、增殖、遷移、侵襲以及細胞凋亡進程中參與眾多調控機制,具有抑癌的生物學作用[3]。基于此,本文著重討論miR-101-3p同膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性的關系,意在擴展膀胱癌的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 人膀胱癌細胞株(T24),購于上海弘順生物科技有限公司。

1.1.2實驗試劑 DMEM培養基,購于上海慧穎生物科技有限公司;胰蛋白酶(0.25%)、胎牛血清(10%)、CCK-8試劑,購于上海源葉生物科技有限公司;qPCR檢測試劑,購于北京擎科生物科技有限公司;培養箱,購于上海新苗醫療器械有限公司;酶標儀購于山東恒美電子科技有限公司;顯微鏡購于鄭州卓泰檢測設備有限公司;Matrigel購于北京索萊寶科技有限公司;多聚甲醛溶液(4%),結晶紫染料,購于上海滬震實業有限公司;Transwell小室,購于北京優尼康生物科技有限公司;順鉑購于云南個舊生物藥業有限公司;鼠抗人CDK4抗體、兔抗人Akt抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體,購于美國Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將人膀胱癌細胞株置于細胞培養基內,培養基設置溫度為37℃,含5%CO2,當細胞至80%融合度時,使用胰蛋白酶(0.25%)對細胞行消化處理(30s),添加含胎牛血清(10%)的細胞培養液,用于中和胰酶作用,同時依1:3傳代。更換培養基時間為1天,取處于對數生長期的細胞用于進一步實驗。

1.2.2細胞轉染 將呈對數生長的細胞,采用胰酶配置為單細胞懸液,取適量溶液接種于培養皿上,并置于培養箱內過夜,處理完成的細胞分為對照組、上調miR-101-3p組、下調miR-101-3p組。對照組不做處理,其余兩組轉入超凈操作臺,加入Lipofectaminc2000,將其稀釋至3%,混合均勻,室溫孵育5 min,其中上、下調miR-101-3p組分別轉染miR-101-3p mimics、miR-101-3p inhibitor,混合均勻,室溫孵育5 min。將其轉入培養皿內,放入培養箱,24 h后更換培養液,繼續培養,進行后續分析實驗。采用qRT-PCR實驗表明上、下調miR-101-3p組miR-101-3p表達較對照組,分別升高、降低,則表明轉染成功,本實驗重復3次。

1.2.3CCK-8實驗 將處理完成的膀胱癌細胞分別接種于96孔板(密度為2×103/ml),并設立3個復孔,同時額外設立陰性對照孔。首先饑餓細胞(即采用無血清培養基來培養)12 h,而后分別于處理后0 h、24 h、48 h、72 h對每個孔添加10 μl CCK-8(溶液,之后放進培養箱孵育(3 h),然后取出,使用酶標儀,調零陰性對照孔,參數設置完成后測量其在450 nm的吸光度,本實驗重復3次。

1.2.4劃痕實驗 將膀胱癌細胞及轉染組接種于6孔板,采用200 μl于6孔板背部劃線進行垂直劃痕,每孔間隔0.5～1 cm劃一條,共劃3條橫線,使用無血清培養基繼續對細胞進行培養,同時添加絲裂霉素抑制細胞分化。后將孔板放入培養箱(5%CO2、37℃)培養72 h,對劃痕愈合情況使用顯微鏡進行觀察,并依據分組,分別對培養24 h后的情況進行拍照,本實驗重復3次。

1.2.5Transwell實驗 利用Transwell實驗來對細胞的侵襲能力進行評定。先于Transwell小室上方,鋪蓋一層Matrigel,之后在小室上方,每個孔內接種約20000個細胞,添加100μl無血清培養基,同時于下層添加800 μl胎牛血清培養基,培養24 h,隨后使用PBS對上層細胞進行洗滌2次,下層細胞使用4%多聚甲醛溶液進行固定(20 min),隨后,利用0.4%的結晶紫染料對細胞進行染色(10 min)。于顯微鏡下隨機選擇5個視野進行計數觀察,本實驗重復3次。

1.2.6順鉑敏感性檢測 將膀胱癌細胞接種于孔板內,5×103/孔,置入培養基內,孵育過夜,通過0.5～1.5 μmol/L(梯度為0.1 μmol/L)順鉑培養基,培養48 h,后加入MTT試劑培養(4 h),吸取培養液,添加順鉑(100 μl),使用酶標儀測取570 nm波長隔空A值,繪制細胞活力-順鉑濃度曲線,依照曲線測定三組膀胱癌細胞的順鉑半數有效濃度,本實驗重復3次。

1.2.7相關蛋白檢測 使用Western-blot法檢測CDK4、Akt、ICAM-1、MMP-9蛋白的表達量。取膀胱癌細胞,采用RIPA裂解液,從處理后的勻漿內,提取蛋白,用BCA法對蛋白濃度進行測定。通過SDS-PAGE電泳分離后,轉至PVDF膜,并將其浸泡于脫脂牛奶中,室溫密封4 h,加稀釋后相關試劑,孵育過夜(4℃),加二抗,室溫孵育60 min。ECL定影,凝膠成像系統拍照。β-actin為內參蛋白,目標蛋白同內參蛋白的比值,為蛋白的相對表達量,本實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組細胞增殖率對比

如表1所示,在第24、48、72 h時間段內,比較細胞增殖率情況,下調miR-101-3p組的細胞增殖率最高,上調miR-101-3p組的細胞增殖率低于對照組和下調miR-101-3p組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組細胞增殖率對比

2.2 各組細胞遷移數對比

如表2所示,在第24、48、72 h時間段內,比較細胞遷移數情況,對比對照組和下調miR-101-3p組,上調miR-101-3p組細胞遷移率數較少,對比對照組,下調miR-101-3p組細胞遷移個數較多,有統計學差異(P<0.05)。

表2 各組細胞遷移數對比

2.3 各組細胞侵襲數對比

如表3所示,在第24、48、72 h時間段內,比較細胞侵襲數情況,3組相比,下調miR-101-3p組的細胞侵襲數多于上調組和對照組,且上調miR-101-3p組的細胞侵襲數最少,具有統計學差異(P<0.05)。

表3 各組細胞侵襲數對比

2.4 不同濃度順鉑對各組細胞的抑制情況

如表4所示,在不同濃度順鉑下,比較各細胞的抑制率,上調miR-101-3p組在不同順鉑濃度下對細胞的抑制率水平最高,下調組最低,有統計學差異(P<0.05)。

表4 不同濃度順鉑對各組細胞的抑制率

2.5 各組細胞相關蛋白相對表達量比較

如表5所示,3組對比,上調miR-101-3p組的CDK4、Akt、ICAM-1、MMP-9蛋白表達水平低于下調組和對照組,且下調miR-101-3p組的CDK4、Ak、ICAM-1、MMP-9t蛋白表達水平最高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表5 各組細胞CDK4、Akt蛋白相對表達量比較

3 討論

膀胱癌作為膀胱尿路上皮來源的惡性腫瘤,發病率和死亡率均較高[4]。目前已有研究表明,miR-101-3p在肝癌、胃癌、膀胱癌等多種腫瘤的發生起到了關鍵的作用[5]。

癌細胞具有無限制增生、接觸抑制現象消失和遠處轉移的特點[6-8]。對于癌癥是否出現惡化,可集中在對腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲研究中,上述能力越強,則表明癌癥發展狀況越嚴重[9]。本研究顯示,上調miR-101-3p組癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力均較其他兩組低,充分說明上調miR-101-3p可能會減緩膀胱癌的進展。

臨床化療方案中,常使用順鉑作為主要藥物,據臨床經驗,其治療膀胱癌有效率可達50%～70%,但是隨著化療的大范圍使用,癌細胞已出現獲得性耐藥[10-11]。相關研究表明[12],順鉑耐藥情況的出現與細胞DNA損傷后的修復能力提升有關,且順鉑敏感度可通過體內相應指標含量的改變進行調節。本研究結果顯示,上調miR-101-3p組順鉑敏感度高于對照組、及下調組,這一研究結果表明,上調miR-101-3p可能會提高膀胱癌細胞對順鉑的敏感度,提高相應患者的治療效果。

Akt表達異常同眾多惡性腫瘤的發生、發展及淋巴結的轉移關系密切,CDK4、Akt表達的改變與調控細胞周期的過程出現失控具有相關性,高CDK4、Akt蛋白表達可使細胞周期失控,出現細胞增殖等的異常,導致其向癌細胞方向發展[13-15]。ICAM-1為細胞侵襲相關的代表蛋白,大部分侵襲性癌癥ICAM-1mRNA均有較高水平表達[16-17]。MMP-9為與細胞遷移具有密切關系的蛋白,有實驗嘗試抑制轉移灶MMP-9的表達,結果發現其增長緩慢[18]。相關研究表明[19-20],當腫瘤細胞呈現高遷移數、高侵襲數的狀態時,其ICAM-1、MMP-9蛋白表達量均處于異常升高的水平。本研究在對3組研究對象進行觀察時發現,上調miR-101-3p組癌細胞的CDK4、Akt、ICAM-1、MMP-9蛋白表達水平低于下調組和對照組,說明上調miR-101-3p可減少膀胱癌細胞的高遷移數、高侵襲數,對細胞周期可能起到正常的調控作用。

綜上所述,上調miR-101-3p能夠抑制CDK4、Akt、ICAM-1、MMP-9蛋白的表達,調控細胞周期,阻止膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲,提高其順鉑敏感性,為對膀胱癌的治療起到一定的理論依據。