miR-3917通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移

吳 坤,姜 洋

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃腸結(jié)直腸肛門外科,吉林 長春130033)

結(jié)腸癌(Colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率在男性和女性中分別排名第三和第二,而在年輕人中該病的發(fā)生率也在逐年遞增[1]。CRC發(fā)病的分子機制尚不清楚,既往的研究發(fā)現(xiàn),CRC細胞高度的增殖和遷移能力與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。如何有效抑制這些腫瘤細胞惡性表型是治療CRC的關(guān)鍵。miRNA(微小RNA)是一種單鏈非編碼RNA,長度約為22個核苷酸[3]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,這使其成為相關(guān)診斷和治療的指標和靶點[4]。Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤細胞的生物學表型密切相關(guān),該信號通路的激活促進了CRC細胞的增殖和遷移[5]。Wnt/β-catenin信號通路的激活是通過關(guān)鍵蛋白β-catenin在細胞核內(nèi)的聚集,β-catenin可以作為轉(zhuǎn)錄因子啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄[6]。本研究旨在結(jié)合生物信息學分析和實驗驗證,探究miR-3917在CRC中的表達情況和生物學功能,并進一步闡明相關(guān)信號通路機制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析應(yīng)用GEO2R工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中GSE101502數(shù)據(jù)集的miRNA表達數(shù)據(jù)進行比較分析[7]。該數(shù)據(jù)集中包含3例CRC組織及其癌旁正常組織。設(shè)定條件為Log2│Fold Change│>1、P<0.05的分子為差異表達miRNA,結(jié)果用火山圖展示。應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(https://ualcan.path.uab.edu/)對TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-3917相關(guān)表達數(shù)據(jù)(CRC組織251例,正常組織7例)進行比較分析[8]。應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫(https://www.targetscan.org/vert_72/)對miR-3917的靶基因進行預測[9]。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫對預測得到的靶基因(Total context++ score>-0.1)進行基因功能的GO和KEGG富集分析[10]。火山圖與富集分析結(jié)果展示圖應(yīng)用數(shù)據(jù)可視化工具進行繪制(https://www.bioinformatics.com.cn)。

1.2 材料人正常結(jié)腸細胞(CCD841 CoN)和人CRC細胞(HCT 116)購于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗和胰酶購于Gibco公司;MiPure Cell/Tissue miRNA Kit試劑盒、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)試劑盒和miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix試劑購于南京諾唯贊生物科技公司;miR-3917的miRNA 模擬物(miR-mimic)和相應(yīng)的陰性對照序列(miR-control)、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;CCK-8試劑購于上海翌圣生物科技公司;4%多蒙甲醛固定液和0.5%結(jié)晶紫染色液購于北京索萊寶科技公司;Transwell小室(24孔,8 μm)購于康寧公司;Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction核蛋白提取試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司;PVDF膜和BSA購于默克生命科學技術(shù)公司;β-catenin和Histone H3蛋白一抗購于abcam公司,二抗購于Proteintech公司;ECL顯影試劑購于上海天能生命科學有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)CCD841 CoN細胞和HCT 116細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞融合度達到90%后用胰酶消化法進行細胞傳代。

1.4 qPCR實驗qPCR實驗用于檢測miR-3917的表達水平。應(yīng)用MiPure Cell/Tissue miRNA Kit試劑盒提取細胞樣本的總miRNA。用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix試劑檢測miR-3917和U6的表達。qPCR實驗使用的引物序列如下:miR-3917,上游5’-GCGGCTCGGACTGAGCA-3’,下游5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCACA-3’;U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游5’-AACG-CTTCACGAATTTGCGT-3’。U6作為內(nèi)參對照,每個樣本設(shè)3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算miR-3917的相對表達水平。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染在HCT 116細胞中轉(zhuǎn)染miR-mimic以上調(diào)miR-3917的表達。根據(jù)基因序列將細胞分為miR-control組(對照組)和miR-mimic組(表達上調(diào)組)。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染這些基因。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮的完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后24 h細胞用于后續(xù)相應(yīng)實驗。

1.6 CCK-8實驗CCK-8實驗用于檢測HCT 116細胞的增殖能力。細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(2×103個/孔)。待細胞貼壁后,開始計時,分別于24、48、72 h時間點進行細胞活性檢測,每孔加入10 μL CCK-8試劑,于細胞培養(yǎng)箱中37℃條件下孵育2 h后,用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(OD值),實驗結(jié)果用OD值表示。

1.7 平板克隆形成實驗平板克隆形成實驗用于檢測HCT 116細胞的增殖能力。細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板(150個/孔)。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后,用4%多聚甲醛固定液常溫固定20 min,用0.5%結(jié)晶紫染色液進行染色10 min,實驗結(jié)果用克隆形成的數(shù)量表示。

1.8 劃痕實驗劃痕實驗用于檢測HCT 116細胞的遷移能力。將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中(2×106個/孔)。用200 μL規(guī)格的移液管尖端在孔底造“一”字型劃痕,更換無血清培養(yǎng)基。分別于0和24 h時間點,用倒置光學顯微鏡進行拍照(40×),每個孔隨機選取4個視野。劃痕區(qū)域用ImageJ軟件(1.53e版)計算面積,實驗結(jié)果用細胞遷移率表示,細胞遷移率(%)=(初始劃痕面積-24 h劃痕面積)/初始劃痕面積×100。

1.9 Transwell遷移實驗Transwell遷移實驗用于檢測HCT 116細胞的遷移能力。Transwell小室中接種準備好的細胞(3×104個/孔),上室加入無血清培養(yǎng)基,下室加入含10%血清培養(yǎng)基,于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后,用無菌棉簽輕柔擦去小室上面的未穿膜細胞,用4%多聚甲醛固定液常溫固定20 min,用0.5%結(jié)晶紫染色液染色10 min。用倒置光學顯微鏡拍照(200×),每個孔隨機選取4個視野,實驗結(jié)果用遷移細胞的個數(shù)表示。

1.10 Western blot實驗Western blot實驗用于檢測核內(nèi)β-catenin蛋白的表達水平。細胞樣品用Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction試劑盒提取核蛋白。蛋白樣本在SDS-PAGE膠中進行電泳分離,之后應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜用5%BSA進行封閉后,先后用相應(yīng)的一抗和二抗進行孵育。用ECL試劑進行顯色,用ImageJ軟件計算蛋白條帶的灰度值,Histone H3蛋白作為內(nèi)參對照。

2 結(jié)果

2.1 miR-3917在CRC中的表達比較分析GSE101502數(shù)據(jù)集中3例CRC組織和癌旁正常組織的miRNA表達數(shù)據(jù),結(jié)果顯示與正常組織相比,CRC組織中共有21個存在差異表達的miRNA(Log2│Fold Change│>1、P<0.05),其中差異上調(diào)的有2個,差異下調(diào)的有19個(圖1A)。結(jié)合文獻報道,選擇miR-3917(Log2Fold Change=-1.827278,P<0.05)進行進一步的驗證和探究。如圖1B所示,來自TCGA數(shù)據(jù)庫收錄的樣本數(shù)據(jù)的對比分析結(jié)果也顯示,與正常組織相比,miR-3917在CRC組織中的表達顯著下降(P<0.05)。qPCR實驗結(jié)果(圖1C)證明,結(jié)腸癌細胞系HCT 116中miR-3917的表達水平顯著低于正常結(jié)腸細胞系CCD841 CoN(P<0.05)。為了進一步探究miR-3917在CRC中發(fā)揮的作用,本研究在HCT 116細胞中上調(diào)其表達,觀察對細胞增殖和遷移的影響。如圖1D所示,轉(zhuǎn)染miR-mimic可以顯著提高HCT 116細胞中miR-3917的表達水平(P<0.05)。

圖1 miR-3917在CRC中的表達

2.2 上調(diào)miR-3917的表達對CRC細胞增殖的影響CCK-8實驗結(jié)果顯示,在24、48、72 h時間點,miR-mimic組中細胞的OD值顯著低于miR-control組(圖2A,P<0.05)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示,miR-mimic組的克隆形成數(shù)顯著低于miR-control組(圖2B,P<0.05)。

圖2 上調(diào)miR-3917的表達對CRC細胞增殖的影響

2.3 上調(diào)miR-3917的表達對CRC細胞遷移的影響劃痕實驗結(jié)果顯示,miR-mimic組中細胞的遷移率顯著低于miR-control組(圖3A,P<0.05)。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,miR-mimic組中遷移細胞數(shù)顯著少于miR-control組(圖3B,P<0.05)。

圖3 上調(diào)miR-3917的表達對CRC細胞遷移的影響

2.4 miR-3917的潛在生物學功能和相關(guān)信號通路通過TargetScan數(shù)據(jù)庫對miR-3917下游靶基因進行預測,將得到的靶基因進行GO和KEGG富集分析并展示結(jié)果中排序前10的注釋條目(圖4)。如圖4A所示,RNA聚合酶Ⅱ相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核苷酸切除修復、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等生物學過程(Biological Process)被顯著富集(P<0.05)。細胞成分(Cellu-lar Component)富集結(jié)果顯示,細胞核相關(guān)成分包括核質(zhì)、細胞質(zhì)核周區(qū)等被顯著富集(圖4B,P<0.05)。分子功能(Molecular Function)富集分析結(jié)果顯示,DNA結(jié)合相關(guān)功能被顯著富集(P<0.05)。此外,如圖4D所示,KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,與CRC細胞惡性表型密切相關(guān)的Wnt/β-catenin信號通路被顯著富集(P<0.05)。

圖4 miR-3917的潛在生物學功能和相關(guān)信號通路

2.5 上調(diào)miR-3917的表達對CRC細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響Western blot實驗結(jié)果顯示,miR-mimic組細胞中β-catenin核蛋白的表達水平顯著低于miR-control組(圖5)。

圖5 上調(diào)miR-3917的表達對CRC細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討論

CRC是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,這種疾病是對人類健康的嚴重威脅[11]。目前CRC的主要治療方法包括手術(shù)、化學藥物治療、放射治療、免疫治療等,此外正處于研發(fā)階段的新型治療方法還包括基因治療、靶向治療等。但這些治療手段都存在局限性,如耐藥性、副作用、腫瘤復發(fā)等問題[12]。因此,亟需進一步探究CRC的發(fā)病機制,尋找潛在治療靶點,發(fā)展新的治療方法。

目前有多種miRNA被發(fā)現(xiàn)在CRC中存在差異性表達并與疾病的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)。賈二娜等[13]通過對GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的CRC相關(guān)表達數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn),miRNA-23a在CRC組織中顯著高表達,miRNA-23a高表達組患者的總生存時間顯著低于低表達組,確定miRNA-23a是CRC預后重要的獨立危險因素。CHEN等[14]發(fā)現(xiàn)miR-215在CRC組織和細胞系中顯著低表達,上調(diào)其表達可以抑制CRC細胞的增殖和遷移能力。LIU等[15]通過研究發(fā)現(xiàn),miR-937在CRC組織和細胞系中的表達顯著上升,其表達與CRC的臨床分期相關(guān),下調(diào)miR-937的表達抑制了CRC細胞的增殖和遷移能力。ZHAO等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-1236-3p在CRC組織中的表達顯著下降,其表達與CRC的臨床分期和轉(zhuǎn)移相關(guān),上調(diào)miR-1236-3p的表達可以抑制CRC細胞的增殖和遷移。本研究結(jié)合生物信息學分析和實驗驗證發(fā)現(xiàn),miR-3917在CRC組織和細胞系中顯著低表達,上調(diào)其表達可以顯著抑制CRC細胞的增殖和遷移。這些結(jié)果說明miRNA在CRC中發(fā)揮重要調(diào)控作用,其差異性表達和疾病的發(fā)生和發(fā)展之間具有相關(guān)性。此外,miRNA可以通過結(jié)合靶基因的mRNA以抑制其蛋白翻譯,這是miRNA發(fā)揮生物學功能的重要調(diào)控機制。CHEN等[14]發(fā)現(xiàn)miR-215可以通過靶向調(diào)控Yin Yang 1蛋白的表達發(fā)揮抑制CRC的作用。ZHAO等[16]發(fā)現(xiàn)miR-1236-3p可以通過靶向調(diào)控DCLK3蛋白的表達發(fā)揮抑癌作用。但miR-3917在CRC中發(fā)揮抑癌作用的下游靶基因尚不清楚。

Wnt/β-catenin信號通路的激活促進了CRC細胞的增殖和遷移,參與了多種功能性miRNA在CRC中發(fā)揮的調(diào)控作用。YE等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-34b可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC細胞的增殖。LUAN等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-28-5p可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC細胞的增殖和遷移。本研究通過實驗驗證miR-3917可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制CRC細胞的增殖和遷移能力。但本研究存在一定局限性,相關(guān)研究局限于體外細胞實驗,進一步的動物實驗驗證將在后續(xù)研究中完成。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)miR-3917的表達水平在CRC組織和細胞系中發(fā)生差異性下調(diào),并證明miR-3917可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC細胞的增殖和遷移。這些發(fā)現(xiàn)不僅為CRC發(fā)病的分子機制提供了新的認識,也為CRC的治療提供了新的潛在分子靶點。