HPV L1保守序列多肽抗血清降解HPV6感染能力的測試

鄧金芳 李志英 薛冰 肖長義 （.三峽大學附屬仁和醫(yī)院婦產科，三峽大學婦科腫瘤研究所，宜昌 443000； .三峽大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，宜昌 443000）

基于生物信息學技術在人乳頭瘤病毒L1 C-末端篩選出一段高度保守穩(wěn)定的30個氨基酸殘基長度的序列，以此序列合成的多肽可誘導出針對不同型別HPV L1的抗體。經多種方法測試，證明該序列多肽誘導的抗體對組織標本內的HPV L1具有良好的檢測性［1-3］。為明確該抗體對HPV L1是否具有降解作用，以及該段多肽作為免疫原是否具有開發(fā)為廣譜HPV疫苗的潛在價值，而進行了本項研究。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本 收集來自三峽大學附屬仁和醫(yī)院婦產科門診和皮膚性病科門診的活檢標本，所有標本均經病理診斷確診。所取標本均先做病理診斷，剩余標本用于研究。用于研究的標本盡快進行分型鑒定，鑒定為HPV6型陽性的標本進一步做病毒提取。若不能立即處理，則置于-80 ℃冰箱保存。本研究經三峽大學附屬仁和醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2021k110）。

1.1.2 細胞來源 人永生化角質形成細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學），為HPV陰性的永生化角質形成細胞。

1.1.3 主要試劑 2×Taq Master Mix（Promega公司）；DNA marker（上海捷瑞生物有限公司）；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒提取 參考文獻［4-5］，簡述如下：采用無菌PBS溶液洗凈1～1.5 g尖銳濕疣組織的血污，無菌眼用手術剪修剪標本，盡可能剔除皮下及真皮組織，并充分剪碎組織。將提取緩沖液（0.02 mol/L Tris，1 mol/L NaCl， pH=7.4）加入切碎的組織，并轉入玻璃勻漿器內，勻漿器置于冰浴中充分勻漿。將上層液體轉入1.5 ml EP管中，28 000 r/min、4 ℃離心12 min，收集上清置于冰上，將提取緩沖液中加入沉淀中，重復操作4次。收集4次操作上清并混合，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。留100 μl濾液行PCR分型，剩余懸液于0.5 ml EP管分裝后置于-80 ℃冰箱封存以待下次使用。

1.2.2 病毒型別鑒定 引物及擴增參考文獻［5-7］，通過primer 5.0引物設計以及DNAMAN基因分析兩款軟件，參照已有的HPV6序列，篩選出評分高、片段小的引物。正向引物（4671-4690）TAGTGGGCCTATGGCTCGTC；反向引物（4950-4931）TCCATTAGCCTCCACGGGTG，目的條帶：280 bp。PCR反應體系：2×Taq Master Mix 12.5 μl、HPV6和11型引物（10 μmol/L） 0.5 μl、提取的病毒懸液 1.5 μl，去離子水加至25 μl。PCR反應要求：94 ℃預變性5 min；40個循環(huán)：94 ℃變性 90 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳擴增產物，并于凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄。

1.2.3 HPV6病毒對人永生化角質形成細胞感染效果的檢測 從HPV6病毒感染的人永生化角質形成細胞中提取DNA，發(fā)現(xiàn)病毒感染后的細胞在280 bp處顯示出明顯條帶，而在280 bp處沒有顯示出條帶的則確定為未被病毒感染的細胞。

1.2.4 多抗血清降解病毒感染能力測試 參考文獻［8-9］，簡述如下：人永生化角質形成細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當瓶底剩余空間為10%～20%，即細胞基本鋪滿瓶底時，將提取的HPV6病毒及經多抗血清中和后的病毒加入培養(yǎng)瓶中。病毒需與多抗血清做如下梯度稀釋中和處理后加入，將病毒懸液與1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810稀釋的等量多抗血清混合，37 ℃下中和1 h。培養(yǎng)細胞在加入病毒后，繼續(xù)37 ℃孵育，于1 h內，每隔15 min搖板1次，然后培養(yǎng)過夜。嚴格于感染培養(yǎng)后的24 h時，使用PBS充分洗滌3次，收集細胞。部分細胞提取DNA，做HPV6 DNA測定，測定方法同前；部分細胞提取蛋白，做HPV6 L1蛋白的ELISA檢測。

1.2.5 細胞吸收病毒后L1蛋白的ELISA檢測 待檢樣品用pH=9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至蛋白含量為10 μg/ml，96孔板每孔添加100 μl，4 ℃培養(yǎng)12 h；將孔內溶液丟棄至廢液缸，磷酸鹽緩沖液洗板3次，每次3 min；加入封閉液，室溫封閉1 h，緩沖液洗；加1∶500的L1多肽抗血清，37 ℃孵育1 h，緩沖液洗；加入1∶1 000稀釋的過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，37 ℃培養(yǎng)1 h，緩沖液洗；DAB顯色，調整酶標儀讀取各孔490 nm處的光密度（OD）值。重復實驗3次取平均值。以沒有接觸病毒的人永生化角質形成細胞做陰性對照。所得OD值用SPSS10.0軟件處理。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS10.0軟件進行分析，多組間數(shù)據比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 標本收集及分型鑒定 共收集到符合要求的經臨床及病理確診的生殖器尖銳濕疣標本26例。分型鑒定結果表明，凡于280 bp處出現(xiàn)陽性條帶的即鑒定為HPV6陽性，共鑒定出HPV6型20例，其他型別6例（圖1）。

圖1 臨床標本HPV型別鑒定PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoresis map for identification of HPV type in clinical specimens

2.2 HPV6病毒對人永生化角質形成細胞感染效果的檢測 從HPV6病毒感染的人永生化角質形成細胞中提取DNA，結果發(fā)現(xiàn)病毒感染后的細胞在280 bp處顯示出明顯條帶，而未被病毒感染的細胞在280 bp處未顯示出條帶，說明提取的HPV6病毒具有感染人永生化角質形成細胞的能力（圖2）。

圖2 HPV6感染人永生化角質形成細胞的病毒DNA檢測PCR擴增圖Fig.2 PCR amplification plot of viral DNA detection in HPV6-infected human immortalized keratinocytes

2.3 多抗血清降解病毒感染能力的測試 HPV病毒感染后，其PCR產物經電泳，在280 bp處有明顯陽性條帶（圖3），隨著抗體濃度增加陽性條帶逐漸變暗。對PCR電泳圖進行光密度值檢測和統(tǒng)計學分析，與陰性對照組相比，結果均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。光密度值與抗體濃度之間呈顯著負相關（r=-0.935 5，圖4）。

圖3 中和后PCR電泳圖Fig.3 Neutralized PCR electrophoresis

圖4 倍比稀釋抗血清分別與陽性對照光密度值比較Fig.4 Fold ratio diluted antiserum compared with positive control photodensity values

2.4 細胞吸收病毒后L1蛋白的ELISA檢測 隨著抗體稀釋滴度增加，L1蛋白檢出量呈上升趨勢，病毒吸附于培養(yǎng)細胞的量顯著增加。說明隨著抗體稀釋度增加，其對病毒的中和能力隨之下降，抗血清濃度與L1蛋白含量之間呈負相關（r=-0.880 5）。見圖5。

圖5 被抗體中和后病毒感染的細胞內HPV6 L1蛋白的ELISA檢測結果Fig.5 Results of ELISA detection of intracellular HPV6 L1 protein infected by postviruses neutralized by antibodies

3 討論

已知HPV形成的體液免疫具有很強的型間限制，不同型別的HPV誘導形成的抗體很少具有型別間的交叉反應能力，這也是目前HPV感染預防采用多價疫苗的原因［10-12］。本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，以HPV主要外殼蛋白（L1）C-末端的一段保守序列合成的多肽，其誘發(fā)動物形成的抗體具有多價反應能力。但該多價抗體是否具有降解作用尚不知曉。因此，本實驗測試多肽抗血清能否阻止HPV6病毒顆粒對人永生化角質形成細胞的吸附，明確此多價抗血清能否降解HPV6病毒。有研究表明人乳頭瘤病毒能夠體外感染單層培養(yǎng)的人永生化角質形成細胞［4，8］，因此本研究選擇此細胞輔助完成實驗。

檢驗受染細胞中人乳頭瘤病毒DNA的存在是判斷人乳頭瘤病毒感染成功最便捷的方法［4，7-8］。本研究以提取的HPV6病毒感染人永生化角質形成細胞，若PCR方法可以測試到細胞內含有HPV6 DNA，說明HPV6病毒能在體外培養(yǎng)情況下感染人永生化角質形成細胞，證明實驗具有可行性。將抗血清按不同梯度濃度稀釋，中和病毒，使用處理后的病毒再次接觸人永生化角質形成細胞，再用PCR檢測受染細胞內病毒DNA含量，可反映抗血清是否能夠阻止HPV6吸附人永生化角質形成細胞。結果顯示，隨著免疫血清濃度的逐漸升高，HPV6 DNA條帶的光密度值度逐漸降低，即受染細胞吸附病毒DNA的量逐漸減少。與陰性血清對照相比，差異有統(tǒng)計學意義。與此同時，采用ELISA法檢測上述受中和病毒吸附于人永生化角質形成細胞的病毒L1蛋白量，亦證明抗血清濃度與L1蛋白含量間存在相反趨勢，該相反趨勢也有明顯統(tǒng)計學意義。兩種檢測實驗均顯示此種序列抗血清能一定程度上阻止HPV6病毒顆粒結合在人永生化角質形成細胞上，從而在一定程度上降解HPV6病毒的感染能力。

雖然本研究利用體外培養(yǎng)細胞的吸附抑制模型［7］，從兩個層面證明多肽抗血清對HPV6的感染能力具有一定的降解作用，但該降解作用似乎并不完整，尚未達到完全降解的效果。此外，本實驗因無法精準顯示病毒感染細胞及向胞內移動的情況，這些不足仍需采取更準確有效的實驗方法去研究處理。