骨髓微環(huán)境中CXC趨化因子配體8介導(dǎo)急性髓系白血病發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機(jī)制與臨床意義

劉彥權(quán) 殷悅 唐煥文 （.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院血液科，東莞 53808；.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福州 35000）

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是成人常見的一類以克隆性造血干祖細(xì)胞分化阻滯惡性增殖為特征的血液腫瘤，盡管化學(xué)治療、造血干細(xì)胞移植、免疫治療或靶向治療能給AML患者生存帶來希望，但僅有少數(shù)患者從中獲得疾病的緩解，AML仍是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性疾病［1］。骨髓微環(huán)境由細(xì)胞因子、骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSC）以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等共同組成，白血病細(xì)胞與骨髓微環(huán)境中各種介質(zhì)相互作用，繼而通過一系列信號(hào)通路或調(diào)控軸發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，在白血病細(xì)胞惡性增殖、免疫逃逸、化療耐藥等方面扮演了不可或缺的角色，從骨髓微環(huán)境角度闡明AML致病分子機(jī)制顯得尤為重要［2-4］。作為骨髓微環(huán)境中的一種多元效應(yīng)性趨化因子——CXCL8及其所形成的趨化因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與白血病的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)、療效以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸等可能存在著密切的關(guān)聯(lián)［5-6］。本研究旨在探討和分析不同病情階段的AML患者體內(nèi)CXCL8的動(dòng)態(tài)變化水平，研究其與AML患者臨床病情發(fā)展的關(guān)系，同時(shí)分離臨床初診AML患者的BM-MSC，并以人AML細(xì)胞株U937為模型與AML患者BM-MSC共培養(yǎng)，淺析骨髓微環(huán)境中CXCL8對(duì)白血病發(fā)病與病情進(jìn)展的作用，對(duì)AML基礎(chǔ)研究和臨床診療開拓具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院68例不同病情階段的AML患者骨髓血標(biāo)本［初治29例、完全緩解（complete remission，CR）23例、復(fù)發(fā)16例）］及20例健康體檢者的血標(biāo)本作為健康對(duì)照組。納入本研究的AML患者符合國(guó)際血液學(xué)領(lǐng)域指南及相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2019KY092），入組患者均簽署知情同意書，臨床資料均從住院系統(tǒng)的臨床病史記錄及病例資料中獲取。

1.1.2 儀器與試劑 超凈臺(tái)、酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；離心機(jī)、移液槍及微量加樣器均購(gòu)于Eppendorf公司；超低溫-80 ℃冰箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；FACS流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司；胎牛血清FBS、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物公司；TRIzol試劑購(gòu)于上海Invitrogen公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇均購(gòu)于上海振興化工公司；DEPC購(gòu)于上海生工公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊公司；SYBR GreenMaster（ROX）購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物公司；Human IL-8/CXCL8 ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Novus生物公司；rCXCL8購(gòu)于美國(guó)R&D公司；CXCL8拮抗劑（anti-CXCL8）購(gòu)于美國(guó)Selleck公司；ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，Bcl-2抗體、Bax抗體、GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司。

AML細(xì)胞株HL60、U937、NB4、THP-1、K562等由福建省血液病研究所保藏提供。細(xì)胞系置于含10%胎牛血清（FBS）及100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓血標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞的提取 將與骨髓血標(biāo)本等體積淋巴細(xì)胞分離液加入15 ml離心管（骨髓液∶分離液=1∶1），用等量PBS稀釋骨髓標(biāo)本，輕柔吹打混勻；將稀釋的骨髓液緩慢疊加于人淋巴細(xì)胞分離液上，形成分明的界限，2 000 r/min室溫離心20 min，用移液管吸取上層血漿凍存以備后續(xù)ELISA實(shí)驗(yàn)，吸取中間云霧狀層單個(gè)核細(xì)胞層于1.5 ml EP管中，PBS洗滌2遍，2 000 r/min離心5 min，若存在較多紅細(xì)胞，則加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，4 ℃裂解20 min，再用PBS洗滌2遍；吸棄上清，加入1 ml TRIzol后吹打混勻，儲(chǔ)藏于-80 ℃，以備后續(xù)提取RNA。

1.2.2 BM-MSC梯度離心與培養(yǎng) 用等量PBS稀釋骨髓標(biāo)本，輕柔吹打混勻，將稀釋的骨髓緩慢疊加于同等體積的人淋巴細(xì)胞分離液上，形成分明的界限；2 000 r/min室溫離心20 min，離心后骨髓液分為4層（從上往下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、透明分離液層以及紅細(xì)胞層），用無菌移液管小心吸取分離交界面的云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至5 ml新鮮培養(yǎng)基中充分吹打混勻，離心洗滌2次后加入含有30%FBS的α-MEM重懸，6×109個(gè)/L細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，置于無菌培養(yǎng)箱中。

1.2.3 ELISA檢測(cè)CXCL8水平 收集不同病情階段AML患者及健康者骨髓血標(biāo)本，離心后提取血清并凍存于-80 ℃冰箱中，檢測(cè)CXCL8實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 白血病細(xì)胞株的復(fù)蘇、換液與細(xì)胞計(jì)數(shù)從液氮罐中快速取出白血病細(xì)胞株，37 ℃水中快速解凍1 min，將細(xì)胞懸液移至含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基的離心管中吹打混勻，600 r/min離心5 min后棄上清，再加入8～10 ml至含10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中吹打混勻轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶，后置于37 ℃、飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并于第2天離心換液后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)則是在超凈臺(tái)中用巴氏管充分吹打混勻細(xì)胞，取少量細(xì)胞原液于1.5 ml EP管中，用移液槍取10 μl原液再加10 μl臺(tái)盼藍(lán)混勻后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，并在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)。

1.2.5 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CXCR1/2表達(dá)情況 利用Trizol RNA提取試劑盒提取總RNA，檢測(cè)濃度和純度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用ABI 7500型熒光定量PCR儀和SYBR Green-Master（ROX）試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參照，引物序列如下：CXCR1正向引物5'-TTCTCCATAGCTGCCTCAACC-3'和反向引物5'-TGTAGGAGGTAACACGATGACG-3'；CXCR2正向引物5'-TGGGCAACAATACAGCAAACT-3'和反向引物5'-GCACTTAGGCAGGAGGTCTTA-3'；GAPDH正向引物5'-CACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'和反向引物5'-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3'。總反應(yīng)體系20 μl，包括：2 μl cDNA、10 μl SYBR Green（ROX）、正向、反向引物各0.5 μl、RNase-free ddH2O 7 μl；反應(yīng)條件為：第一階段（預(yù)變性）：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；第二階段：95 ℃ 15 s（變性）、60 ℃ 1 min（退火/延伸），共40個(gè)循環(huán)；第三階段（溶解曲線分析）：95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)；采用Ct值比較法對(duì)qRT-PCR結(jié)果分析，并對(duì)比各CXCR家族mRNA表達(dá)水平，即ΔCt=Ct值CXCR-Ct值GAPDH，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各CXCR的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔΔCt=（CtCXCR-CtGADPH）實(shí)驗(yàn)組-（CtCXCR-CtGADPH）對(duì)照組。

1.2.6 外源性rCXCL8刺激U937細(xì)胞增殖體系取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞4×105個(gè)予以種板，將已接種的細(xì)胞隨機(jī)分為2個(gè)大組：空白對(duì)照組（Blank組）及實(shí)驗(yàn)組（rCXCL8組），Blank組中加入適量RPMI1640培養(yǎng)基，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，期間換液1～2次；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在鋪板后加入rCXCL8溶液，將其分為1 ng/ml組、5 ng/ml組、10 ng/ml組、20 ng/ml組共4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，上述各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并進(jìn)行后續(xù)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 CCK-8法檢測(cè)U937細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞密度至4×104/ml接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔體積100 μl，邊緣孔用無菌PBS填充；置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，分別加入不同濃度梯度的rCXCL8以及等體積RPMI1640培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組與Blank組，培養(yǎng)24 h；在24 h結(jié)束培養(yǎng)后各組均在避光狀態(tài)中加入10 μl CCK-8溶液（避免氣泡）于酶標(biāo)儀上振蕩2 min后繼續(xù)孵育4 h。自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定雙波長(zhǎng)450 nm、630 nm處吸光度（OD）值。以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.8 Transwell法構(gòu)建BM-MSC和U937細(xì)胞共培養(yǎng)體系 無菌條件下將Matrigel置于4 ℃冰箱或冰浴融化，采用PBS稀釋成1 mg/ml，-20 ℃凍存?zhèn)溆茫蝗〕鲆严♂尯玫腗atrigel進(jìn)行冰浴融化，以50 ml的體積鋪于Transwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上，37 ℃放置60 min，使Matrigel聚合成凝膠，在加基質(zhì)膠時(shí)務(wù)必將24孔板放置在冰盒上，確保膠完全覆蓋孔底，避免氣泡；每孔加入200 ml RPMI1640培養(yǎng)基使膠重構(gòu)；在Transwell下室加入5×105個(gè)/ml BMMSC細(xì)胞；在上室孔中加入U(xiǎn)937細(xì)胞1×105個(gè)/孔，細(xì)胞懸液體積200 μl，置于5%CO2培養(yǎng)箱于37 ℃培養(yǎng)24 h；待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，收集上室液體并小心取出上室，用細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，將刺激后的U937細(xì)胞收集，PBS洗滌，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞予以實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/孔接種于6孔板，給予不同濃度rCXCL8（或anti-CXCL8）干預(yù)U937細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并離心，PBS清洗2次，棄上清，往管中加入400 μl×Annexin V重懸細(xì)胞，再加入5 μl的Annexin V-FITC染色液，4 ℃避光孵育20 min，后加入10 μl PI染液，4 ℃避光孵育5 min，后用BD FACSVerse流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用FlowJo 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。凋亡細(xì)胞=早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞。其中（Annexin V/PI）-（PI）-為活細(xì)胞，（Annexin V/PI）＋（PI）-為早期凋亡細(xì)胞，（Annexin V/PI）＋（PI）＋為晚期凋亡細(xì)胞。

1.2.10 Western blot檢測(cè)凋亡及通路蛋白表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937細(xì)胞予以不同濃度rCXCL8（或anti-CXCL8）干預(yù)，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并離心，PBS清洗細(xì)胞2次，棄上清，使用全細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，并利用BSA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。使用等量蛋白質(zhì)予以SDS-PAGE電泳，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后二抗孵育1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理PVDF膜，在成像系統(tǒng)下曝光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究所有數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)AML患者骨髓CXCL8水平 如表1所示，AML患者體內(nèi)CXCL8水平整體高于健康對(duì)照組（P＜0.05）。在不同病情階段的AML患者中，處于初診及復(fù)發(fā)的患者CXCL8水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），且處于復(fù)發(fā)階段的患者體內(nèi)CXCL8水平顯著高于其他分期組患者（P＜0.01），而處于CR階段且無感染癥狀的AML患者，其體內(nèi)CXCL8水平與健康對(duì)照組人群相比無明顯差異（P＞0.05）。此外，CXCL8含量與AML患者臨床指標(biāo)中WBC呈正相關(guān)，而與Hb、PLT呈負(fù)相關(guān)，與年齡和性別無相關(guān)性。

表1 各病情階段AML患者CXCL8水平與臨床指標(biāo)Tab.1 CXCL8 levels and clinical indicators in AML patients at different disease stages

2.2 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同AML細(xì)胞系CXCR1/2表達(dá)情況 如圖1所示，AML細(xì)胞系較健康體檢者單個(gè)核細(xì)胞中CXCR1、CXCR2表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），其中U937細(xì)胞CXCR1、CXCR2中平均表達(dá)水平（Expressionmean）最高，故選擇U937細(xì)胞作為本研究后續(xù)的AML疾病模型。

圖1 不同AML細(xì)胞系CXCR1、CXCR2 mRNA表達(dá)情況Fig.1 Expressions of CXCR1 and CXCR2 mRNA in different AML cell lines

2.3 CCK-8法檢測(cè)外源性rCXCL8對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響 如表2所示，當(dāng)rCXCL8濃度≤10 ng/ml時(shí)，U937細(xì)胞增殖率隨rCXCL8濃度增加而升高（P＜0.05）。而當(dāng)rCXCL8濃度＞10 ng/ml時(shí)，繼續(xù)增加rCXCL8濃度，U937細(xì)胞增殖不明顯，可能與rCXCL8刺激后增殖率達(dá)到平臺(tái)期有關(guān)。

表2 外源性rCXCL8對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響（）Tab.2 Effects of exogenous rCXCL8 on proliferation of U937 cells （）

表2 外源性rCXCL8對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響（）Tab.2 Effects of exogenous rCXCL8 on proliferation of U937 cells （）

Note：Compared with blank group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01.

Added rate /%-16.74±8.091）43.46±7.432）64.23±5.282）66.95±6.312）Groups 0（Blank）1 ng/ml（A）5 ng/ml（B）10 ng/ml（C）20 ng/ml（D）Hole count 10 10 10 10 10 OD 10.26±0.67 11.98±0.91 14.72±0.73 16.85±0.82 17.13±1.38

2.4 外源性rCXCL8刺激U937細(xì)胞后CXCR1/2 mRNA表達(dá)差異 選擇1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml及20 ng/ml rCXCL8干預(yù)U937細(xì)胞，并設(shè)置Blank組于48 h后應(yīng)用Trizol法提取總RNA，并在6 h內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于qRT-PCR檢測(cè)。如圖2所示，與Blank組相比，隨著外源性rCXCL8濃度梯度的增加，其細(xì)胞表達(dá)CXCR1/2的水平逐漸升高，當(dāng)rCXCL8逐漸升至10 ng/ml以上的作用濃度刺激下，CXCR1/2水平較不再上調(diào)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且CXCR2更為明顯，可能與rCXCL8刺激后達(dá)平臺(tái)期有關(guān)，與2.3的結(jié)論相符。

圖2 外源性rCXCL8刺激U937細(xì)胞后CXCR1/2 mRNA表達(dá)差異Fig.2 Differences of CXCR1/2 mRNA expression in U937 cells stimulated by exogenous rCXCL8

2.5 ELISA法檢測(cè)BM-MSC+U937共培養(yǎng)體系CXCL8的水平變化 如圖3所示，BM-MSC與U937細(xì)胞共培養(yǎng)體系上清液中CXCL8含量為（4.86±2.95）ng/ml，顯著高于未加入BM-MSC的對(duì)照Mono組培養(yǎng)上清CXCL8含量（0.59±0.17）ng/ml（P＜0.01）。此外，通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)單培養(yǎng)與共培養(yǎng)體系下U937細(xì)胞CXCL8的mRNA表達(dá)水平，在共培養(yǎng)體系下CXCL8水平顯著高于Mono體系（P＜0.01）。

圖3 BM-MSC+U937共培養(yǎng)體系與Mono組CXCL8含量變化（A）與CXCL8 mRNA表達(dá)變化（B）Fig.3 Changes of CXCL8 content （A） and CXCL8 mRNA expression in BM-MSC+U937 co-culture system and Mono group （B）

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rCXCL8與anti-CXCL8對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響 如圖4所示，采用外源性rCXCL8刺激U937細(xì)胞，其凋亡率略低于空白對(duì)照組［（5.68±0.79）%vs（7.42±0.51）%，P＜0.05］，而通過拮抗CXCL8（anti-CXCL8）干預(yù)U937細(xì)胞時(shí)，其凋亡率升至（14.91±2.86）%，顯著高于rCXCL8組［（5.68±0.79）%，P＜0.01］及空白對(duì)照組［（7.42±0.51）%，P＜0.01］。上述結(jié)果表明外源性rCXCL8刺激細(xì)胞增殖的同時(shí)可減少凋亡，而拮抗CXCL8表達(dá)可誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖4 rCXCL8與anti-CXCL8對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of rCXCL8 and anti-CXCL8 on apoptosis of U937 cells

2.7 CXCL8調(diào)控U937細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制 如圖5所示，外源性rCXCL8刺激U937細(xì)胞將明顯上調(diào)抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)水平，并下調(diào)促凋亡分子Bax表達(dá)（P＜0.05），在此基礎(chǔ)上拮抗CXCL8后將使Bax表達(dá)上調(diào)、而下調(diào)Bcl-2表達(dá)，同時(shí)抑制ERK1/2信號(hào)通路活化水平以誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 CXCL8調(diào)控U937細(xì)胞增殖與凋亡的相關(guān)分子機(jī)制Fig.5 Molecular mechanism of CXCL8 regulating U937 cell proliferation and apoptosis

3 討論

AML是一類源于造血干祖細(xì)胞遺傳突變所致的惡性克隆性疾病，其特征為未成熟幼稚的髓母細(xì)胞無限增殖并在骨髓中累積，導(dǎo)致骨髓造血功能受損并浸潤(rùn)髓外組織器官。盡管近年來標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法的應(yīng)用、造血干細(xì)胞移植甚至是免疫療法等手段使AML患者的治療及預(yù)后有所改善，但大多數(shù)患者仍需面對(duì)復(fù)發(fā)、難治、耐藥或?qū)εR床治療手段無效的慘痛現(xiàn)實(shí)，致使AML患者的總生存期短、預(yù)后差、病死率居高不下。其中，化療抗性、耐藥性與白血病細(xì)胞和骨髓微環(huán)境之間的相互作用密切相關(guān)［7］。值得關(guān)注的是，BM-MSC和白血病細(xì)胞常通過骨髓微環(huán)境中的趨化因子進(jìn)行相互介導(dǎo)并發(fā)揮一系列的惡性生物學(xué)作用，繼而導(dǎo)致骨髓微環(huán)境中的炎癥介質(zhì)反應(yīng)加劇甚至使骨髓細(xì)胞向白血病細(xì)胞演變［8-9］。

作為“白細(xì)胞催化劑”的CXC型趨化因子CXCL8，是造血干細(xì)胞（hemapietic stem cell，HSC）和粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞（Granulocyte-monocyte progenitor cells，GMPs）中顯著上調(diào)的基因之一，提示CXCL8很有可能在AML的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［10］。目前，CXCL8是一種已知的有效促炎因子，通過與腫瘤細(xì)胞上存在的特異性G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1以及CXCR2高親和力結(jié)合，繼而激活PI3K、PLC、PLD、JAK2、AC以及Ras等信號(hào)通路分子，在調(diào)控基因表達(dá)與細(xì)胞生物學(xué)行為等方面扮演著重要的角色［11］。此外，眾多惡性腫瘤的研究證實(shí)，CXCL8在腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、遷移以及侵襲等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，并可能是腫瘤干細(xì)胞活性的重要調(diào)節(jié)劑［12-18］。而在AML患者骨髓微環(huán)境中，個(gè)別研究證實(shí)BM-MSC在炎癥和缺氧的應(yīng)激情況下可釋放CXCL12、CXCL8，且BM-MSC所分泌的CXCL8可促進(jìn)AML細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的發(fā)生，從而導(dǎo)致AML發(fā)生耐藥、病灶殘留和復(fù)發(fā)［19］。

本研究首先通過ELISA檢測(cè)不同病情階段的AML患者體內(nèi)CXCL8水平，結(jié)果顯示AML患者體內(nèi)CXCL8含量水平顯著高于健康人群，此外，在不同病情階段的AML患者中，處于初診及復(fù)發(fā)的患者CXCL8水平顯著高于正常對(duì)照組，尤其是處于復(fù)發(fā)階段的患者體內(nèi)CXCL8水平顯著高于其他分期組患者，而處于CR階段且無感染癥狀的AML患者，其體內(nèi)CXCL8水平與健康對(duì)照組人群相比無明顯差異。為此，本研究表明監(jiān)測(cè)CXCL8水平變化將是判斷AML患者臨床療效和病情階段的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。值得一提的是，盡管人類機(jī)體生理狀態(tài)下存在一定基礎(chǔ)水平的CXCL8，但機(jī)體若在病理狀態(tài)存在免疫炎癥反應(yīng)或相關(guān)促炎因子的作用下，CXCL8水平將顯著上調(diào)。AML患者由于體內(nèi)大量幼稚未分化的髓系母細(xì)胞過度增殖且抑制正常造血及功能，多數(shù)患者在發(fā)病期間存在感染癥狀，這也可能是體內(nèi)CXCL8水平上調(diào)的原因之一。所以，CXCL8很可能通過促進(jìn)AML患者體內(nèi)多種趨化因子或細(xì)胞因子之間相互作用，繼而使骨髓微環(huán)境中炎癥介質(zhì)紊亂程度加重，進(jìn)一步促進(jìn)白血病病情的復(fù)發(fā)、進(jìn)展與惡化。

CXCL8水平在AML患者的臨床分期及預(yù)后中是一個(gè)極具潛力的標(biāo)志物，然而，其在AML的病情發(fā)展及惡化的病理生理過程中如何發(fā)揮作用？本研究通過檢測(cè)CXCL8特異性受體CXCR1/2在不同AML細(xì)胞系中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在AML細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，尤其是U937細(xì)胞系中CXCR1/2表達(dá)最高且穩(wěn)定，故選擇U937細(xì)胞系作為AML疾病模型。通過外源性rCXCL8干預(yù)U937細(xì)胞能促進(jìn)U937細(xì)胞增殖，且增殖率呈濃度依賴性，并上調(diào)CXCR1/2的表達(dá)。而將分離的AML患者BM-MSC與U937細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，BM-MSC與U937細(xì)胞共培養(yǎng)體系中CXCL8含量及其共培養(yǎng)體系下U937細(xì)胞CXCL8 mRNA水平均顯著高于未加入BM-MSC的單培養(yǎng)Mono組CXCL8含量，表明AML患者BM-MSC細(xì)胞可分泌CXCL8，進(jìn)而刺激U937細(xì)胞發(fā)生增殖。通過Western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)，外源性rCXCL8刺激U937細(xì)胞將顯著上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，并下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)U973細(xì)胞惡性增殖，使凋亡受抑；在此基礎(chǔ)上通過拮抗CXCL8（anti-CXCL8），可下調(diào)Bcl-2表達(dá)，并促進(jìn)Bax表達(dá)上調(diào)，同時(shí)通過抑制ERK1/2信號(hào)通路活化水平進(jìn)而誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明CXCL8介導(dǎo)AML細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制可能與Bcl-2家族蛋白以及ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，AML的發(fā)生、發(fā)展與骨髓微環(huán)境中的可溶性因子、BM-MSC和ECM相互作用關(guān)系密切，而CXCL8可顯著影響AML細(xì)胞的增殖和抗凋亡效應(yīng)，這與本研究結(jié)論基本相符［20-23］。通過基因編輯技術(shù)敲低或藥理學(xué)方法阻斷CXCL8及其受體活性，可導(dǎo)致AML增殖減少、凋亡增加，同時(shí)減少對(duì)化療的耐藥性，表明CXCL8-CXCR1/2軸在AML病情發(fā)展中起到了重要作用［10］。值得關(guān)注的是，近年來有學(xué)者鑒定出CXCL8小分子抑制劑化合物NCI34255，應(yīng)用其干預(yù)AML細(xì)胞株，不僅可減少AML細(xì)胞株增殖，還可增強(qiáng)AML細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，減輕化療抗性［19］。與此同時(shí)，亦有研究發(fā)現(xiàn)，AML伴IDH1/2突變會(huì)產(chǎn)生合成代謝物R-2-羥基谷氨酸（R-2HG），從而激活NF-κB信號(hào)通路并顯著上調(diào)CXCL8表達(dá)，促進(jìn)AML細(xì)胞增殖和產(chǎn)生對(duì)化療藥的抵抗作用［24］。此外，伴有FLT3-ITD突變的AML患者具有最高的CXCL8 mRNA表達(dá)，并已證實(shí)CXCL8基因高表達(dá)是FLT3-ITD突變的AML患者不良預(yù)后的重要標(biāo)志［25］。為此，靶向CXCL8治療很有可能是FLT3-ITD及IDH1/2突變型AML患者的有效治療策略。

綜上，本研究的結(jié)果證實(shí)，CXCL8與AML病情、預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，是AML患者疾病進(jìn)展、預(yù)后評(píng)估極為有效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。在骨髓微環(huán)境中，CXCL8可能是介導(dǎo)白血病細(xì)胞惡性增殖、免疫逃逸的重要趨化因子，通過拮抗CXCL8可誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能與Bcl-2家族蛋白表達(dá)變化、抑制ERK1/2信號(hào)通路活化水平有關(guān)。此外，本研究中多項(xiàng)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性rCXCL8或拮抗CXCL8干預(yù)U937細(xì)胞可影響其特異性受體CXCR1/2的表達(dá)，表明CXCL8-CXCR1/2軸在調(diào)控AML疾病發(fā)生、發(fā)展中亦尤其關(guān)鍵，但其中是否伴隨其他分子機(jī)制的參與？以及靶向CXCL8是否對(duì)于逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥、遏制白血病細(xì)胞免疫逃逸、削弱白血病細(xì)胞干性與化療抗性等方面存在一定的意義？上述都需要更為深入的研究予以探討。

誠(chéng)然，本研究的創(chuàng)新之處是基礎(chǔ)研究結(jié)合臨床應(yīng)用，采用多重技術(shù)檢測(cè)臨床上不同病情階段的AML患者體內(nèi)的CXCL8水平，分析和探討其在病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估等方面所具備的重要臨床價(jià)值，同時(shí)通過構(gòu)建AML疾病的細(xì)胞模型，揭示了CXCL8介導(dǎo)AML發(fā)生、發(fā)展與惡性生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制，證實(shí)CXCL8是極具潛力的分子標(biāo)志物，為白血病的免疫與靶向治療提供了科學(xué)且新穎的思路，但其間復(fù)雜的分子事件與效應(yīng)機(jī)制仍需深入挖掘與探索，以便更好地付諸于基礎(chǔ)研究并應(yīng)用于臨床實(shí)踐。