4天香煙煙霧暴露聯合poly（I：C）刺激對小鼠肺部免疫應答及干擾素表達的影響

董曉飛 梁紫堯 范龍 全景羽 林琳 周穎芳 吳蕾 于旭華

（1.廣州醫科大學，廣州 510150； 2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣州 510120； 3.粵港澳中醫藥與免疫疾病研究聯合實驗室，廣州 510290）

吸煙對人體免疫系統具有復雜的影響［1］。研究表明，與不吸煙人群相比，吸煙者感染流感病毒風險增加［2］。但吸煙對呼吸道抗病毒免疫的影響并不清楚。TLR3是病毒入侵宿主后激活宿主免疫的主要途徑，也是促進Ⅰ型干擾素生成的主要途徑。本研究通過觀察香煙煙霧對TLR3激動劑聚肌苷聚胞苷酸鈉poly（I：C）誘導的氣道免疫炎癥反應和Ⅰ型干擾素及干擾素刺激基因的影響，明確香煙煙霧暴露對TLR3激活誘導的免疫應答的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 poly（I：C）、鹽酸吖啶橙溶液、溴化乙錠（Sigma，貨號：019M4060v、8097-10ML、E1510-10-ML）；SteadyPure通用RNA提取試劑盒、SYBR Green Pro Tab HS預混型qPCR試劑盒（Accurate Biology，貨號：AG21017、AG11701）；KWIK-DIFF溶液#1、#2、#3快速染色試劑盒（Thermo Fisher，貨號：9990700）；大前門牌過濾嘴香煙（煙堿含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，上海煙草集團）。引物均來源于Invitrogen（Fisher Scientific），引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.2 儀器 多功能臺式冷凍離心機（AllegraX-22R）；超微量紫外/可見分光光度計（賽默飛，Nanodrop 2000c）；PCR擴增儀（AppliedBiosystem）；熒光定量PCR儀（Ⅵ A7）；顯微鏡（BX61+DP720，Olympus）；細胞涂片離心機（Stat Spin CytoFuge12/IRIS）。

1.1.3 實驗動物 SPF級6～8周齡BALB/c小鼠，雄性，體質量（20±2） g，由廣東斯嘉景達生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（粵）2020-0052。飼養溫度：（24±3） ℃，相對濕度：（40±5）%，光照：明暗交替，噪聲＜55 dB，自由攝水攝食，每周更換墊料2次。本研究經廣東省中醫院倫理委員會批準（2021066）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 小鼠隨機分為4組：對照組、熏煙組、poly（I：C）組、熏煙聯合poly（I：C）組，每組6只。熏煙方法：小鼠適應性喂養3 d后，置于18 L塑料熏煙箱中，于9：00、12：00、15：00進行熏煙，3支/次，3次/d，1 h/次，共4 d，煙霧用60 ml注射器注入熏煙箱。假熏煙即每天按時置于18 L塑料箱，但不給予香煙煙霧暴露。poly（I：C）滴注方法：熏煙結束后第1天經異氟烷吸入麻醉，移液器經鼻孔滴入50 μl poly（I：C）（1 mg/ml），待小鼠清醒后置于籠內正常飼養。假滴注即在異氟烷麻醉后滴入50 μl生理鹽水。對照組給予假熏煙和假滴注，熏煙組給予熏煙聯合假滴注，poly（I：C）組給予假熏煙和poly（I：C）滴注，熏煙聯合poly（I：C）組給予熏煙和poly（I：C）滴注。

1.2.2 氣道灌洗液制備［3］小鼠用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切開氣管處皮毛，充分暴露氣管，經環狀軟骨間隙切開一小口，插入氣管灌洗管（剪成楔形的24 G靜脈留置針），分4次向氣管內注射1.3 ml PBS并回抽，每只小鼠共回收約1 ml含免疫細胞的灌洗液。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液細胞計數及細胞分類計數 將氣道灌洗液混勻，加入20 μl AO/EB工作液混勻，將細胞計數板置于熒光顯微鏡下進行有核細胞計數。剩余含細胞的灌洗液根據細胞濃度用涂片離心機進行涂片離心，干燥后進行快速KWIKDIFF染色。按細胞形態學差異對細胞進行分類計數，獲得不同種類細胞比例，計算每只動物灌洗液中不同種類細胞絕對數。

1.2.4 qPCR測定肺組織細胞因子 完成氣管灌注后切開胸腹，充分暴露心肺，用5 ml生理鹽水進行心臟灌流，洗去肺中殘存血液，切下兩側肺，濾干水分，液氮速凍后-80 ℃保存。使用SteadyPure通用型RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，按照劑盒說明書操作，2-ΔΔCt計算RNA相對表達。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件分析數據，計量資料以表示，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗，兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 香煙煙霧聯合poly（I：C）對氣道灌洗液細胞總數和分類計數的影響 與對照組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液細胞總數（P＜0.01）、巨噬細胞數（P＜0.01）、中性粒細胞數（P＜0.01）和淋巴細胞數（P＜0.05）均明顯升高。與熏煙組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液細胞總數（P＜0.01）、巨噬細胞數量（P＜0.05）、中性粒細胞數（P＜0.01）均顯著升高（P＜0.01）。與poly（I：C）組小鼠相比，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液細胞總數（P＜0.05）和巨噬細胞數（P＜0.05）顯著升高（表2）。

表2 氣道灌洗液細胞總數和分類計數（，n=6）Tab.2 Total number of cells and cell differentials in airway lavage fluid （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group，5）P＜0.05.

Total lymphocytes（×105）0.03±0.00 0.09±0.02 0.32±0.061）3）0.23±0.061）4）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）Total cells（×105）1.27±0.22 2.26±0.35 4.29±0.861）7.28±0.782）4）5）Total macrophages（×105）1.09±0.19 1.89±0.26 1.84±0.43 3.49±0.322）3）5）Total neutrophils（×105）0.05±0.01 0.26±0.11 2.13±0.751）3）3.56±0.532）4）

2.2 香煙煙霧聯合poly（I：C）對灌洗液中免疫細胞形態學的影響 對照組灌洗液以單核-巨噬細胞為主，偶見中性粒細胞和淋巴細胞。巨噬細胞胞體呈圓形，胞核呈圓形，深染；中性粒細胞通常呈桿狀或2～3分葉狀。熏煙組細胞以巨噬細胞為主，體積較對照組巨噬細胞稍大。poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液可見大量中性粒細胞和淋巴細胞，中性粒細胞核多呈明顯的3～5分葉狀，葉與葉間多有細絲相連，巨噬細胞數量相對較少，與對照組比較，體積較大。熏煙聯合poly（I：C）組巨噬細胞體積較大，呈圓形或不規則形，細胞質內可見空泡，部分細胞處于有絲分裂期；中性粒較多，分葉狀明顯（圖1）。

圖1 香煙煙霧聯合poly（I：C）對免疫細胞形態的影響（KWIK-DIFF快速染色，×200）Fig.1 Effects of cigarette smoke combined with poly（I：C）on immune cell morphology （KWIK-DIFF rapid staining，×200）

2.3 香煙煙霧聯合poly（I：C）對肺組織趨化因子表達的影響 與對照組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織中性粒細胞趨化因子CXCL1（P＜0.05）、CXCL2（P＜0.01）和淋巴細胞趨化因子CCL2（P＜0.01） mRNA表達均升高。與熏煙組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織CXCL1（P＜0.05）、CXCL2（P＜0.01）、CCL2（P＜0.01） mRNA表達均顯著升高。與poly（I：C）組小鼠比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織CXCL2 mRNA表達顯著升高（P＜0.05，表3）。

表3 小鼠肺組織中趨化因子表達（，n=6）Tab.3 Expressions of chemokines in lung tissues of mice（，n=6）

表3 小鼠肺組織中趨化因子表達（，n=6）Tab.3 Expressions of chemokines in lung tissues of mice（，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group， 5）P＜0.05.

CCL2 mRNA 0.94±0.12 2.99±0.41 70.69±14.911）3）105.50±24.282）4）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）CXCL1 mRNA 1.10±0.13 3.70±0.63 22.40±7.39 37.06±9.731）3）CXCL2 mRNA 1.00±0.02 2.08±0.45 3.39±1.51 8.38±1.822）4）5）

2.4 香煙煙霧聯合poly（I：C）對肺組織中細胞因子及MMP-12表達的影響 與對照組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達均明顯升高（P＜0.01）。與熏煙組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達均明顯升高（P＜0.01）。與poly（I：C）組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織TNF-α mRNA表達明顯升高（P＜0.01）。各組間MMP-12表達無明顯變化（P＞0.05，表4）。

表4 小鼠肺組織中細胞因子及金屬蛋白酶MMP-12表達（，n=6）Tab.4 Expressions of cytokines and metalloproteinase MMP-12 in lung tissues of mice （，n=6）

表4 小鼠肺組織中細胞因子及金屬蛋白酶MMP-12表達（，n=6）Tab.4 Expressions of cytokines and metalloproteinase MMP-12 in lung tissues of mice （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group，5）P＜0.01.

MMP-12 1.23±0.32 1.79±0.47 0.77±0.13 1.86±0.50 Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）IL-1β mRNA 1.04±0.16 0.83±0.14 7.31±1.611）3）10.08±2.512）4）IL-6 mRNA 0.89±0.08 2.07±0.57 57.40±15.22）3）65.06±16.492）4）TNF-α mRNA 0.98±0.08 2.54±0.95 4.01±0.70 12.36±3.072）4）5）

2.5 熏煙聯合poly（I：C）對小鼠肺組織干擾素及干擾素刺激基因表達的影響 與對照組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織IFN-β（P＜0.01）、IFN-γ（P＜0.05）、MX2（P＜0.01）和IP-10（P＜0.01）表達顯著升高。與熏煙組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織IFN-β（P＜0.01）、IFN-γ（P＜0.01）、MX2（P＜0.01）和IP-10（P＜0.01）表達顯著升高。且與單純poly（I：C）組比較，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠IFN-β表達顯著升高（P＜0.01，表5）。

表5 肺組織中干擾素表達及干擾素刺激基因轉錄（，n=6）Tab.5 Expressions of interferons and transcription of interferon-stimulated-genes in lung tissues （，n=6）

表5 肺組織中干擾素表達及干擾素刺激基因轉錄（，n=6）Tab.5 Expressions of interferons and transcription of interferon-stimulated-genes in lung tissues （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.01； compared with poly（I：C） group， 4）P＜0.01.

IP-10 1.02±0.12 1.81±0.31 90.23±33.08 153.52±30.882）3）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）IFN-α 1.38±0.78 1.40±0.50 1.07±0.25 1.88±0.66 IFN-β 1.41±0.83 1.29±0.49 3.81±1.18 10.67±2.222）3）4）IFN-γ 1.00±0.03 0.90±0.23 5.85±0.772）3）5.04±1.161）3）IFN-λ 1.30±0.67 1.52±0.70 1.48±0.68 1.79±0.49 OAS1 1.06±0.25 1.34±0.66 1.59±0.40 1.31±0.25 MX2 1.01±0.10 1.38±0.50 7.68±1.572）3）9.39±1.032）3）

3 討論

吸煙可誘導氣道炎癥并導致氣道結構不可逆破壞。poly（I：C）是人工合成的雙鏈RNA，可模擬病毒感染并通過激活TLR3引發抗病毒免疫應答，產生Ⅰ型干擾素和炎癥細胞因子發揮抗病毒作用［4］。poly（I：C）本身具有強烈促炎作用以及增強巨噬細胞吞噬、殺菌等功能，廣泛用于病毒引起的宿主免疫應答研究［5］。盡管短期香煙暴露并未導致肺組織結構破壞，但課題組前期研究表明，4 d香煙煙霧暴露可誘導氣道免疫細胞聚集和肺組織炎癥反應［3］，因此本研究揭示香煙暴露誘導的氣道免疫應答與poly（I：C）誘導的氣道免疫應答的疊加效應，從而反映吸煙人群在病毒感染過程中的免疫應答變化以及吸煙對呼吸道病毒感染免疫應答的影響。

巨噬細胞和中性粒細胞是固有免疫屏障的重要組成，可吞噬清除病原微生物和氣道中的有害顆粒［6］。淋巴細胞可介導被感染細胞的免疫應答，通過細胞毒性T淋巴細胞對細胞進行殺傷或誘導適應性免疫應答，誘導干擾素產生。本研究表明，香煙暴露4 d導致小鼠氣道灌洗液細胞數量輕度升高，未出現明顯炎癥反應，可能由于香煙暴露第5天接受了假氣道滴注，24 h后進行取材，此時短期香煙暴露導致的氣道急性炎癥反應有所衰減。相比于poly（I：C）組，熏煙聯合poly（I：C）組氣道灌洗液中細胞總數明顯增多，主要為巨噬細胞增多，而中性粒細胞和淋巴細胞變化差異無統計學意義。提示香煙煙霧加劇了poly（I：C）對巨噬細胞的趨化和募集，這一過程可能更有利于微生物清除。

免疫細胞在炎癥部位聚集是誘導炎癥反應的基礎，而趨化因子是誘導免疫細胞移動、回巢和聚集的關鍵［7］。本研究中，熏煙聯合poly（I：C）組小鼠肺組織單核-巨噬細胞趨化因子CCL2和IP-10表達較其余各組有不同程度升高，解釋了熏煙聯合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液中巨噬細胞數量明顯增多的原因。巨噬細胞分泌的多形核細胞趨化因子CXCL2表達較poly（I：C）組小鼠明顯升高，說明氣道中巨噬細胞可能通過增加CXCL2表達進一步加劇中性粒細胞招募，從而促進“炎癥瀑布”形成。

IL-6、TNF-α、IL-1β是常見的促炎因子，均可參與炎癥反應發生。IL-6是最早升高的急性炎癥標志物。TNF-α、IL-6和IL-1β能引起內皮細胞損傷、介導炎癥反應并參與機體免疫調節，同時促進炎癥細胞活化與浸潤，增強炎癥介質誘導的呼吸道黏液細胞高分泌狀態，引發支氣管狹窄、收縮等氣道高反應性［8-9］。本研究表明，氣道滴注poly（I：C）24 h后，小鼠肺組織IL-6、IL-1β mRNA表達明顯升高，說明小鼠氣道處于急性炎癥反應階段。而熏煙聯合poly（I：C）組小鼠IL-6、IL-1β mRNA表達略高于poly（I：C）組，且TNF-α mRNA表達明顯高于poly（I：C）組，說明香煙煙霧暴露加劇了poly（I：C）誘導的小鼠肺部急性炎癥反應，且熏煙聯合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液中性粒細胞較多，巨噬細胞胞質內產生大量吞噬空泡，說明熏煙聯合poly（I：C）組小鼠氣道炎癥反應加劇。

干擾素是抑制病毒復制的重要介質，根據產生細胞不同可分為IFN-α、IFN-β和IFN-γ，近年還發現了IFN-λ，也稱Ⅲ型IFN，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節功能。IFN-α和IFN-β被歸為Ⅰ型IFN，能在病毒感染早期抑制病毒復制［10］。IFN-γ即Ⅱ型IFN，是一種免疫調節因子而非抗病毒介質［11］。本研究中，熏煙聯合poly（I：C）滴注顯著升高了IFN-β表達，其水平高于單獨poly（I：C）滴注組，說明香煙煙霧暴露促進了poly（I：C）誘導的Ⅰ型IFN表達。Ⅰ型IFN可通過與IFN受體（IFNAR）結合促進下游IFN刺激基因轉錄，如OAS、MX和IP-10等。OAS1可調節核糖核酸酶L的抗病毒活性，導致病毒RNA降解，抑制病毒復制［12-13］。MX蛋白可通過蛋白寡聚和GTP酶水解抑制RNA和DNA病毒復制［14］。IP-10具有促進T細胞黏附內皮細胞、抗腫瘤活性和抑制骨髓集落形成和血管生成作用，也是有力的巨噬細胞趨化因子，參與COVID-19誘導的炎癥風暴［15-16］。本研究表明，香煙煙霧暴露聯合poly（I：C）氣道滴注顯著增加了小鼠肺部MX2和IP-10表達，提示香煙煙霧暴露聯合poly（I：C）滴注促進了IFN刺激基因表達，可能因此抑制病毒復制和促進炎癥風暴。

綜上，短期香煙煙霧暴露可能通過增加poly（I：C）誘導的氣道巨噬細胞數量和Ⅰ型IFN表達促進呼吸道病毒清除，同時增加了poly（I：C）誘導的氣道炎癥反應，加劇氣道損傷和重構。

本研究結果并未提示香煙煙霧可通過抑制Ⅰ型IFN表達增加呼吸道病毒感染，與既往研究結果不一致，其原因可能與本次香煙暴露時間較短有關［17-18］。同時提示香煙煙霧可能通過其他途徑影響呼吸道病毒感染，為進一步研究提供了依據。