艾蒿花粉誘導小鼠過敏性哮喘及其內在型研究

周玲慧 李林梅 謝煥城 宋仕杰 何穎 陶愛林

（廣州醫科大學附屬第二醫院，廣東省過敏反應與免疫重點實驗室，呼吸疾病國家重點實驗室，廣州 510260）

哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病，主要特征為氣道高反應性、可逆性氣流阻塞和氣道重塑［1］。大規模哮喘相關流行病學結果表明我國有4 500萬以上成人患有哮喘，其中過敏性哮喘占比較高，但診斷率和治愈率均極低［2］。

艾蒿是一種菊科植物，生長于歐洲北部和中部、美國以及亞洲很多地區。作為亞洲最常見的吸入性過敏原之一，艾蒿也是我國引起季節性過敏性哮喘重要的花粉過敏原［3-4］。一項橫斷面研究表明，中國約28.6%呼吸系統過敏患者對蒿類花粉敏感，而這一數值在中國北方更高（＞50%）［5］。但其臨床重視程度與樺樹和草花粉相比非常有限［3］。因此，需要建立實驗動物模型深入研究其致病機制，挖掘新的治療靶點和方案。目前研究者已構建了對艾蒿花粉過敏的豚鼠過敏反應模型［6］。相較于豚鼠，小鼠具有操作簡便、資源豐富、可在體內準確評估氣流阻塞和高反應性等優點，是研究過敏性氣道炎癥簡單生理過程的理想模式生物［7］。本研究擬采用艾蒿花粉粗提物（mugwort pollen extract，MPE）腹腔致敏和滴鼻激發的方式誘導小鼠過敏性哮喘模型，為進一步研究艾蒿花粉過敏性哮喘的發病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級野生型雌性BALB/c品系小鼠，6～8周齡，體質量（20±2） g，購自廣東藥康實驗動物有限公司。所有動物均在廣州醫科大學動物研究委員會批準規程下進行（批號：A2020-009）。

1.1.2 主要試劑與儀器 MPE（英國Stallergenes Greer）；乙酰甲膽堿（美國Sigma）；氫氧化鋁佐劑、BCA Protein Assay Kit、小鼠總IgE、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A ELISA試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific）；小鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體（英國Abcam）；小鼠CD45、CD11b、CD11c、Siglec-F、Ly6G流式抗體（美國BD）；小動物全身體積描記檢測系統（美國Bμxco?FinePointeTM）；多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific）；BD Verse流式細胞儀（美國BD）；樣品冷凍研磨儀（中國露卡測序儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型構建 所有小鼠檢疫1周后隨機分為3組：PBS致敏PBS激發組（P-P組，n=5）、MPE致敏PBS激發組（M-P組，n=5）、MPE致敏MPE激發組（M-M組，n=6）。第0、7、14天，小鼠按照分組分別接受200 μl PBS或等體積含300 μg MPE與Al（OH）3的混懸液進行腹腔致敏，第21～25天用30 μl PBS或等體積含300 μg MPE的溶液進行滴鼻激發。第26天進行小動物氣道阻力檢測。

1.2.2 小動物氣道阻力檢測 采用小動物全身體積描記檢測系統評估氣道反應性。檢測前用PBS配制系列梯度乙酰甲膽堿溶液（0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/ml）。按儀器操作規程清潔霧化頭和霧化室，連接儀器后用去離子水進行基線校準。將小鼠放入霧化室后先適應1 min，以乙酰甲膽堿溶液濃度從低到高檢測，程序為霧化1 min、記錄3 min、恢復1 min，記錄呼吸間歇收縮指數（Penh）。

1.2.3 小鼠BALF計數和分類計數 將麻醉并采血的小鼠固定于操作臺，暴露氣管，留置針行氣管插管，醫用縫合線固定。1 ml注射器抽取800 μl預冷含2%胎牛血清的PBS（2%FBS）緩慢勻速灌洗雙肺2次，每次來回抽吸3次。將BALF收集于1.5 ml EP管，500 g、4 ℃離心5 min，細胞沉淀用1 ml 2%FBS重懸，取10 μl用牛鮑計數板在顯微鏡下進行細胞計數。

1.2.4 流式細胞術分析BALF中炎癥細胞分類及數量 收集BALF，500 g、4 ℃離心5 min后進行流式染色，流式抗體4 ℃避光染色30 min。染色完畢后加入1 ml PBS洗滌1次，200 μl 2%FBS重懸細胞上機檢測。FlowJo軟件進行數據分析。

1.2.5 肺組織勻漿中細胞因子檢測 提前預冷組織勻漿儀至-65 ℃，小鼠肺組織中加入1 ml含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，70 Hz勻漿30 s，重復2次。冰上靜置30 min，12 000 g、4 ℃離心10 min，上清為肺組織勻漿，BCA法測量肺組織裂解液蛋白含量。ELISA檢測肺組織勻漿中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A水平，按說明書操作。肺組織勻漿中細胞因子水平均用蛋白含量歸一化。

1.2.6 血清中各類免疫球蛋白和細胞因子檢測異氟烷麻醉小鼠，眼球采血，收集血液于1.5 ml EP管。全血室溫靜置3 h，3 000 g、4 ℃離心20 min，收集上清。ELISA檢測血清總IgE，按試劑盒說明書操作。MPE特異性IgE、IgG1、IgG2a用自包被板法進行檢測，具體步驟參考文獻［8］。血清中細胞因子檢測同1.2.5。

1.2.7 小鼠肺組織病理切片檢查 獲取BALF后迅速取出左肺浸泡于4%多聚甲醛進行固定，脫水、包埋、切片、展片、撈片，進行HE染色、PAS染色、Masson染色、α-SMA免疫組化染色。HE染色評分標準為0分：小鼠肺組織氣道周圍無炎癥細胞浸潤；1分：小鼠肺組織氣道周圍偶見炎癥細胞浸潤；2分：小鼠肺組織氣道周圍可見單層炎癥細胞浸潤；3分：小鼠肺組織氣道周圍可見雙層炎癥細胞浸潤；4分：小鼠肺組織氣道周圍可見多層炎癥細胞浸潤。用PAS染色陽性細胞占上皮細胞總數百分比對病理變化進行量化，0分：無陽性細胞；1分：＜25%；2分：25%～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。Masson染色評分標準：Image J軟件計算膠原纖維藍色著染面積。α-SMA染色評分標準：Image J軟件統計多個位置氣道平滑肌厚度。

1.3 統計學處理 采用GraphPad prism 9.0軟件進行統計學分析，均以表示。數據采用兩樣本t檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MPE誘導氣道高反應性 氣道高反應性是哮喘主要特征之一。MPE第5次滴鼻激發24 h后，用系列梯度濃度乙酰甲膽堿激發，無創肺功能儀記錄小鼠Penh評估氣道反應性，從3.125 mg/ml開始，M-M造模組氣道反應性均顯著高于M-P組（P＜0.001，圖1）。

圖1 MPE構建過敏性哮喘模型Fig.1 Generation of allergic asthma mouse model by MPE

2.2 MPE誘導肺組織病理學改變 HE染色評判肺部整體病理學改變（圖2），M-M組小鼠肺組織支氣管和血管周圍均出現明顯炎癥細胞浸潤，P-P組和M-P組無明顯病理改變。氣道周圍炎癥半定量評分差異顯著（P＜0.001），提示MPE哮喘模型組小鼠肺組織發生明顯炎癥改變。

圖2 MPE致敏激發加重小鼠肺組織炎癥浸潤Fig.2 Enhanced effect of MPE on inflammatory cell infiltration in lung tissues of mice

2.3 MPE誘導小鼠發生氣道重塑 PAS染色評估杯狀細胞化生，M-M組小鼠肺組織切片PAS染色結果評分顯著升高。Masson染色顯示M-M組肺組織膠原沉積水平顯著上升。α-SMA免疫組化結果顯示，M-M組肺組織支氣管平滑肌明顯增厚（圖3）。提示MPE通過肺部支氣管杯狀細胞化生、氣道平滑肌增厚及膠原纖維沉積導致支氣管壁變硬和收縮，引起過敏性哮喘的發生發展。

圖3 MPE致敏激發導致杯狀上皮細胞化生增多、氣道平滑肌增厚及膠原纖維沉積（100 μm）Fig.3 Enhanced effect of MPE on obvious goblet metaplasia， thickening of airway smooth muscles， and dramatical fibrin deposition around airway （100 μm）

2.4 MPE誘導小鼠血清總IgE及MPE特異性IgE、IgG1、IgG2a水平升高 IgE是過敏性疾病發展的關鍵因素，可促進肥大細胞中炎癥介質組胺、前列腺素和細胞因子產生。檢測模型中MPE特異性抗體水平，包括IgE（圖4），MPE激發后，小鼠血清總IgE和MPE特異性IgE水平顯著高于兩個對照組，MPE特異性IgG1和IgG2a水平也顯著提高。表明MPE可誘導小鼠產生IgE介導的過敏性哮喘。

圖4 MPE促進小鼠血清抗體水平升高Fig.4 MPE increases levels of serum immunoglobulin of mice

2.5 MPE哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒細胞比例明顯升高 過敏性哮喘涉及多種炎癥細胞浸潤，嗜酸性粒細胞和中性粒細胞是過敏性哮喘中重要的效應細胞［9］。流式細胞術分析BALF細胞中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞，圈門分析策略如圖5A。M-M組BALF細胞總數明顯上升（P＜0.001），CD45+細胞數增多（P＜0.001），嗜酸性粒細胞比例顯著升高（P＜0.001），但中性粒細胞比例無明顯變化（圖5B～E），說明MPE誘發以嗜酸性粒細胞浸潤為主的過敏性哮喘。

圖5 M-M組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞浸潤為主Fig.5 Eosinophil infiltration dominant in BALF of mice in M-M group

2.6 MPE可誘導產生2型和17型細胞因子 ELISA檢測肺組織勻漿和血清細胞因子表達，發現肺組織勻漿和血清2型、17型細胞因子均有增加，其中肺組織勻漿中IL-5和血清中IL-4均有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 小鼠肺組織勻漿和血清中細胞因子水平Fig.6 Cytokine levels in lung tissue homogenization and serum of mice

3 討論

艾蒿是中國常見的吸入性過敏原之一。本研究顯示，MPE致敏和激發后，M-M組出現氣道高反應性、炎癥細胞浸潤增多、氣道重塑等過敏性哮喘癥狀，包括杯狀細胞化生、氣道平滑肌細胞增殖及上皮下大量膠原蛋白沉積等。過敏性哮喘根據炎癥表型可分為4種：嗜酸性粒細胞型、中性粒細胞型、寡粒細胞型、混合粒細胞型［10］。本研究中BALF流式結果顯示，M-M組肺組織浸潤炎癥細胞主要由嗜酸性粒細胞組成。因此，MPE誘導以嗜酸性粒細胞浸潤主的過敏性哮喘。

研究發現，艾蒿花粉過敏哮喘患者在花粉季節時，外周血ILC2細胞增多［11］。ILC2不僅通過產生IL-5、IL-9、IL-13直接影響嗜酸性粒細胞數量、杯狀細胞化生和支氣管高反應性，還允許樹突狀細胞重新刺激記憶性Th2細胞反應［12］。本研究進一步探討了MPE誘導哮喘表型的作用機制，流式結果顯示，M-M組BALF細胞分類以嗜酸性粒細胞升高為主。嗜酸性粒細胞是一種參與多種炎癥反應的粒細胞，常在抗寄生蟲感染和2型炎癥中發揮作用［13］。ELISA顯示肺組織勻漿中，M-M組細胞因子IL-4、IL-13及IL-17A水平較兩個對照組明顯升高。血清中M-M組細胞因子IL-5、IL-13水平也升高。IL-4和IL-13通路激活可促進氣道高反應性［14］。過敏性哮喘氣道重塑中，IL-13誘導杯狀細胞化生、黏液分泌過多、支氣管成纖維細胞、肌成纖維細胞和氣道平滑肌細胞增殖，而IL-4可促進上皮下細胞膠原纖維產生和纖維連接蛋白合成，并促進重癥哮喘患者長期氣道重塑［15］。IL-4還是驅動B細胞合成IgE和IgG1的主要細胞因子，促進黏附分子（細胞間黏附分子ICAM-1和血管細胞黏附分子VCAM-1）表達，使嗜酸性粒細胞向氣道炎癥部位浸潤［12］。各種過敏性疾病中，循環血液中的嗜酸性粒細胞一般處于靜息狀態，被趨化至目的地才會脫顆粒。IL-5是嗜酸性粒細胞分化、激活和存活的關鍵誘導因子，對嗜酸性粒細胞凋亡有抑制作用且有助于哮喘氣道內嗜酸性粒細胞招募［16］。哮喘患者氣道中的IL-17A通過上調集落刺激因子3和趨化因子配體促進氣道中性粒細胞增多，介導氣道高反應性和皮質類固醇耐藥［17］。研究表明，IL-17A和IL-17F通過從支氣管上皮細胞釋放CXC趨化因子將嗜中性粒細胞募集至氣道，肺部IL-17A和IL-17F水平升高與疾病嚴重程度直接相關［18］。本研究中，M-M組肺組織勻漿IL-17A水平升高，但BALF中的中性粒細胞增加不明顯，可能因為并未檢測到BALF中IL-17A表達。有研究者在小鼠和人類肺中發現嗜酸性粒細胞還可以獨特方式，如細胞外誘捕網，參與嗜酸性粒細胞相關疾病發病機制［19］。細胞外誘捕網細胞死亡（extracellular trap cell death，Etosis）是不同于凋亡和壞死的細胞死亡機制，是一種由DNA、組蛋白和顆粒蛋白組成的三維網狀結構［20］。哮喘中常見的Etosis包括中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）和嗜酸性粒細胞胞外誘捕網（eosinophil extracellular traps，EETs）［21］。研究發現EETs可能通過激活氣道上皮和ILC2細胞在嗜酸性粒細胞型哮喘發生發展中發揮關鍵作用［22］。EETs也被證實與杯狀細胞化生、黏液產生、炎癥細胞浸潤和2型細胞因子表達密切相關，還可通過神經免疫信號驅動哮喘發展［23］。因此，Etosis在MPE誘導的過敏性哮喘中是否起關鍵作用仍需進一步探究。

血液或痰中的嗜酸性粒細胞增加與頻繁的哮喘發作和疾病嚴重程度有關。目前抗IL-5單克隆抗體已被批準用于治療嗜酸性粒細胞型哮喘和外周嗜酸性粒細胞增多癥［24］。貝那利珠單抗（Benralizumab）作為減少嗜酸性炎癥的免疫調節療法之一，可以與IL-5受體α亞基結合，但僅有不到63%哮喘患者能減少口服激素［25］。此外，度普利尤單抗（Dupilumab）是一種針對IL-4α亞基的單克隆抗體，作為IL-4和IL-13介導的信號通路的雙重抑制劑，也被批準用于嗜酸性粒細胞型哮喘，但僅有41%患者癥狀能得到良好控制［26-27］。說明控制單一類型的炎癥因子無法完全控制過敏性哮喘。

綜上，本研究表明艾蒿作為常見的吸入性過敏原可成功誘導小鼠以嗜酸性粒細胞浸潤為主的過敏性哮喘，但肺部浸潤不同類型炎癥因子，且IgE和IgG亞型水平均升高，說明單純檢測某一類型細胞因子不能全面指導臨床治療。因此，臨床上要對炎癥進行全面檢測才能精準控制癥狀。而針對此類有確定誘因的過敏性哮喘，采用脫敏治療方案才是根本處理措施。