補體C1s對食管鱗狀細胞癌生物學行為的影響

任玲 陳昱伶 徐鳳敏 蒙春梅 李倩倩 胡為民 （川北醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，南充 637100）

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第7位和第6位［1］。EC可分為兩種常見的病理類型，即食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。我國EC的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第3位，且絕大多數(shù)病例（＞90%）為ESCC［2］。盡管多年來人們針對ESCC的防治做了大量工作，但其發(fā)病率和病死率仍居高不下［3］。因此，還需要更多的研究去探索ESCC進展的分子機制，以及確定新的關(guān)鍵生物標志物和潛在的治療靶點。

早期研究表明補體的激活可能有助于裂解腫瘤細胞［4］。然而，近些年越來越多的證據(jù)表明補體不僅不能抑制腫瘤，反而會促進腫瘤的發(fā)展。腫瘤細胞產(chǎn)生的一些補體成分，如C1q、C3、C5a、補體因子B和因子Ⅰ等被報道具有促腫瘤作用［5-7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）/1型1-磷酸鞘氨醇受體（sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1PR1）信號通路與ESCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。通過有參轉(zhuǎn)錄組高通量測序發(fā)現(xiàn)過表達S1PR1可上調(diào)ESCC細胞Eca-109C1S mRNA表達［9］。本研究將進一步探究C1s對ESCC細胞增殖、遷移、細胞-基質(zhì)黏附以及裸鼠移植瘤生長的影響，為ESCC發(fā)生發(fā)展機制和治療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性BALB/c裸鼠（4～6周齡，體質(zhì)量14～16 g）28只，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010，于川北醫(yī)學院實驗動物中心SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進食、飲水。動物實驗設施許可證號：SYXK（川）2018-076。動物處理方法符合中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。實驗經(jīng)川北醫(yī)學院倫理委員會批準（倫理審批號：NSMC202181）。

1.1.2 主要試劑 ESCC細胞TE-1、Eca-109和KYSE-150均購自中國科學院細胞庫；胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；青霉素和鏈霉素購自HyClone公司；胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）購自四季青公司；無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid-free bovine serum albumin，F(xiàn)AF-BSA）購自Sigma公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒購自Promega公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒購自TaKaRa Bio公司；ELISA試劑盒購自武漢菲恩公司；C1s抗體購自Abcam公司；MMP1和MMP13抗體購自Proteintech公司；β-actin抗體和CCK-8檢測試劑盒購自碧云天公司；CD34抗體購自ServiceBio公司；引物由Sangon Biotech公司合成；特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）由吉瑪公司合成；短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）質(zhì)粒的構(gòu)建、C1s過表達慢病毒及陰性對照慢病毒載體的構(gòu)建和病毒包裝由吉凱基因公司完成；篩選藥物G418、嘌呤霉素和纖連蛋白均購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 所有細胞均采用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2孵箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA/shRNA的轉(zhuǎn)染和慢病毒感染 根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將C1s siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染ESCC細胞。C1s siRNA1正向序列：5'-GGUAGAGUUUGAUCAUAGAdTdT-3'，反向序列：5'-UCUAUGAUCAAACUCUACCUC-3'；C1s siRNA2正向序列：5'-GAUCCGAUGCAGAUAUUAAdTdT-3'，反向序列：5'-UUAAUAUCUGCAUCGGAUCCU-3'；NC siRNA正向序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'，反向序列：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'。使用LipofectamineTM2000將C1s shRNA和NC shRNA分別轉(zhuǎn)染TE-1細胞，用G418篩選穩(wěn)定株細胞。C1s shRNA靶序列：5'-GCAAGTCCCAATTATCCCAAA-3'；NC shRNA靶序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。根據(jù)慢病毒使用手冊進行Eca-109細胞慢病毒感染，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株細胞。本次所用的慢病毒包括C1s過表達慢病毒（C1s OE）以及對照慢病毒（Control）。RT-qPCR和Western blot驗證C1s敲低和過表達的效率。

1.2.3 細胞生物信息學分析 利用NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫分析ESCC組織與癌旁正常組織（adjacent normal tissues，ANTs）中補體的表達，并比較ESCC組織與ANTs中C1S mRNA的表達差異。本次所用數(shù)據(jù)來自NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫的GSE20347［10］。

1.2.4 RT-qPCR檢測C1S和HPRT mRNA水平按照說明書抽提細胞總RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。以合成的cDNA為模板進行qPCR反應，檢測C1S和HPRT mRNA水平。使用2-ΔΔCt方法對數(shù)據(jù)進行分析。C1s正向引物：5'-CTCCTGAGCATGTGTTTA-3'，反向引物：5'-CAGTGCAATGTCATTATCAA-3'；HPRT正向引物：5'-TGAGGATTTGGAAAGGGTGT-3'，反向引物：5'-GAGCACACAGAGGGCTACAA-3'。

1.2.5 Western blot分析 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白質(zhì)并檢測蛋白濃度。用蛋白上樣緩沖液變性蛋白質(zhì)后，使用8%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用5%BSA-TBST室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗∶C1s（1∶1 500）、MMP1（1∶1 000）、MMP13（1∶500）和β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST漂洗后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）抗體（1∶1 000）于室溫孵育70 min。TBST漂洗后滴加適量ECL反應工作液，用化學發(fā)光凝膠成像儀進行顯影成像。

1.2.6 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中C1s表達 將ESCC細胞接種于12孔板，12 h后，更換含有0.1%FAF-BSA的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液。48 h后。收集細胞培養(yǎng)上清液并計數(shù)細胞。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測OD450值。結(jié)合標準曲線和細胞數(shù)計算每1×105個細胞產(chǎn)生的細胞外C1s平均水平，并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞的增殖能力 將5×103個/孔ESCC細胞接種于96孔板。根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別進行C1s siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后第0、1、2、3天，每孔加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，檢測OD450值。穩(wěn)定細胞株的增殖實驗除了沒有轉(zhuǎn)染步驟，其余步驟同上。

1.2.8 細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力 將ESCC細胞接種于12孔板，24 h后其匯合度達到90%左右時，使用200 μl槍頭進行劃痕。更換含0.1%FAF-BSA的RPMI1640培養(yǎng)液并使用倒置顯微鏡進行0 h拍照。根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別進行C1s siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后的48 h（TE-1）或72 h（Eca-109）拍照并計算細胞遷移率。穩(wěn)定細胞株的細胞劃痕實驗除了沒有轉(zhuǎn)染步驟，其余步驟同上。

1.2.9 細胞-基質(zhì)黏附的檢測 向96孔板加入10 μg/ml纖連蛋白于4 ℃包被過夜。PBS洗滌后，用1%BSA在37 ℃下封閉1 h。用RPMI1640培養(yǎng)液將ESCC細胞重懸，并以2×104個/孔接種于96孔板中，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌后，采用0.1%結(jié)晶紫染色貼壁細胞30 min。去除多余的染料，采用100 μl 10%乙酸溶解細胞內(nèi)染料，檢測OD595nm值。

1.2.10 裸鼠皮下成瘤實驗 將28只雌性BALB/c裸鼠隨機分為4組：TE-1-C1s shRNA組、TE-1-NC shRNA組、Eca-109-C1s OE組和Eca-109 Control組。將TE-1-C1s shRNA/TE-1-NC shRNA 細胞（3×106個/100 μl PBS），或 Eca-109-C1s OE/Eca-109-Control細胞（2×106個/100 μl PBS）進行裸鼠右腋下皮下注射。每3 d測量1次腫瘤的最長直徑（a）和最短直徑（b），并計算腫瘤體積：V=0.5×a×b2。實驗結(jié)束后，剝離腫瘤組織，測量腫瘤體積和重量并進行拍照。腫瘤組織進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和CD34的免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色，以腫瘤血管內(nèi)皮細胞膜呈現(xiàn)棕黃色為陽性，在顯微鏡下計數(shù)CD34陽性微血管評估每個腫瘤組織的微血管密度。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用表示。所有實驗重復3次。采用兩樣本t檢驗進行兩組數(shù)據(jù)間的比較，而多組數(shù)據(jù)間的比較則采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 C1s在人ESCC組織中的表達 利用來自GEO-GSE20347的數(shù)據(jù)繪制熱圖以此描繪ESCC組織和ANTs組織中補體成分的表達情況（圖1A）。結(jié)果顯示相對高表達的補體分子主要集中參與早期補體途徑的分子中，尤其是C3和經(jīng)典途徑成分（C1QA、C1QB、C1R、C1S、C4A和C2），而末端通路成分C8A、C8B和C9的表達量相對較低。此外，ESCC組織中C1S mRNA的表達明顯高于ANTs（P＜0.001，圖1B）。

圖1 C1s在人ESCC組織中的表達Fig.1 C1s expression in human ESCC tissues

2.2 C1s在人ESCC細胞系中的表達 RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示C1s在3種ESCC細胞系中均有表達，且在TE-1細胞中表達最高（圖2A～2C）。但包括C1s過表達細胞在內(nèi)的所有細胞培養(yǎng)上清液中C1s的表達水平都很低（圖2D～2F）。

圖2 C1s在人ESCC細胞系中的表達Fig.2 C1s expression in human ESCC cell lines

2.3 敲低或過表達C1s的效率驗證 TE-1和Eca-109細胞轉(zhuǎn)染C1s siRNA后，C1s表達均明顯降低（圖3A、3B）。在C1s敲低的TE-1穩(wěn)定細胞株中，C1s表達明顯降低（圖3C）。在C1s過表達的Eca-109穩(wěn)定細胞株中，C1s表達明顯增加（圖3D）。

圖3 敲低或過表達C1s的效率驗證Fig.3 Efficiency validation of knockdown or overexpression of C1s

2.4 C1s對ESCC細胞增殖的影響 CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，TE-1和Eca-109細胞轉(zhuǎn)染C1s siRNA后細胞增殖均受到抑制（P＜0.05，圖4A、4B），C1s敲低的TE-1穩(wěn)定細胞株增殖能力也明顯下降（P＜0.01，圖4C），而C1s過表達的Eca-109細胞株增殖能力增強（P＜0.05，圖4D）。結(jié)果表明C1s促進ESCC細胞增殖。

圖4 C1s對ESCC細胞增殖的影響Fig.4 Effects of C1s on proliferation of ESCC cells

2.5 C1s對ESCC細胞遷移的影響 細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，TE-1和Eca-109細胞轉(zhuǎn)染C1s siRNA后細胞遷移率明顯降低（P均＜0.001，圖5A、5B），C1s敲低的TE-1穩(wěn)定細胞株遷移率也明顯降低（P＜0.001，圖5C），而C1s過表達的Eca-109細胞株遷移率升高（P＜0.001，圖5D）。結(jié)果表明C1s促進ESCC細胞的遷移。

圖5 C1s對ESCC細胞遷移的影響Fig.5 Effects of C1s on migration of ESCC cells

2.6 C1s對ESCC細胞-基質(zhì)黏附的影響 細胞-基質(zhì)黏附實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，C1s敲低的TE-1穩(wěn)定細胞株細胞-基質(zhì)黏附受到明顯抑制（P＜0.001，圖6A），而C1s過表達的Eca-109細胞株細胞-基質(zhì)黏附明顯增強（P＜0.001，圖6B）。結(jié)果表明C1s增強ESCC細胞-基質(zhì)黏附。

圖6 C1s對ESCC細胞-基質(zhì)黏附的影響Fig.6 Effects of C1s on cell-matrix adhesion of ESCC cells

2.7 C1s敲低或過表達后ESCC細胞中MMP1和MMP13的改變 在C1s敲低的TE-1細胞中檢測到MMP1和MMP13的蛋白水平降低（圖7A、7B）。在C1s過表達的Eca-109細胞中MMP1和MMP13的蛋白水平無明顯變化（圖7C、7D）。

圖7 C1s敲低或過表達后ESCC細胞中MMP1和MMP13的改變Fig.7 Alterations of MMP1 and MMP13 in ESCC cells after C1s knockdown or overexpression

2.8 敲低C1s對TE-1細胞在裸鼠皮下生長的影響 裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示，C1s敲低組的腫瘤形成率為57%，明顯小于對照組（100%，圖8A、8B）。C1s敲低組的腫瘤體積小于對照組（P＜0.05，圖8C、8D），但兩組腫瘤重量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖8E）。結(jié)果表明敲低C1s可抑制TE-1細胞在裸鼠皮下的腫瘤形成率。

圖8 敲低C1s對TE-1細胞在裸鼠皮下生長的影響Fig.8 Effects of knockdown of C1s on growth of TE-1 cells subcutaneously in nude mice

2.9 過表達C1s對Eca-109細胞在裸鼠皮下生長的影響 C1s過表達組和對照組的腫瘤形成率均為100%。在對照組的7個腫瘤中有4個發(fā)生壞死，而在C1s過表達組中并未出現(xiàn)此現(xiàn)象（圖9A、9B）。C1s過表達組的腫瘤體積明顯大于對照組（P＜0.001，圖9C、9D）。C1s過表達組的腫瘤重量為（1.260 0±0.179 6） g，明顯大于對照組的腫瘤重量（0.723 1±0.276 8） g（P＜0.01，圖9E）。此外，在C1s過表達組的腫瘤中CD34陽性血管的密度明顯高于對照組（圖9F、9G）。結(jié)果表明過表達C1s明顯促進Eca-109細胞在裸鼠皮下的生長。

圖9 過表達C1s對Eca-109細胞在裸鼠皮下生長的影響Fig.9 Effects of overexpression of C1s on growth of Eca-109 cells subcutaneously in nude mice

3 討論

在腫瘤組織中有許多細胞可以產(chǎn)生補體，包括免疫細胞、內(nèi)皮細胞以及惡性腫瘤細胞［4，11-13］。在大多數(shù)情況下，腫瘤細胞產(chǎn)生的補體主要為C1s、C1r、C2、C3和C4等，稱為補體富集現(xiàn)象［14］。在ESCC中也存在補體富集現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)在ESCC組織樣本中，參與早期補體激活通路的補體分子（C1QA、C1QB、C1R、C1S、C4A和C2）表達水平較高，而參與終末通路的補體分子（C8A、C8B和C9）表達水平卻相對較低。這說明終末通路的補體分子不太可能參與ESCC的生物學過程。

C1（C1qC1r2C1s2）復合物是補體經(jīng)典激活途徑的核心分子，C1s是C1復合物的重要組成。C1s酶原是由688個氨基酸組成的單鏈多肽。活化后的C1s則轉(zhuǎn)變?yōu)橛搔伶満挺骆溄M成、二硫鍵連接的雙鏈結(jié)構(gòu)，且這兩個片段的分子量之和近似于C1s酶原的分子量，因此C1s的活化不存在大的肽丟失［15］。C1s是一種絲氨酸蛋白酶，與其他補體蛋白酶一樣，C1s具有底物特異性并與補體系統(tǒng)的其他成分具有特定的相互作用。除了裂解C4和C2，C1s還可降解細胞外基質(zhì)成分，如MHCⅠ類分子、1型明膠和2型膠原蛋白、核心蛋白聚糖和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5［14，16］。因此，C1s還可參與多種其他生理病理反應，如炎癥和腎纖維化［17］。本研究對GEO數(shù)據(jù)庫中ESCC微陣列表達譜數(shù)據(jù)進行了分析，結(jié)果顯示ESCC組織中檢測到C1S mRNA表達，且表達量明顯高于ANTs。C1s可能在ESCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

本課題組通過細胞功能實驗和裸鼠皮下成瘤實驗證實C1s可以有效促進ESCC細胞的增殖、遷移和細胞-基質(zhì)黏附，且C1s在ESCC細胞外表達水平很低。C1s在ESCC中可能發(fā)揮著一種促腫瘤且獨立于補體級聯(lián)反應的非典型功能，該功能可能僅限于在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，而與細胞外的C1s無關(guān)。在其他一些癌癥中也有報道過C1s的非典型功能，如皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）和透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）［14，18］。在ccRCC中沉默C1s可抑制細胞增殖，但在上清液中添加純化的C1s酶原或酶時，卻不能對其增殖活力產(chǎn)生影響［14］。這些報道與本次實驗結(jié)果共同說明C1s在腫瘤細胞內(nèi)的非典型功能可能與胞外C1s的水平無關(guān)。此外，與C1s過表達組相比，對照組出現(xiàn)多個移植瘤的壞死，且移植瘤中CD34陽性微血管的密度明顯更低。C1s可能與ESCC腫瘤微血管形成有關(guān)。有研究表明，在cSCC細胞中敲除C1s后，腫瘤微血管形成就受到抑制［18］。由于細胞外檢測到的C1s濃度很低，故C1s可能不直接參與腫瘤微血管形成，而是通過上調(diào)其他促血管生成因子的表達參與腫瘤微血管形成。

最近有研究報道，敲除C1r可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1和MMP13表達，并抑制cSCC細胞的侵襲［19］。C1r可激活C1s，并且它們之間存在復雜且相互依存的關(guān)系。因此，C1s也可能與MMP1和MMP13具有相關(guān)性。MMP1和MMP13在ESCC中起促腫瘤進展作用［20-21］。本次結(jié)果表明，敲低C1s可抑制TE-1細胞中MMP1和MMP13表達，這表明C1s在TE-1細胞中的生物學功能可能涉及MMP1和MMP13。在C1s過表達的Eca-109細胞中MMP1和MMP13蛋白水平無明顯改變，可能由于細胞系的不同，其下游途徑有所差異。此外，有研究道，在cSCC細胞中敲低C1s后，PI3K和ERK1/2信號通路活性受到抑制［18］。在ESCC中PI3K和ERK1/2信號通路也與MMP密切相關(guān)，MMP1可通過激活PI3K途徑促進ESCC細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［20］；MMP13受ERK1/2水平的調(diào)節(jié)，從而促進ESCC細胞的遷移和侵襲［22］。另外，在口腔鱗癌細胞中ERK1/2-MMP1軸也與細胞遷移和侵襲密切相關(guān)［23］。PI3K和ERK1/2通過調(diào)節(jié)其下游靶標影響細胞的存活、增殖、分化和轉(zhuǎn)移，并與癌癥的發(fā)生緊密相關(guān)［24-25］。C1s在ESCC中促腫瘤效應的下游機制可能涉及對PI3K和ERK1/2信號通路以及MMP表達的調(diào)節(jié)。

綜上所述，補體C1s在ESCC組織中高表達，并可促進ESCC細胞的增殖、遷移和細胞-基質(zhì)黏附，從而在ESCC進展中起促進作用。C1s參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的具體機制有待進一步研究。