BRCA2基因在免疫殺傷肺癌細胞中的作用及機制研究

張群貴 賴劍平 李曉靜 黃立 （贛州市腫瘤醫院，贛州 341000）

肺癌是高發惡性腫瘤。在我國，每年新增肺癌患者約73萬例，病死患者達到61萬［1］。手術切除腫瘤，并給予放化療的治療策略是主要治療手段，對早期患者療效較好，但是對晚期轉移及復發患者療效甚微［1-2］。靶向藥物及免疫療法如免疫細胞治療是新興療法，在部分腫瘤患者群中取得較好效果［2-3］。然而，腫瘤細胞通過降低表面抗原水平、突變基因位點、表觀遺傳修飾、干預DNA損傷修復等方式逃避免疫及藥物殺傷，產生耐受［4-6］。其中，DNA損傷修復異常是臨床上腫瘤耐藥的重要機制。腫瘤細胞通過激活DNA損傷修復信號抵消藥物治療引起的DNA損傷［6-7］。聯合給予DNA損傷修復抑制劑可顯著改善腫瘤耐藥情況。BRCA2是DNA修復相關基因，乳腺癌中BRCA2突變后，對靶向藥物治療更敏感［8］。研究報道BRCA2在肺癌組織中也發生突變，并且提高肺癌細胞對DNA修復靶向藥物的敏感性［9］。然而，BRCA2對免疫細胞殺傷肺癌的影響是什么？分子機制是什么？本研究在細胞水平驗證BRCA2敲減后，免疫細胞對肺癌細胞的殺傷作用及在分子水平探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖培養基DMEM（KGM12800N-500）、胎牛血清（KGL3002）、青霉素/鏈霉素（KGY0023）購于江蘇凱基生物；siRNA（G2210031）購于通用生物系統（安徽）有限公司；SYBR Green染料（D7260）、RNA提取試劑盒（R0026）、cDNA第一鏈合成試劑盒（D7168S）、CCK-8試劑（C0037）、MTT溶液（ST1537）、lipo8000（C0533）、SDS-PAGE制膠試劑盒（P0012A）均購于上海碧云天生物公司；pCDHGFP質粒（ry-lvp001）、GFP慢病毒（ry-lv001）、肺癌細胞系A549（ry-cl-1）、H1299（ry-cl-2）、H464（ry-cl-3）、H1975（ry-cl-4）、BEAS2B（ry-cl-5）購于上海冉研生物科技有限公司；ECL超敏試劑盒（P0018S）、蛋白提取試劑盒（P0013M）購于上海翊圣生物科技；外周血單個核淋巴細胞（B230470）購于明舟生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及siRNA處理 肺癌細胞以高糖DMEM培養基培養，顯微鏡下觀察細胞并更新培養基，覆蓋度達到95%以上時以0.05%胰酶消化，1 200 r/min離心5 min，收集細胞，然后以新鮮培養基重懸，在37 ℃、5%CO2條件下按照1∶3分瓶傳代培養。

取狀態較好的細胞，提前24 h鋪于培養板或培養孔中，取50 pmol siRNA，以無血清培養基稀釋，加入適量lipo8000，充分混勻，室溫靜置30 min，以移液器逐滴加入準備的細胞中，繼續培養4～6 h后，更換新鮮培養基，繼續培養48 h后，收集細胞開展后續實驗。

1.2.2 熒光定量PCR擴增實驗 以試劑盒提取細胞總RNA，定量并以0.5 μg總RNA反轉錄合成cDNA的第一鏈，取1 μl合成的cDNA第一鏈為模板，以SYBRGREEN染料法定量擴增，反應程序為：95 ℃5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s，40個周期。以β-actin為內參。

1.2.3 細胞增殖實驗 按照4 000個/孔接種肺癌細胞100 μl于96孔培養板中，每24 h加入10%總體積的CCK-8試劑，繼續孵育1～4 h后，酶標儀檢測450 nm波長吸光度，參考對照組計算細胞增殖率。

1.2.4 細胞殺傷實驗 以GFP慢病毒按照MOI=10感染A549與H1299細胞，培養72 h后，在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光表達分布與強度，判斷慢病毒感染效率，獲得穩定表達GFP的靶細胞。取指數生長狀態的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）與表達GFP的靶細胞，按照1∶1、3∶1、6∶1共培養24 h，采用酶標儀檢測GFP熒光強度，判斷PBMC對肺癌細胞的殺傷效率。

1.2.5 Western blot實驗 離心收集處理的肺癌細胞，以蛋白試劑盒提取總蛋白，以12%SDS-PAGE電泳分離總蛋白，然后轉印至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉PVDF膜室溫1 h，加入目的蛋白抗體并于4 ℃孵育過夜，置換HRP標記的抗體室溫孵育1 h，以ECL超敏試劑盒曝光檢測目標蛋白條帶。以GAPDH蛋白為內參，分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。抗體信息如下：抗ATM抗體（AF1399，稀釋比例1∶4 000）、抗RAD51抗體（AF7860，稀釋比例1∶1 000）、抗RAD50抗體（AF7857，稀釋比例1∶2 000）、抗P53抗體（AF7671，稀釋比例1∶5 000）、抗BRCA2抗體（AF6342，1∶1 000）、抗GAPDH抗體（AF1186，稀釋比例1∶5 000）及HRP標記的羊抗鼠抗體（A0216，1∶1 000）、鼠抗兔抗體（A0208，1∶1 000）。

1.3 統計學分析 本研究中數據采用SPSS11.0軟件分析，兩組間比較采用Student'st檢驗，三組以上數據比較采用One-way ANOVO分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BRCA2基因在肺癌細胞中被成功敲減 如圖1A～C，BRCA2基因在常見的肺癌細胞系中呈現中豐度表達。在A549及H1299細胞中，BRCA2基因mRNA表達量和蛋白表達量較H1975及H464細胞中高（P＜0.05）。如圖1D，BRCA2基因mRNA表達量比對照組降低超過50%，表明BRCA2基因在A549及H1299細胞中被成功敲減。

圖1 BRCA2基因被成功敲減Fig.1 BRCA2 gene is successfully knocked down

2.2 敲減BRCA2促進肺癌細胞生長 如圖2A、B，CCK-8實驗表明敲減BRCA2基因72 h后，肺癌細胞A549增殖率比對照組提高近30%，H1299細胞增殖率是對照組的1.8倍。MTT法檢測進一步證實BRCA2敲減后，A549與H1299細胞增殖率均比對照組顯著增強（圖2C、D）。

圖2 BRCA2基因調控肺癌細胞增殖Fig.2 BRCA2 gene regulates cell proliferation

2.3 敲減BRCA2的肺癌靶細胞株構建 如圖3A，感染攜帶GFP的慢病毒72 h后，A549細胞表達GFP熒光效率在95%以上，H1299細胞中GFP表達效率也超過95%。表明成功構建表達GFP蛋白的肺癌細胞株。以BRCA2基因2#有效siRNA靶點轉染該細胞株，Western blot結果表明BRCA2蛋白表達量被分別降低82%、59%（圖3B、C）。

圖3 表達GFP的肺癌靶細胞株構建Fig.3 Construction of lung cancer cells expressing GFP protein

2.4 敲減BRCA2提高單核細胞對肺癌細胞的殺傷效率 如圖4A，PBMC與靶細胞A549共培養24 h后，敲減BRCA2基因組的熒光強度分別為3 986、674、722，而對照組熒光強度分別為9 247、6 070、3 104。PBMC與靶細胞H1299共培養24 h后，敲減組的熒光強度分別為3 771、1 026、679，而對照組熒光強度分別為8 326、5 196、3 596（圖4B）。

圖4 敲減BRCA2提高PBMC殺傷效率Fig.4 BRCA2 knockdown increases killing efficacy of PBMC

2.5 BRCA2調控ATM信號 如圖5，敲減肺癌A549細胞中BRCA2基因后，ATM基因表達量比對照組降低75.4%。DNA損傷修復相關基因RAD51、RAD50表達量分別比對照組降低26.9%、26.7%，而P53表達量卻是對照組的7.2倍。該數據表明ATM信號可能是BRCA2干預的關鍵信號通路。

圖5 BRCA2調控ATM信號通路分子表達Fig.5 BRCA2 regulates expression of members in ATM signaling pathway

3 討論

肺癌是高發惡性腫瘤，每年導致數十萬人死亡。手術切除結合放化療是臨床主要治療策略，對早期患者療效較好，但是對轉移以及復發患者無顯著效果［1-2］。主要原因為對肺癌發病誘因及信號機制缺乏了解。BRCA2是DNA損傷修復相關基因，最早發現在乳腺癌患者中發生BRCA2突變［8］。文獻資料表明在肺癌患者中也檢測到BRCA2基因突變并且與肺癌臨床病理相關［9］。本研究發現降低BRCA2基因表達后，肺癌細胞生長能力增強。這與文獻資料數據一致，即BRCA2在多個類型腫瘤中發揮癌癥抑制因子的作用。如在乳腺癌中BRCA2突變后，癌細胞侵襲性及生長能力均顯著提高［8］。在腦腫瘤中，干擾BRCA2基因表達后，癌細胞生長更旺盛［10］。然而，BRCA2表達降低后，癌細胞對化療藥物敏感性增強，有助于提高化療療效［8］。例如，BRCA2突變提高胰腺癌對順鉑的敏感性，PARP抑制劑對乳腺癌療效更強［11-12］。深入研究發現BRCA2功能異常導致DNA損傷修復系統失調，無法修復化療藥物誘導的癌細胞DNA損傷，誘發癌細胞凋亡［13-14］。因此，兩種不同機制的藥物聯合對腫瘤臨床治療可能起到事半功倍的效果。

研究發現增強免疫系統識別、殺傷腫瘤細胞對遏制腫瘤進展、提高臨床療效有重要意義。細胞免疫治療是當前研究的熱點話題，如過繼性免疫細胞治療、CART免疫細胞治療等均為部分腫瘤患者帶來了新的希望［15-16］。免疫細胞分泌細胞因子如IL-2、干擾素、顆粒酶等誘導腫瘤細胞凋亡或死亡。然而，腫瘤細胞通過降低自身表面抗原、基因突變等機制逃避免疫識別或殺傷，形成免疫耐受［17-18］。在本研究中，以PBMC處理肺癌細胞發現，干擾BRCA2基因表達后，PBMC對肺癌細胞的殺傷力比未干擾組更強。這與降低BRCA2基因表達提高化療藥物對癌細胞的殺傷力原理相同。隨后發現DNA損傷修復關鍵基因如RAD51、ATM、RAD50及MRE11等表達也降低。ATM/RAD51介導的ATM信號是DNA損傷修復的重要信號通路，在細胞生存、凋亡等過程中發揮關鍵作用［19］。而本研究數據提示敲減BRCA2基因導致肺癌細胞中DNA損傷修復系統受損，無法有效修復受損DNA，進而誘導細胞凋亡。本研究發現在肺癌中干預BRCA2基因與免疫細胞的聯合抑瘤作用，有望減輕臨床上腫瘤細胞對免疫治療的耐受性，從而提高免疫療效。然而，本研究的不足之處在于缺乏動物體內數據。此外，BRCA2基因具體如何調控ATM/RAD信號，影響DNA損傷修復機制也需要更深層次的探究。