miR17-92簇在痛風中的表達及臨床意義

馮丹 姜蓉瓊 楊桂釗 張惠 王丹 劉靜 余成秀 袁國華

（1.川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所，南充 637000； 2.川北醫學院附屬醫院呼吸內科，南充 637000）

痛風是尿酸鹽晶體沉積于皮下、關節、滑膜或腎臟等組織及器官引起的一組異質性代謝性慢性疾病［1］。與嘌呤代謝障礙和/或尿酸排泄減少引起的高尿酸血癥直接相關，血清尿酸與痛風存在顯著濃度依賴性［2］。臨床上痛風有4個發展階段：無癥狀高尿酸血癥、急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AG）、間歇期痛風（intermittent gout，IG）和慢性痛風石性痛風，這4個發展階段并非依序而來。急性期患者常伴有高尿酸血癥，且并非所有患者出現高尿酸血癥就會進展為痛風性關節炎（gouty arthritis,GA），高尿酸血癥向痛風進展的機制仍不完全清楚［1］。IG患者長期未控制的高尿酸血癥可能造成不良預后，伴隨多種并發癥，包括心血管疾病、慢性腎病、肥胖等，甚至出現關節尿酸鹽沉積導致殘疾喪失生活能力，對個人及社會均造成極大負擔［3］。因此本研究著眼于闡明IG患者合并高尿酸血癥的原因及機制。

miRNA是由約22個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA分子，通過靶向mRNA的3'UTR位點介導基因沉默，抑制蛋白翻譯或促進mRNA降解［4］。根據某些miRNA種子序列相似性，可將相似的成簇排列的miRNAs分為miRNA簇（miRNA cluster）［4］。其中miR17-92簇宿主基因（MIR17HG）跨越7 kb，包含800個核苷酸的miR-17-92簇轉錄物可編碼6種miRNAs：miR17、miR18a、miR19a、miR20a、miR19b-1和miR92a-1，即miR17-92簇［5］。miRNA簇失調導致生物學功能改變是許多疾病的關鍵發病機制，可潛在調節細胞功能，包括生長、增殖、分化、發育、代謝、感染、免疫、細胞死亡、細胞器生物發生、信號轉導、DNA修復和自我更新等［6-7］。近期多項研究提示miR-17-92簇各成員可能與痛風發病相關［7］。同時結合臨床工作，Janus酶（JAK）/信號轉導和轉錄激活因子（STAT）信號通路引起廣泛關注，JAK-STAT通路是主要的細胞內信號轉導通路之一，是各種細胞因子、激素和生長因子的重要下游介質［8］。研究發現IFN-γ是JAK-STAT通路免疫應答和信號的重要調節因子［9］；IL-10主要由單核細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞分泌，是一種調節細胞生長和分化的多功能細胞因子，參與炎癥和免疫應答，被認為是炎癥和免疫的抑制因子，參與急性痛風自發緩解［10-11］。本研究擬探索miR17-92簇及JAK-STAT通路成員在GA患者中的表達，測定IFN-γ及IL-10表達，尋找miR17-92簇可能的信號通路及作用機制，更好了解GA的發病機制，為尋找新的治療靶點提供方向。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 根據1977年美國風濕病協會（ACR）診斷標準或2015年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟痛風分類標準確定本實驗研究對象［12］。收集2020年底至2021年底于川北醫學院附屬醫院風濕免疫科確診的痛風患者67例。其中AG患者22例，年齡16～72歲，平均年齡（45.6±14.6）歲，IG患者45例，年齡15～81歲，平均年齡（40.0±14.4）歲。研究對象均為男性，排除尿酸鹽腎病、尿酸鹽性尿路結石及肝腎功能損害患者，同時排除患有感染、乙肝、結核、腫瘤及藥物等繼發因素所致尿酸升高及合并其他疾病者。收集患者臨床及實驗室資料。對照組選擇性別、年齡相符及血尿酸正常（UA＜360 μmol/L）的健康男性體檢者（HC）35例，年齡27～77歲，平均年齡（42.3±11.5）歲，均排除有痛風家族史、感染、腫瘤及可疑導致尿酸升高用藥史等疾病史者。兩組研究對象年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準，受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 miR17-92簇檢測采用莖環法，設計莖環引物，內參使用U6，miRNA引物由上海元莘生物工程有限公司設計合成，其余引物由上海生工生物工程有限公司合成。全血總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（上海元莘生物工程有限公司）；熒光定量PCR系統（美國Life Technologies公司）；HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。引物序列見附表1、附表2（www.immune99.com）。

表1 痛風相關基因及相互作用的miR17-92簇Tab.1 Gout-related genes and interacting with miR17-92 cluster

表2 miR17-92簇與JAK-STAT通路的靶向作用關系Tab.2 Relationship between miR17-92 cluster and JAKSTAT pathway

1.2 方法

1.2.1 生物信息學研究 通過miRWalk等數據庫預測miR17-92簇可能的靶基因。搜索目前已研究的痛風相關致病基因及miRNA，搜索可能作用于JAK-STAT通路的miRNA，使用GSEA基因富集功能研究其交集并繪制相關圖譜。

1.2.2 miRNA莖環法逆轉錄及RT-PCR 使用Trizol提取RNA，根據試劑盒說明將體系中的Oligo（dT）18和Random hexamers更換為miRNA特異性莖環引物和反向引物進行逆轉錄。產物cDNA根據試劑盒進行PCR反應，以U6為內參進行計算，基因表達倍數差異以RQ=2-ΔΔCt表示。

1.2.3 普通逆轉錄及RT-PCR 使用Trizol提取RNA，根據說明進行逆轉錄。所得產物cDNA根據試劑盒及反應條件進行PCR反應，基因表達倍數差異以RQ=2-ΔΔCt表示。

1.2.4 各項實驗室指標收集 檢測下列指標：堿性磷酸酶（ALP）、腺苷脫氨酶（ADA）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、尿酸（UA）、肌酐（Crea）、葡萄糖（Glu）、血沉（ESR）、超敏C反應蛋白（hsCRP）、白細胞（WBC）、中性粒細胞（NE）、單核細胞（MO）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）。

1.3 統計學處理 數據采用IBS SPSS26數據包及GraphPad prism 8軟件處理，計量資料且符合正態分布的以表示，不符合正態分布的以M（Q1，Q3）表示。多組間兩兩比較采用Kruskal-WallisH檢驗，變量間相關性分析采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析 通過以關鍵詞GOUT搜索數據庫miRwalk中已明確的靶基因及其相關作用的miRNAs，通過GSEA基因富集共得到8個靶基因HP、A1CF、SLC17A3、ADRB3、IL33、ABCG2、PRPS1、LPA作用于GA，1 553個miRNAs作用于痛風，包括miR17-92簇中的miR17-5p、miR18a-5p、miR20a-5p（表1）。進一步挖掘miR17、miR18a、miR19a相關靶基因，其中miR17通過基因富集作用得到2 326個靶基因；miR18a通過基因富集作用得到2 252個靶基因；miR19a通過基因富集作用得到268個靶基因。miR17-92簇所有成員與JAK-STAT通路中的相互靶向作用見表2，miRNA調控靶基因機制復雜，即使調控同一基因可能靶向不同疾病及不同效應，具體機制需進一步研究。將miR17、miR18a、miR19a及GA可能靶基因的相關靶基因繪制韋恩圖（圖1）。GA與JAK-STAT通路相關miRNA見圖1，其交集中共同作用的miRNAs中包含miR17-92簇中的miR17、miR18a和miR20a，初步估計miR17-92簇可通過JAK-STAT通路參與痛風發病機制。搜索過程中發現其他信號通路也較大程度參與痛風病理過程，但痛風急性發作及緩解機制仍不明確，進一步研究痛風致病機制尤為重要。

圖1 靶向作用于GA與JAK-STAT通路的miRNAsFig.1 miRNAs associated with GA and JAK-STAT pathway

2.2 miR17-92簇中各成員表達分析 miR17、miR18a、miR19a、miR20a、miR19b在AG、IG、HC中表達差異均有統計學意義（H=8.753，P＜0.05；H=6.338，P＜0.05；H=6.523，P＜0.05；H=9.061，P＜0.05；H=9.729，P＜0.01），miR92a在3組間表達差異無統計學意義。其中AG、IG組miR17a表達4.350 5（0.673 6，7.148 7）、2.482 3（0.743 6，5.104 1）明顯高于HC對照組0.920 2（0.478 8，2.505 1），差異均有統計學意義（P＜0.05，圖2A）。IG組miR18a表達2.127 4（1.325 0，5.055 0）高于HC對照組1.304 7（0.580 7，2.860 7），差異有統計學意義（P＜0.05，圖2B）。AG組miR19a表達4.039 7（0.671 7，7.955 0）高于HC對照組0.941 6（0.489 0，1.998 1），差異均有統計學意義（P＜0.05，圖2C）。AG組miR20a表達7.048 8（0.862 3，17.294 4）明顯高于HC組1.010 5（0.248 6，3.973 6），差異有統計學意義（P＜0.01，圖2D）。AG組miR19b表達4.371 4（0.449 0，9.752 1）明顯高于HC組0.988 0（0.426 1，2.271 3），差異有統計學意義（P＜0.01，圖2E）。

圖2 AG、IG及HC組miR17-92簇各成員相對表達Fig.2 Relative expressions of miR17-92 cluster in AG，IG and HC groups

2.3 JAK-STAT信號通路中各成員mRNA表達JAK3、STAT2在AG、IG、HC三組中表達差異有統計學意義（H=10.349，P＜0.01；H=14.801，P＜0.01，圖3）。其中IG、HC組JAK3表達1.119 1（0.753 9，1.602 7）、1.024 5（0.529 5，1.948 4）高于AG組0.526 0（0.326 7，1.206 3），差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。AG、HC組STAT2表達1.377 5（0.674 2，2.486 9）、1.233 6（0.755 8，1.511 6）明顯高于IG組0.701 5（0.296 8，1.238 1），差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。各組間JAK1、JAK2、STAT1、STAT3未見明顯差異。

2.4 IFN-γ及IL-10相對表達 IFN-γ三組間表達差異有統計學意義（H=8.734，P＜0.05）。其中HC組IFN-γ mRNA表達0.754 1（0.677 1，1.752 7）高于AG、IG患者相對表達0.483 6（0.169 6，0.794 1）、0.472 7（0.249 2，0.938 2），差異有統計學意義（P均＜0.05，圖4A）。而3組間IL-10 mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05，圖4B）。

圖4 AG、IG及HC組IFN-γ及IL-10相對表達Fig.4 Relative expressions of IFN-γ and IL-10 in AG， IG and HC groups

2.5 AG、IG組miR17-92表達與臨床資料相關性分析

2.5.1 AG組miR17-92表達與臨床資料相關性分析 AG患者miR18a表達與IBIL、Crea、MO、HGB呈負相關（rs=-0.79，P＜0.01；rs=-0.55，P＜0.05；rs=-0.63，P＜0.05；rs=-0.68，P＜0.01）。miR19a表達與TC、UA、HGB呈負相關（rs=-0.90，rs=-0.45，rs=-0.45，P均＜0.05）。miR20a表達與Crea呈負相關（rs=-0.45，P＜0.05）。miR19b表達與UA、HGB呈負相關（rs=-0.51，rs=-0.45，P均＜0.05，表3）。

表3 AG患者miR17-92簇表達與臨床資料相關性分析Tab.3 Correlation analysis between miR17-92 cluster expressions and clinical data in AG patients

2.5.2 IG組miR17-92表達與臨床資料相關性分析 IG患者miR17表達與IBIL、WBC、LY、MO均呈負相關（rs=-0.55，rs=-0.49，P均＜0.05；rs=-0.61，rs=-0.70，P均＜0.01），miR18a表達與ALP呈正相關（rs=0.52，P＜0.05）。miR19a表達與TC、UA呈負相關（rs=-0.55，rs=-0.40，P均＜0.05）。miR20a表達與ADA、UA呈負相關（rs=-0.41，P＜0.05；rs=-0.64，P＜0.01，表4）。

表4 IG患者miR17-92簇表達與臨床資料相關性分析Tab.4 Correlation analysis between miR17-92 cluster expressions and clinical data in IG patients

3 討論

現階段痛風發作及緩解機制尚不明確，主要觀點為單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體與巨噬細胞相互作用觸發炎癥，誘導中性粒細胞和單核細胞浸潤，擴大炎癥反應。同時隨著TGF-β1等多種機制參與，巨噬細胞吞噬作用等可誘導炎癥自發緩解［13-14］。近年多項研究提示miRNAs積極參與痛風致病過程調控。

本研究通過明確miR17-92簇在GA患者中的表達，發現AG患者miR17、miR19a、miR20a、miR19b表達均較健康對照組升高，而IG患者僅有miR17、miR18a升高。提示miR17-92簇對痛風急性發作及自發緩解后間歇期均發揮調控作用，而miR18a等在AG與IG中差異表達，提示其時效特異性可能參與急性痛風自我緩解機制。BOHATá等［15］在間歇期痛風患者中測得miR17、miR18a表達升高，且發現AG中miR17水平仍顯著升高，而miR18a表達差異無統計學意義。

miRNA通過抑制mRNA降解或蛋白表達介導靶基因沉默。本研究也通過生物信息學分析發現miR17-92簇成員不同程度通過JAK-STAT通路參與多種病理生理調節，因此進一步預測并檢測miR17-92簇可能的作用靶基因JAK-STAT家族。其中JAK3相對表達在AG患者中較IG、HC明顯降低，提示JAK3作用于急性痛風發作。STAT2在IG中降低，AG患者STAT2表達高于IG，但與HC無明顯差異，提示JAK-STAT參與痛風發生發展過程。結合前述生物學信息學分析miR17、miR18a、miR20a、miR19b可共同靶向JAK3，miR17、miR18a、miR20a可共同靶向STAT2，推測miR17-92簇可能通過靶向調控JAK-STAT信號通路參與痛風病理過程。AG、IG患者IFN-γ相對表達均下調，而IFN-γ是JAKSTAT通路免疫應答和信號的重要調節因子，STAT1及STAT2可被IFN-γ直接激活誘導表達［9，16-17］。提示miR17-92簇可能通過下調IFN-γ表達負向調控JAK-STAT通路。

多項研究表明miR17-92簇成員如miR17、miR18a、miR20a、miR19a和miR92a等通過調控JAK1/STAT3、JAK2/STAT3軸等參與多種風濕免疫性疾病致病過程［18-20］。另一項研究提示miR19a和miR19b可靶向TLR2 mRNA，并降低類風濕關節炎中成纖維細胞樣滑膜細胞TLR2蛋白表達［21］。而TLRs是先天免疫系統中重要的模式識別受體，廣泛參與病原體相關分子模式識別和感知，MSU可通過識別TLR2釋放一氧化氮，導致后續系列炎癥［22］。本研究中miR19a/miR19b在AG患者中相對表達均有所升高，提示miR19a/miR19b可能參與阻礙MSU對TLR2的識別而抗炎，從而在AG患者中發揮作用，其作用機制仍需進一步明確。

臨床資料相關性分析中，AG患者miR18a表達與IBIL、Crea、MO、HGB呈負相關；miR19a表達與TC、UA、HGB呈負相關；miR20a表達與Crea呈負相關；miR19b表達與UA、HGB呈負相關。IG患者miR17表達與IBIL、WBC、LY、MO均呈負相關，miR18a表達與ALP呈正相關。miR19a表達與TC、UA呈負相關。miR20a表達與ADA、UA呈負相關。提示miR17-92簇可能參與調控痛風多項生理病理機制。

綜上，痛風是一種常見的晶體性關節炎，但其發病機制尚不明確。為進一步明確其致病機制，本研究檢測miR17-92簇在痛風患者中的表達，其差異表達提示可能參與痛風發病機制。其次通過預測miR17-92簇可能的靶基因JAK-STAT家族驗證得出其可能參與痛風發病。本課題組后續將擴大樣本量以及進行體內外研究明確miR17-92簇在痛風中的調控機制，為闡明痛風發病機制提供新視角。