丹酚酸B對帕金森病小鼠腸功能紊亂的保護作用及機制研究

南亞強 陶計委 周杰，2 范斐陽 蔣谷峰 朱彤 曾廣紅

（1.蘭州大學第二臨床醫學院，蘭州730050； 2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院，蘭州 730050）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是發生于中老年人群常見的神經退行性疾病，其病因與年齡、性別、種族、遺傳、環境、飲食等多項因素相關。PD臨床癥狀主要為靜止性震顫、運動徐緩、肌強直以及姿勢步態異常等經典的運動癥狀，臨床研究證實PD患者同時伴有諸多非運動癥狀，包括：情感認知缺陷、視聽嗅及軀體感知感覺異常、精神障礙、睡眠障礙、自主神經功能紊亂、胃腸道功能紊亂和膀胱功能障礙等［1］。近年諸多研究表明PD發生發展可能與包括胃腸道感染、腸道菌群失調、炎癥性腸病、小腸細菌過度生長及胃腸道黏膜免疫功能紊亂等相關的腸道炎癥（gastrointestinal inflammation，GI）密切相關［2］。國內外研究證明Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路在促進PD發生發展的病理進程中起重要作用［3-4］。

丹參是臨床用于治療PD的重要中藥材，其作為補腎活血方、復方地黃方等中藥方劑的主要成分在PD臨床治療中取得良好療效［5-7］。丹酚酸B（Salvianolic acid B，SalB）在丹參中的含量最高，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，SalB可通過抑制α-突觸核蛋白積聚、抑制小膠質細胞介導的炎癥因子釋放、降低細胞活性氧水平減輕氧化應激損傷、維持線粒體功能穩定等途徑在PD動物或細胞模型中發揮神經保護作用［8-12］。近年來研究顯示，在心肌缺血性損傷及缺血性卒中等疾病中，SalB可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發揮抗炎作用［13-14］。但SalB對PD模型小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路及腸道功能的影響尚未見報道。本研究采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrah-ydropyridine，MPTP）誘導C57BL/6小鼠構建PD動物模型，通過行為學實驗、病理及分子生物學等實驗檢測，探討SalB對MPTP誘導的PD小鼠模型的神經及腸道保護作用，并基于TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 48只雄性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體質量20～25 g，購自中國農業科學院蘭州獸研所，許可證號：SCXK（甘）2015-0001。實驗操作流程嚴格遵循中國實驗動物操作指南，經過中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院倫理委員會批準（審批編號：2021kyll089）。實驗動物在標準實驗動物房內［相對濕度：40%～60%，室溫：（23±1）℃］自由進食和飲水。

1.1.2 試劑與儀器 MPTP、SalB購于北京索萊寶科技有限公司；GAPDH、ZO-1抗體購于英國Abcam公司；TLR4抗體、酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）抗體購于美國Peprotech公司；β-actin、H3抗體、MyD88抗體、NF-κB p65抗體及HRP標記的羊抗兔二抗購于北京博奧森生物技術有限公司；p-NF-κB p65抗體購于Cell signaling technology公司；TNF-α（最低檢測濃度小于0.1 pg/ml）、CP（最低檢測濃度小于0.1 pg/ml）試劑盒購于江蘇酶標生物科技有限公司。BX51正置顯微鏡購自日本Olympus公司；SDS-PAGE電泳裝置及ChemiDocMPImaging System購于美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機購于德國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型構建 48只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（Control）、SalB對照組（SalB）、MPTP組（MPTP）、SalB治療組（MPTP+SalB），每組12只。小鼠適應環境、爬桿訓練1周后建模給藥；MPTP組及SalB治療給予30 mg/（kg·d）MPTP腹腔注射，連續5 d［15］；同時Control組、SalB組腹腔注射等量生理鹽水。造模成功后，SalB組及MPTP+SalB組小鼠腹腔注射50 mg/（kg·d）SalB，2次/d，連續7 d［10］，對照組和模型組同時腹腔注射等量生理鹽水，給藥結束后對各組小鼠進行行為學測定和腸道功能評估，并采集標本。

1.2.2 爬桿實驗 小鼠頭朝上，雙前爪放在桿頂端圓球上（高55 cm，桿直徑1 cm，圓球直徑2 cm）。小鼠從放置到頭部朝下的時間為掉頭轉彎時間，從放置頂端爬到雙后爪著地時間為爬桿總時間，3次/只，取平均值。

1.2.3 糞便含水量測定 小鼠于實驗前一晚20：00開始禁食不禁水12 h，次日上午8：00給予小鼠喂食，2 h后開始測試，小鼠按照每籠1只進行分放，2 h后收集糞便，即刻計數小鼠糞便粒數并稱重，最后將收集糞便于65 ℃烤箱中烤干稱重并計算含水量。

1.2.4 胃腸蠕動功能測定 小鼠禁食不禁水12 h，小鼠按照每籠1只分放，5%活性炭懸液10 ml/kg灌胃1次，灌胃后開始喂食并即刻計時，觀察并記錄第一粒黑色糞便排出時間。

1.2.5 取材 所有測試結束后用10%水合氯醛麻醉取材，每組取6只小鼠用4%多聚甲醛行心臟灌注固定取完整腦組織及結腸，行免疫組化實驗；每組取6只小鼠麻醉后分離包括黑質部分的中腦組織及結腸組織，行ELISA和Western blot實驗。

1.2.6 HE染色 將固定好的結腸組織進行石蠟包埋切片，切片進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，浸入蘇木素中染色20 min，流動自來水中緩慢沖洗15 min，將變藍的切片浸入酸性分化液10 s，流水清洗3 min后伊紅溶液染色3 min，流動自來水緩慢沖洗至切片變為藍色，最后純水中靜置3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.7 免疫組織化學實驗 將固定好的中腦及結腸組織進行石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后抗原修復10 min，PBS洗3次，每次3 min，內源性過氧化物酶阻斷10 min，PBS洗3次，10 min/次，非特異染色阻斷劑孵育10 min，加一抗（TH 1∶500；TLR4 1∶200） 4 ℃孵育過夜；第2天，PBS洗3次×3 min，生物素標記的羊抗小鼠/兔IgG聚合物孵育10 min，PBS洗3次×3 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶孵育10 min，顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復染，返藍，乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并采集圖像，利用Image J軟件統計分析TH染色陽性細胞數目及TLR4平均光密度。

1.2.8 ELISA檢測結腸組織腸CP及TNF-α水平按照TNF-α及CP測定試劑盒說明書進行操作。

1.2.9 Western blot檢測中腦TH、結腸TH、ZO-1、TLR4、MyD88、Nuclear NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平 取小鼠黑質部分的腦組織及小鼠結腸組織，加入含PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液勻漿后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度；SDS-PAGE電泳分離蛋白，分離膠濃度根據蛋白分子量選擇。將分離的蛋白轉移至0.22 μm的PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉120 min，相應一抗（TH 1∶1 000，TLR4 1∶500，MyD88 1∶500，p-NF-κBp65 1∶500，Nuclear NF-κB p65 1∶500，β-actin 1∶2 000，ZO-1 1∶1 000，H3 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000）4 ℃冰箱搖床孵育過夜。次日TBST清洗3次后，將目標條帶與對應種屬的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次后曝光，Image J軟件分析相應條帶灰度值。

1.2.10 結腸黏膜病理損傷評分 按照參考文獻［16］的方法對小鼠結腸黏膜病理損傷情況進行評分。

1.3 統計學處理 使用SPSS20.0、GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析，多組間均數比較采用單因素方差分析，組內進一步兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SalB對PD小鼠行為學的影響 爬桿實驗結果顯示，與Control組相比，MPTP組小鼠的轉彎時間及爬桿時間延長（P＜0.05，P＜0.05）；與MPTP組相比，MPTP+SalB組轉彎及爬桿時間縮短（P＜0.05，P＜0.05，圖1）。

圖1 各組小鼠爬桿、轉彎時間比較Fig.1 Comparison of climbing time， T-turn time of mice in each group

2.2 SalB對PD小鼠腸道功能紊亂影響 與Control組相比，MPTP組小鼠首粒黑便排出時間延長、糞便含水量減少（P＜0.05，P＜0.05）；與MPTP組相比，MPTP+SalB組首粒黑便排出時間縮短、糞便含水量增加（P＜0.05，P＜0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠首粒黑便排出時間、糞便含水量比較Fig.2 Comparison of discharge time of first black stool and water content of feces in each group

2.3 SalB對PD小鼠中腦黑質區域TH陽性神經元及TH蛋白表達水平的影響 免疫組化及Western blot結果顯示，與Control組相比，MPTP組小鼠中腦黑質區域TH陽性神經元數目減少（P＜0.05），中腦TH蛋白表達降低（P＜0.05），SalB組中腦黑質區域TH陽性神經元數目增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與MPTP組相比，MPTP+SalB組小鼠TH陽性神經元數量增多（P＜0.05），中腦TH蛋白表達增加（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠中腦黑質區域TH表達比較（×400）Fig.3 Comparison of TH expression in midbrain of mice in each group（×400）

2.4 HE染色評估PD小鼠結腸病理損傷程度 HE染色結果顯示，Control組、SalB組小鼠結腸上皮黏膜完整，黏膜表層上皮細胞內無淋巴細胞浸潤，杯狀細胞排列整齊，無水腫、潰瘍，隱窩結構規則，無分支、扭曲及萎縮；MPTP組小鼠結腸上皮細胞黏膜破壞，局部水腫、潰爛，腸屏障完整性受損，黏膜表層大量炎癥細胞浸潤，腺體細胞排列不規則，隱窩結構不規則，局部扭曲，萎縮；MPTP+SalB組小鼠結腸上皮細胞黏膜水腫、潰爛較MPTP組減輕。MPTP組結腸黏膜病理損傷評分高于Control組（P＜0.05）；與MPTP組相比，MPTP+SalB組結腸黏膜病理損傷評分顯著下降（P＜0.05，圖4）。

圖4 結腸HE染色結果及結腸黏膜病理損傷評分（×200）Fig.4 HE staining and pathological score of colon （×200）

2.5 SalB對PD小鼠結腸CP及TNF-α表達水平的影響 ELISA結果顯示，與Control組相比，MPTP組小鼠結腸CP和TNF-α水平均升高（P＜0.05，P＜0.05）；與MPTP組相比，而MPTP+SalB組小鼠結腸CP、TNF-α含量均顯著下降（P＜0.05，P＜0.05，圖5）。

圖5 小鼠結腸CP和TNF-α比較Fig.5 Comparison of expression levels of CP and TNF-α in colon of mice

2.6 SalB對PD小鼠結腸ZO-1及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達水平的影響 免疫組化結果顯示：與Control組相比，MPTP組小鼠結腸TLR4陽性細胞數量明顯增加（P＜0.05），SalB治療后結腸TLR4陽性細胞數量顯著下降（P＜0.05）。Western blot結果顯示，與Control組相比，MPTP組小鼠結腸ZO-1蛋白表達下降，結腸TLR4、MyD88、Nuclear NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表達均明顯增加（均P＜0.05）；與MPTP組比較，MPTP+SalB組小鼠結腸ZO-1蛋白表達增加，結腸TLR4、MyD88、Nuclear NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表達均明顯減少（均P＜0.05，圖6）。

圖6 各組結腸ZO-1及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（×400）Fig.6 Comparison of expressions of ZO-1 and TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway related proteins in colon （×400）

3 討論

PD是與年齡密切相關的難以治療的神經退行性疾病，其發病機制尚不明確，目前各種治療措施僅能改善或緩解臨床癥狀，尚無有效藥物阻止或延緩其病理進展。中醫學理論認為PD的基本病機為肝腎陰虛、肝風內動、筋脈失養，治療應以補益肝腎、調補氣血配伍活血化瘀為主，因丹參具有通絡止痙，滋補肝腎的功效，諸多治療PD的經方中均配伍丹參［17］。SalB是丹參中含量豐富，生物活性最強的水溶性化合物，《中國藥典（2015版）》將SalB確定為鑒定丹參品質的標志成分。SalB可通過抗炎、抗氧化、調節腸道菌群等多種途徑對神經退行性疾病發揮神經保護作用［18-19］。基于腦-腸軸防治PD是近年的研究熱點，腸道和大腦之間存在雙向的生物信息交流，胃腸道的生理功能受局部腸神經系統（enteric nervous system，ENS）和中樞神經系統調控，同時腸內產生的神經遞質、免疫信號分子、激素和神經肽反過來又會影響大腦［20-21］。本研究觀察到腹腔注射SalB可以顯著縮短MPTP誘導的PD小鼠爬桿時間及轉頭時間，緩解了PD小鼠的運動功能障礙；同時SalB有效減少了首粒黑便排出時間，提高了糞便含水量，緩解了PD小鼠胃腸排空延遲及便秘等腸道功能障礙，SalB對MPTP誘導的PD模型的運動功能障礙及胃腸功能障礙具有改善作用。

PD運動癥狀主要為黑質多巴胺能神經元變性致使紋狀體內多巴胺（Dopamine，DA）水平降低而導致，而TH是DA合成的限速酶［22］。本研究發現PD模型組小鼠中腦黑質TH陽性細胞數量顯著減少，TH蛋白含量明顯下降，SalB促進了PD小鼠黑質殘存DA神經元胞內TH的表達，說明SalB可有效減少PD小鼠黑質部多巴胺能神經元變性丟失，對MPTP誘導的PD小鼠具有神經保護作用。腸道中的ENS、腸黏膜上皮細胞等可產生DA，腸道肌層、肌間神經叢以及上皮細胞中均分布有DA受體，腸道中的TH是腸道內DA、去甲腎上腺素等兒茶酚胺類活性物質合成的關鍵酶，腸道內兒茶酚胺類活性物質水平的下降可引起結腸動力功能障礙［23］。本研究發現SalB有效抑制了PD小鼠結腸組織中TH蛋白表達水平下降，改善了PD小鼠的胃腸功能障礙，對PD小鼠具有腸道保護作用。

腸屏障功能紊亂、GI、腸道微生物紊亂及腸道內微生物代謝產物均影響PD的病理生理過程腸黏膜屏障缺陷使得腸通透性增加，導致了PD腸道炎癥發生，腸道炎癥是PD發生發展的重要推手，PD患者中樞及外周TNF-α、IL-6等促炎因子均呈高表達，糞便及腸道中CP升高被視為PD早期階段腸道免疫系統激活的重要指標［24-25］；緊密連接是血腦屏障、腸黏膜屏障等主要組織黏膜屏障的重要結構，ZO-1作為跨膜蛋白與其同源體ZO-2、ZO-3是構成腸緊密連接的主要成分［26］。本研究通過對PD模型小鼠結腸進行HE染色、結腸黏膜病理損傷評分發現小鼠腸黏膜存在明顯病理性改變，PD小鼠腸道黏膜炎癥細胞聚集，腸黏膜水腫、潰爛，腸黏膜失去完整性，黏膜損傷評分顯著增加，進一步免疫印跡實驗證實PD小鼠結腸組織ZO-1蛋白表達明顯減少、結腸組織CP及TNF-α含量升高，SalB明顯減輕上述病理損傷，表明SalB可通過保持腸黏膜屏障完整性、減輕GI反應等腸道病理損傷發揮對PD小鼠的腸道保護作用。

TLR4/MyD88/NF-κB信號通路是機體重要的炎癥信號通路，GI導致的腸黏膜屏障破壞及腸黏膜屏障破壞后導致通透性增加引起更為嚴重的炎癥反應，尤其是腸道內TNF-α、脂多糖等激活TLR4相關信號通路，TLR4激活后可通過MyD88依賴性通路或MyD88非依賴性通路激活下游NF-κB，促進NF-κB活化并發生核轉移，活化后的NF-κB最終需轉移至細胞核進一步啟動炎癥因子的合成釋放，TNF-α、IL-1β等促炎因子是NF-κB主要下游信號因子，而腸道促炎因子又可以通過放大炎癥效應進一步正反饋作用于TLR4/MyD88/NF-κB炎癥通路，TLR4在PD患者結腸也呈高表達狀態［4，27-28］。本研究發現SalB對正常生理狀態下的TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白無顯著影響，MPTP誘導的PD模型腸道組織中TLR4被激活，其下游分子信號蛋白MyD88高表達，進一步促進NF-κB活化，總的活化NF-κB p65包括Nuclear NF-κB p65和p-NF-κB p65，p-NF-κB p65作為NF-κB活化過程中的一種中間形態，活化后的NF-κB最終轉移至細胞核，SalB顯著降低了炎癥級聯效應相關的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的蛋白水平，具體為信號通路中TLR4和MyD88 蛋白含量均減低，p-NF-κB p65磷酸化水平降低，Nuclear NF-κB p65核穿梭減少。本研究表明SalB可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號轉導對PD發揮腸道保護作用，其機制可能包括：SalB可能直接或間接抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的信號轉導，SalB直接或間接抑制了TLR4/MyD88/NF-κB通路中分子蛋白表達或NF-κB磷酸化、NF-κB核穿梭，從而直接或間接發揮抗炎作用；此外，SalB可能通過提高腸黏膜屏障而改善GI反應，降低了腸道內TNF-α等TLR4的配體水平，從而緩解了TLR4的激活，使得下游相關分子信號處于靜息狀態。SalB可通過增強組織細胞抗氧化應激抑制腸道炎癥反應，氧化應激與炎癥反應相輔相成［29］。因此，SalB抑或通過影響氧化應激系統相關的其他生物信號通路改善了GI，SalB除下調TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白表達外，還可能存在其他多靶點效應。

綜上，SalB對MPTP誘導的PD模型小鼠具有神經及腸道雙重保護作用；SalB能夠維持腸黏膜屏障完整性、緩解GI反應，可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。