烏梅丸通過調控NLRP3炎癥小體改善潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜炎癥反應及細胞焦亡

李克亞 王真權 王軍文

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院肛腸科，長沙 410005； 2.湖南中醫藥大學國際教育學院，長沙 410208）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一類主要累及結腸黏膜層的炎癥性腸病，以黏膜及黏膜下層彌漫性炎癥為特征，持續存在的炎癥反應會導致黏膜層受損并出現腹瀉、黏液膿血便、腹痛等臨床表現［1-2］。遺傳因素、環境因素、腸道微生態因素均與UC發病有關，但具體發病機制尚不清楚，臨床也缺乏有效的靶向治療手段，常用柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪等藥物有效減輕腸道炎癥、緩解UC癥狀，但缺點是服藥周期長、不良反應發生率高、易復發。

近年中醫方劑在炎癥性腸病治療中的價值受到關注，烏梅丸是出自《傷寒論》的中藥方，成分包括烏梅、當歸、桂枝、人參、干姜、附子、花椒、細辛、黃連、黃柏等，功效為緩肝調中、清上溫下［3-4］。國內一項動物實驗證實烏梅丸治療UC大鼠顯著改善疾病癥狀、減輕炎癥反應［5-6］。現代藥理學研究證實烏梅丸對肝細胞、胰島β細胞的炎癥反應具有抑制作用，且抑炎作用與抑制NOD樣受體熱蛋白結構域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體活化有關［7-8］；另有UC相關研究證實NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應和細胞焦亡在UC發展中起重要作用［9］。為進一步認識烏梅丸治療UC的價值及機制，本研究設計動物實驗觀察和分析烏梅丸調控NLRP3炎癥小體改善UC大鼠腸黏膜炎癥反應及細胞焦亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物公司，生產許可：SCXK（滬）2018-0006，實驗經湖北貝恩生物科技有限公司實驗動物倫理委員會批準［IACUC（申）-BNT-2022-008X］，過程遵循3R原則。

1.1.2 藥品與試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）購自美國Sigma公司；烏梅丸水煎液（含生藥2.88 g/ml）由湖南中醫藥大學第二附屬醫院制劑室制備，陰性對照（NC）-慢病毒（LV）、NLRP3-LV（病毒滴度2×108TU/ml）購自上海漢恒生物科技公司；IL-1β、IL-18 ELISA檢測試劑盒購自上海西唐生物科技公司；GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1、β-Tubulin特異性一抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 SD大鼠分為對照組、UC組、不同劑量烏梅丸組、NC-LV組、NC-LV+UC組、NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組、NLRP3-LV+UC+高劑量烏梅丸組。制備UC模型：經結腸灌注含50%乙醇的TNBS溶液（150 mg/kg），次日出現腹瀉、糞便中有暗紅色斑點、肛門可見出血為UC造模成功，每組8只。對照組和NC-LV組結腸灌注等劑量50%乙醇，每組8只。造模次日作為給藥第1天。低劑量、中劑量、高劑量烏梅丸組分別灌胃7.2、14.4、28.8 g/kg烏梅丸水提液，1次/d，連續14 d；對照組、UC組、NC-LV組、NC-LV+UC組給予等量生理鹽水，1次/d，連續14 d。NC-LV組、NC-LV+UC組、NC-LV+高劑量烏梅丸組、NLRP3-LV+高劑量烏梅丸組在給藥第1、7天尾靜脈注射慢病毒注射液50 μl。

1.2.2 疾病活動指數（DAI）評價 給藥后每天觀察小鼠進食、飲水、活動等一般狀況，稱重并記錄，觀察糞便性狀及便血情況，參照Harnamoto［6］標準進行DAI評分，DAI評分越高UC病情越重。

1.2.3 樣本采集及處理 給藥第14天下午過量麻醉處死大鼠，解剖小腸末端至直腸末端全部結腸，迅速用標尺檢測結腸長度，預冷生理鹽水清洗結腸、清除腸內殘留糞便，取近肛門端2 cm結腸組織放入4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋，室溫保存；剩余結腸組織吸盡水分，放入凍存管內液氮中冷凍保存。

1.2.4 HE染色檢測結腸組織病理改變及組織學評分 取各組大鼠石蠟包埋的結腸組織，制作石蠟切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察染色情況，評價結腸組織病理改變，按照下列標準進行組織學評分：中性粒細胞及淋巴細胞浸潤計0～3分，潘氏細胞和杯狀細胞脫顆粒計0～2分，上皮細胞反應計0～3分，炎癥病灶計0～3分，各項評分相加即為組織病理評分，評分越高結腸病理改變越重。

1.2.5 ELISA檢測結腸組織炎癥細胞因子 取各組大鼠液氮冷凍的結腸組織約20 mg，采用裂解液對組織進行勻漿，提取總蛋白后BCA法檢測蛋白濃度，ELISA檢測炎癥細胞因子IL-1β、IL-18濃度，計算每毫克組織蛋白中IL-1β、IL-18含量。

1.2.6 Western blot檢測結腸組織蛋白表達 取各組大鼠液氮冷凍結腸組織約20 mg，裂解液對組織進行勻漿，提取總蛋白，BCA檢測蛋白濃度。將50 μg蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電轉至硝酸纖維素膜，置于TBST溶液配制的5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入2%牛血清白蛋白配制的GSDMD-N一抗（1∶1 000稀釋）、NLRP3一抗（1∶400稀釋）、Cleaved caspase-1一抗（1∶300稀釋）、β-Tubulin一抗（1∶4 000稀釋） 4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，全自動化學發光成像系統顯影得到蛋白條帶，分析蛋白條帶灰度值，以β-Tubulin為內參，計算GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，實驗數據均為計量資料，以表示，采用單因素方差分析One-Way ANOVA進行組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量烏梅丸對UC大鼠DAI評分、結腸長度的影響 給藥第1～14天，UC組大鼠DAI評分均高于對照組（P＜0.05）；給藥第1天，不同劑量烏梅丸組大鼠DAI評分與UC組差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥第4天起，中、高兩個劑量烏梅丸組大鼠DAI評分低于UC組（P＜0.05）；給藥第7天起，低劑量烏梅丸組大鼠DAI評分低于UC組（P＜0.05）。給藥第14天處死大鼠，解剖結腸并測量長度，UC組大鼠結腸長度短于對照組（P＜0.05）；低、中、高劑量烏梅丸組大鼠結腸長度均長于UC組（P＜0.05，圖1）。

圖1 不同劑量烏梅丸對UC大鼠DAI評分、結腸長度的影響Fig.1 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on DAI score and colon length of UC rats

2.2 不同劑量烏梅丸對UC大鼠結腸病理改變的影響 對照組大鼠結腸組織HE染色可見黏膜光滑、結構完整，未見組織水腫、潰瘍形成及炎癥細胞浸潤；UC組大鼠結腸組織HE染色可見黏膜排列混亂，有潰瘍或出血表現，炎癥細胞大量浸潤，符合UC病理特征；低、中、高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織HE染色可見UC病理特征均明顯改善（圖2）。計算結腸病理組織學評分并進行組間比較，UC組大鼠組織學評分高于對照組（P＜0.05）；低、中、高劑量烏梅丸組大鼠組織學評分低于UC組（P＜0.05）。

圖2 不同劑量烏梅丸對UC大鼠結腸病理改變的影響Fig.2 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on pathological changes of colon in UC rats

2.3 不同劑量烏梅丸對UC大鼠結腸中炎癥因子含量及焦亡標志蛋白表達的影響 給藥第14天處死大鼠，解剖結腸并提取結腸組織蛋白，檢測炎癥因子IL-1β、IL-18含量及焦亡標志蛋白GSDMD-N表達，UC組大鼠結腸組織IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表達均高于對照組（P＜0.05）；低、中、高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表達均低于UC組（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同劑量烏梅丸對UC大鼠結腸炎癥因子含量及焦亡標志蛋白表達的影響Fig.3 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on contents of inflammatory cytokines and expression of pyroptosis marker protein in colon of UC rats

2.4 不同劑量烏梅丸對UC大鼠結腸NLRP3炎癥小體表達的影響 給藥第14天處死大鼠，解剖結腸并提取結腸組織蛋白，檢測NLRP3、Cleaved caspase-1表達，UC組大鼠結腸組織NLRP3、Cleaved caspase-1表達均高于對照組（P＜0.05）；低、中、高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織NLRP3、Cleaved caspase-1表達均低于UC組（P＜0.05，圖4）。

圖4 不同劑量烏梅丸對UC大鼠結腸組織NLRP3炎癥小體表達的影響Fig.4 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on NLRP3 expression inflammasome in colon of UC rats

2.5 尾靜脈注射NLRP3慢病毒對高劑量烏梅丸抑制UC大鼠結腸NLRP3炎癥小體表達的影響 給藥第14天處死大鼠，解剖結腸并提取結腸組織蛋白，檢測NLRP3、Cleaved caspase-1表達，NC-LV+UC組大鼠結腸組織NLRP3、Cleaved caspase-1表達均高于NC-LV組（P＜0.05）；NC-LV+高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織NLRP3、Cleaved caspase-1表達均低于NC-LV+UC組（P＜0.05）；NLRP3-LV+高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織NLRP3、Cleaved caspase-1表達均高于NC-LV+高劑量烏梅丸組（P＜0.05，圖5）。

圖5 尾靜脈注射NLRP3慢病毒對高劑量烏梅丸抑制UC大鼠結腸NLRP3炎癥小體表達的影響Fig.5 Effect of tail vein injection of NLRP3 lentivirus on high doses of Wu-Mei-Wan inhibiting NLRP3 inflammasome expression in colon of UC rats

2.6 過表達NLRP3對高劑量烏梅丸調節UC大鼠DAI評分、結腸長度的影響 給藥第1～14天，NCLV+UC組大鼠DAI評分均高于NC-LV組（P＜0.05）；給藥第1天，NC-LV+UC組、NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組、NLRP3-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠DAI評分與UC組差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥第4天起，NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠DAI評分低于NC-LV+UC組（P＜0.05），NLRP3-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠DAI評分高于NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組（P＜0.05）。給藥第14天處死大鼠，解剖結腸并測量長度，NC-LV+UC組大鼠結腸長度短于NC-LV組（P＜0.05）；NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠結腸長度均長于NC-LV+UC組（P＜0.05）；NLRP3-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠結腸長度均短于NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組（P＜0.05，圖6）。

圖6 過表達NLRP3對高劑量烏梅丸調節UC大鼠DAI評分、結腸長度的影響Fig.6 Effect of NLRP3 overexpression on high dose of Wu-Mei-Wan regulating DAI score and colon length of UC rats

2.7 過表達NLRP3對高劑量烏梅丸改善UC大鼠結腸病理改變的影響 HE染色可見NC-LV組大鼠結腸組織黏膜光滑、結構完整，未見組織水腫、潰瘍形成及炎癥細胞浸潤；NC-LV+UC組大鼠結腸組織黏膜排列混亂、有潰瘍或出血表現、炎癥細胞大量浸潤，符合UC病理特征；NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織病理特征明顯改善；NLRP3-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織病理特征明顯加重。計算結腸病理組織學評分，NC-LV+UC組大鼠組織學評分高于NC-LV組（P＜0.05）；NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠組織學評分低于NC-LV+UC組（P＜0.05）；NLRP3-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠組織學評分高于NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組（P＜0.05，圖7）。

圖7 過表達NLRP3對高劑量烏梅丸改善UC大鼠結腸病理改變的影響Fig.7 Effect of of NLRP3 overexpression on high doses of Wu-Mei-Wan improving pathological changes of UC rats

2.8 過表達NLRP3對高劑量烏梅丸抑制UC大鼠結腸炎癥因子含量及焦亡標志蛋白表達的影響給藥第14天處死大鼠，解剖結腸并提取結腸組織蛋白，檢測炎癥因子IL-1β、IL-18含量及焦亡標志蛋白GSDMD-N表達，NC-LV+UC組大鼠結腸組織IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表達均高于NC-LV組（P＜0.05）；NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表達均低于NC-LV+UC組（P＜0.05）；NLRP3-LV+UC+高劑量烏梅丸組大鼠結腸組織IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表達高于NC-LV+UC+高劑量烏梅丸組（P＜0.05，圖8）。

圖8 過表達NLRP3對高劑量烏梅丸抑制UC大鼠結腸中炎癥因子含量及焦亡標志蛋白表達的影響Fig.8 Effect of NLRP3 overexpression on high dose of Wu-Mei-Wan inhibiting inflammatory cytokines contents and pyroptosis marker protein expression in colon of UC rats

3 討論

UC是主要累及結腸和直腸的非特異性炎癥性腸病，病變局限于黏膜及黏膜下層，局部組織主要病理改變包括炎癥反應激活及細胞凋亡、壞死、焦亡異常等［10-11］。目前臨床治療UC的常規藥物為柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪，但受限于服藥周期長、不良反應發生率高、易復發等缺點，上述藥物治療UC的療效不盡如人意。

中醫治療有“急則治其標、緩則治其本”的臨床優勢，已成為近年治療UC的新思路，契合誘導緩解、維持緩解和預防并發癥的UC治療目標［12-14］。中醫認為UC屬于“泄瀉”“久痢”“腸癖”范疇，其發病與“濕熱”“熱毒”“痰濁”有關［15］。烏梅丸出自《傷寒論》，方中烏梅為君藥，具有澀腸止痢功效；花椒、細辛、黃連、黃柏共為臣藥，具有袪寒清熱功效；附子、干姜、桂枝、人參、當歸共為佐藥，具有養氣血、袪寒濕功效［16-17］。網絡藥理學研究及臨床研究已證實烏梅丸治療UC的積極價值，推測烏梅丸能夠針對UC的中醫病機進行袪寒清熱、澀腸止痢［18-19］。但烏梅丸治療UC的深層機制仍需進一步探索。

馬清林等［5］使用烏梅丸治療TNBS誘導的UC大鼠，結果顯示烏梅丸能夠以劑量依賴的方式減輕UC病情和病理改變，抑制腸黏膜內炎癥細胞因子生成。本研究采用相同方式建立UC模型，TNBS誘導后UC大鼠DAI水平升高且腸黏膜出現典型UC病理改變，不同劑量烏梅丸治療后DAI水平降低、腸黏膜病理改變減輕，與馬清林等［5］結果一致。表明UC造模成功且烏梅丸具有治療UC的作用，在此基礎上本研究將分析烏梅丸治療UC的分子生物學機制。

NLRP3炎癥小體參與炎癥反應及細胞焦亡調控，能夠通過細胞內結構域招募caspase-1并使其裂解為有活性的Cleaved caspase-1，后者一方面作用于IL-1β及IL-18前體，生成有活性的IL-1β及IL-18成熟體并介導炎癥反應，另一方面作用于GSDMD氨基末端生成GSDMD-N并介導細胞焦亡。臨床研究證實UC腸黏膜中NLRP3炎癥小體表達增加［20］；動物實驗證實抑制NLRP3炎癥小體顯著改善UC病理改變并減輕炎癥反應、細胞焦亡［21］。提示腸黏膜中NLPR3炎癥小體介導的炎癥反應和細胞焦亡參與UC發生發展，一方面通過IL-1β及IL-18的生物學作用引起或加重腸黏膜炎癥反應，另一方面通過GSDMD-N的生物學作用引起或加重腸黏膜焦亡，兩方面共同作用加重腸黏膜損傷，促進UC病情進展。本研究同樣在UC大鼠結腸組織中檢測到IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1表達顯著增加，與既往NLRP3炎癥小體激活參與UC發生發展的結果吻合。

現代藥理學研究證實烏梅丸具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗焦亡等活性，多項研究結果顯示烏梅丸對NLRP3炎癥小體激活及其下游炎癥反應、細胞焦亡均具有抑制作用。本研究觀察了烏梅丸治療UC過程中對NLRP3炎癥小體的調控作用，不同劑量烏梅丸治療UC大鼠后結腸組織IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1表達顯著降低，表明烏梅丸用于UC治療顯著抑制NLRP3炎癥小體激活。進一步觀察烏梅丸是否通過抑制NLRP3炎癥小體治療UC，烏梅丸灌胃同時尾靜脈注射NLRP3-LV實現NLRP3過表達，過表達NLRP3后，烏梅丸降低UC大鼠DAI水平、改善腸黏膜病理改變、抑制IL-1β、IL-18生成及GSDMD-N表達的作用均被削弱，提示烏梅丸治療UC的價值與其抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應和細胞焦亡有關。

綜上，本研究動物實驗證實了烏梅丸治療UC的價值，同時初步揭示了烏梅丸發揮治療價值的分子機制，烏梅丸抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應及細胞焦亡是其治療UC的分子機制之一。