生物光學成像技術在組織穿透性方面的研究進展

張玉敏，王 富，林 俐，葉 堅

（上海交通大學 生物醫學工程學院，上海 200030）

近一個世紀以來，光在生物組織中的傳播與分布，以及光與生物組織的相互作用引起了科學家們的廣泛關注，引發了光學方法在生物醫學檢測與成像領域的研究熱潮。生物光學是利用光學探測手段對內源性分子或外源性標記物（如造影劑）、細胞或者組織甚至整個生物體進行檢測與成像，以獲得其中生物學信息的方法。光學技術的發展幾乎貫穿整個人類的科學技術發展史，而光學技術與生命科學和醫學等各個領域的交叉融合則可追溯至17 世紀：Robert Hooke 利用多片透鏡組合制作了復合式顯微鏡并首次觀察到了植物的細胞結構，Antoni van Leeuwenhoek 也通過類似于顯微鏡結構的自制放大鏡首次觀察到了微生物。與此同時，光波動說的興起，推動了基于衍射成像理論的顯微鏡的誕生。19 世紀，Carl Zeiss聯合Ernst Abbe和Otto Schott發明了首臺可達光學衍射極限的顯微鏡，大大地推動了光學成像的發展。20 世紀，光電探測器的發展，世界上第一臺激光器的誕生，以及激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡等相繼出現，都為光學成像在生物醫學領域的應用帶來了無限的可能性。

與傳統醫學成像方法相比，光學成像的優勢主要體現在以下幾個方面［1］：（1）具有特異性，且在分子水平上具有很高的靈敏度和選擇性，能夠表征生物體的結構或功能信息；（2）光學成像的對比度多樣，利用透射、反射、散射、吸收、熒光和光譜信息中的一種或幾種，可進行多維/多模態成像；（3）具有較好的生物安全性，光學成像采用電磁波作為激發源，避免了電離輻射對人體的危害；（4）時空分辨率高，成像尺寸范圍從幾十納米到宏觀物體，成像速度快、可調；（5）成像范圍廣，體內外的成像均可實現；（6）設備簡單，操作簡便，成像成本低。迄今為止，光學成像已被廣泛用于臨床前和臨床診療的各個領域。例如在基礎科學領域，熒光、生物/化學發光、拉曼等標記技術配合各種成像技術能夠在細胞、組織以及器官甚至整個人體水平進行腫瘤學和藥學等多方面的研究。臨床診療方面，基于外源性成像造影劑吲哚菁綠的熒光成像是淋巴結示蹤的絕佳工具［2］，內窺鏡技術可以對人體的呼吸道、腸胃道、泌尿道和肝膽胰等進行無創或微創的檢查與治療［3］。牙科中用來檢測牙結石的紫外照明熒光成像，眼科常用的光學相干斷層成像和寬場眼底相機等都應用了光學成像的原理。此外，光學方法在體外診斷方面的研究也已有報道，例如，利用熒光成像或拉曼成像進行的試紙條側流免疫層析分析等［4］。

如上所述，光學成像獨特的優勢使其在生物醫學領域具有十分重要的意義和廣闊的應用前景［5-6］。然而，由于生物組織對光子存在高散射與高吸收等特性（圖1）［7］，光的組織穿透性通常非常有限，研究者們對此做了大量的努力。常見的光學成像方法包括激光散斑成像、光學相干斷層掃描、熒光成像、生物/化學發光成像、光聲成像以及拉曼成像等。本文將對上述常見的光學成像技術在組織穿透性方面的研究進展進行總結與討論，并展望它們在組織穿透性方面未來研究的主要方向。激光散斑成像和光學相干斷層掃描等成像技術空間分辨率高（如微米級），通常用于數百微米到毫米深度水平的研究［8-9］，這里不再做詳細展開，下文主要對熒光成像、生物/化學發光成像、光聲成像以及拉曼成像幾種常見的光學探測技術進行詳細介紹。

圖1 激發光引起的光-組織相互作用［1］（A），不同生物組織和脂肪乳組織仿體的約化散射系數在400~1 700 nm區域隨波長的變化［7］（B），人體血液中脫氧血紅蛋白（藍色）和氧合血紅蛋白（紅色）在1 mm長路徑上的吸收光譜［7］（C），水通過1 mm長路徑的吸收光譜［7］（D）Fig.1 Light-tissue interactions resulting from impinging excitation light［1］（A），reduced scattering coefficients of different biotissues and of intralipid tissue phantom as a function of wavelength in the 400-1 700 nm region［7］（B），absorption spectra of deoxyhaemoglobin（blue） and oxyhaemoglobin（red） through a 1-mm-long path in human blood［7］（C），absorption spectrum of water through a 1-mm-long path［7］（D）

1 熒光成像

熒光現象在19 世紀中期被發現，并在20 世紀初第一臺熒光顯微鏡問世后在生命科學領域嶄露頭角［10］。熒光成像的醫學應用可以追溯到1924年，當時在紫外線照射下觀察到了腫瘤中內源性分子卟啉的熒光信號［8，11］。熒光成像以熒光報告分子為標志，所用到的熒光材料包括無機材料，如上轉換材料、量子點，熒光蛋白以及其他有機材料等［12-14］。熒光成像技術的出現極大推動了微觀、介觀和宏觀成像系統，以及成像探針、微型化光纖方法等的發展，現已成為生命科學和醫學領域發展最快以及適應能力最強的成像技術之一。

1.1 熒光顯微技術

熒光顯微技術是較早發展起來的熒光成像技術。激光經過物鏡照射在樣品上并激發出熒光，被激發出的熒光經過同一物鏡后被檢測器收集（圖2A）。常見的熒光顯微成像技術有激光掃描共聚焦顯微成像、多光子（包括雙光子和三光子）顯微成像等。激光掃描共聚焦顯微成像成本低、應用廣泛，可以實現樣品斷層掃描成像與無損觀察，并可對細胞進行三維空間結構分析等。但可見光的組織穿透深度有限，且如果長時間觀察，光毒性易導致細胞死亡。近年來，基于近紅外光的雙光子顯微技術引起了學術與工業界的廣泛關注。雙光子吸收是指同時吸收兩個光子，是一種典型的非線性吸收過程［1］。雙光子吸收的光學躍遷與吸收光強的平方有關。雙光子顯微技術常用飛秒激光作為激勵。飛秒激光脈沖超短，可以提供較高的峰值功率和較低的平均功率。三光子吸收則是指同時吸收三個光子。與雙光子顯微鏡相比，三光子顯微鏡可以獲得更大的成像深度，但其對激光源和探測器的要求遠高于雙光子顯微鏡。目前多光子顯微成像已可獲得2 100 μm 以上深度的清晰血管二維圖像（圖2B），且其失焦光漂白小，從標記熒光物體（通過多個通道檢測）和二次諧波信號發出的光產生三維信息，可以在高空間分辨率下提供數小時的成像時長［15］。多光子顯微鏡有許多固有優點，包括提高穿透深度（近紅外光激發減少了生物組織中的散射和吸收）和減少光損傷。然而，受超快和高功率的激光器限制，多光子顯微鏡的成本較高，此外因為使用了更長波長，其分辨率理論上會下降。基于光纖的成像技術已被應用于活體顯微鏡，可實現原位成像，而小型化系統則使其在基于內窺鏡的臨床成像中具有重大優勢［16］。熒光顯微成像技術與激光散斑成像和光學相干斷層掃描等成像技術類似，具有較高的空間分辨率（例如微米級），它們在數百微米到毫米水平的深度領域具有廣闊的應用前景，例如可對細胞、組織切片和表層皮膚組織等進行超高分辨率的分析，但不適用于表面腫瘤（如異種移植）、手術暴露器官以及整個人體等的檢測。

圖2 熒光顯微技術示意圖［1］（A），成年小鼠體內血管的深部腦結構多光子顯微鏡成像［15］（B），在體寬場熒光成像示意圖（i）和吲哚菁綠（ICG）的光致發光光譜及靜脈注射ICG后的裸鼠熒光圖像（ii）［1，17］（C），FMT幾何結構示意圖（左），FMT成像系統（中）和在不同組織外圍獲得的理論平均熒光光子數與組織直徑的關系曲線（右）［18-19］（D）Fig.2 Schematic diagram of fluorescence microscopy［1］（A），in vivo deep-brain structural multiphoton microscopy images of blood vessels in adult mouse［15］（B），schematic illustration of the in vivo wide-field fluorescence imaging（i） and the photoluminescence spectra of ICG and fluorescence image of nude mice after intravenous injection of ICG（ii） ［1，17］（C），schematic diagram of FMT geometry（left），FMT imaging system（middle） and theoretical average fluorescent photon counts expected at the peripheries of different organs as a function of diameter（right）［31-32］（D）inset B：left：3D reconstruction of multiphoton microscope images of a mouse brain in vivo；right：2D image showing a blood vessel at depth of 2 100 μm（左側：在體小鼠大腦多光子顯微鏡圖像的3D重建，右側：2D圖像顯示深度為2 100 μm的血管）

1.2 在體寬場熒光成像技術

為獲得更高深度的檢測與成像能力，研究者們以犧牲部分橫向分辨率為前提發展成像技術，并配合使用高靈敏度的外源性造影劑，將熒光成像技術的深層檢測能力提高至數毫米及以上水平。例如在面向在體的寬場熒光成像技術（圖2C）中，組織樣本（如動物或人體）通常是被寬入射光束照射（該入射光束被調至感興趣的波段），同時利用低噪聲電荷耦合裝置在發射波長處拍攝高靈敏度圖像，搭配合適的濾光片和大孔徑透鏡，可提高光子收集效率［1，17］。這是目前最常見的大范圍熒光成像方法，當在同一側激發并收集熒光信號時稱為熒光反射成像（FRI），而透射式的熒光成像技術則從照明源的對側收集圖像。熒光成像使用光譜信息來區分不同的熒光顏料。例如，Yang等［18］證明，通過監測綠色熒光蛋白的熒光信號，可以對生長中的腫瘤進行簡單和無創的成像，進而實現腫瘤在活鼠體內生長和轉移的實時監測。熒光成像的對比度常受生物組織自體熒光的影響，Xu等［19］使用光譜解混技術提高檢測對比度，該技術是一種可以根據光譜特征將多種熒光染料與非特異性背景熒光區分開的技術。寬場熒光成像尤其是熒光反射成像在技術上易于實現，操作簡單，為進行高通量與快速的生物成像提供了強有力的工具。目前，這項技術已經可以用于手術治療卵巢癌［20］、前列腺癌［21］、乳腺癌［22］、黑色素瘤［23-24］、外陰癌［25-26］和宮頸癌［27］等疾病。寬場成像擴大了入射光斑尺寸，降低了入射激光功率密度（遠低于美國國家標準協會規定的最大激光照射量（MPE）閾值，低于該閾值的輻射量對被照射的表面組織產生的損傷可忽略不計），并可得到清晰與高對比度圖像，是在體檢測熒光報告分子最簡單的成像技術，廣泛地影響了生物醫學研究［28］。由于主要集中于對淺層結構進行觀察，目前基于單角度投影的寬場熒光成像所能獲取的深度信息通常在毫米到厘米范圍［29］。

1.3 熒光斷層掃描技術

熒光斷層掃描（FMT）基于多個光源-探測器對或多角度投影的方式進行檢測（圖2D），這種方式大大提升了熒光探測技術的探測深度。研究者們根據理論模擬的數據，認為FMT 可以將熒光源的信號檢測深度提升至數個厘米水平，例如在純肌肉組織中可提高至7 cm，半透明的乳房組織中則可提高至將近14 cm［30-31］。此外，FMT還可提供定量信息，通過對收集的數據進行重建，獲得熒光信號源的三維空間分布信息［30，32］。FMT 由擴散光學層析成像（DOT）發展而來，兩者均以光子在介質中的擴散原理為基礎［33］。不同的是，DOT是利用吸收效應來對組織固有的吸收物質（通常為血紅蛋白和脫氧血紅蛋白有關的內在結構）進行重建，而FMT 則是利用吸收和熒光測量對熒光染料進行重建。FMT 通過采用光纖光源或順序掃描點光源代替寬場成像模式下的廣域照明，以延長測量時間為代價來對每一個單獨的光源探測器進行測量［34］。2001年，Ntziachristos等首次開發了用于科研實驗的FMT系統，在渾濁介質中重建了熒光團的空間分布，整個過程可控制在10 min 左右，并將其用于小鼠腦瘤、纖維肉瘤等的檢測研究［33，35］。早期的FMT 系統采用將小鼠浸泡在指數匹配的液體中的方式，以簡化與邊界建模相關的理論約束來計算光傳播。通過不斷改進，在非接觸情況下，FMT 系統已經可以實現多種形狀物體的重建，并可進行360°旋轉檢測，提高了重建分辨率［36-37］。FMT 的靈敏度高，適用范圍廣，但空間分辨率相對較低（~1 mm）［8］。分辨率受限于光在組織中傳播的物理性質、樣品的解剖特征和組織光學參數的不確定性等。因此，FMT多與計算機斷層掃描（CT）/磁共振成像（MRI）等結合，利用后者提供結構先驗信息構建正演模型，以此改進光子的重建和視圖的可視化［34，38］。此外，由于近紅外二區窗口的低散射特性，也有研究者將FMT的探測窗口從近紅外一區拓展到近紅外二區，以此來降低散射效應對FMT信息獲取的影響［39］。FMT 高的組織檢測能力與優異的信息獲取能力使其在使用人類疾病動物模型研究新的診療方法中展現出強大的生命力。

2 生物/化學發光成像

生物/化學發光成像無需外部光源照明即可直接收集物體內部產生的光信號，避免了組織中固有熒光背景的影響，成像對比度高，同時具有更大的組織穿透潛力（相對于熒光成像而言）。

2.1 化學發光

化學發光是指某些物質在參加化學反應的過程中由于吸收了反應產生的化學能而被激發，并向外輻射光能量的過程。化學發光的靈敏度高，據報道，化學能轉化為光能的效率幾乎可達100%。目前化學發光成像的探測深度通常可達厘米水平。2020年，唐本忠團隊與羅亮團隊合作開發了一種化學共軛的近紅外化學發光材料［40］。他們通過將魯米諾（Luminol）與三苯胺-苯并噻二唑結合物（Triphenylaminecombined benzothiadiazole，TB）偶聯，合成了具有聚集誘導發光活性的近紅外化學發光發射體TBL（Triphenylamine-combined benzothiadiazole conjugates with luminol，TBL）分子，并利用表面活性劑制備了直徑約為20 nm 的TBL 納米顆粒。該TBL 納米顆粒的近紅外化學發光可以最高穿透3 cm 厚的火腿組織并被檢測器檢測到（圖3），并且能夠區分腫瘤組織和正常組織，在深部生物組織成像、原位癌癥診斷和手術治療領域都表現出良好的潛在應用前景。

圖3 不同豬火腿肉片覆蓋下的TBL（三苯胺和苯并噻二唑的結合物偶聯魯米諾）顆粒近紅外化學發光圖像（序號代表覆蓋的肉片數量）（A），豬火腿肉片的照片（10片肉片的總厚度為3 cm，每片肉片的厚度~3 mm）［40］（B）Fig.3 Near-infrared chemiluminescence images of TBL（triphenylamine-combined benzothiadiazole conjugates with luminol）dots covered by different slices of pork ham（the serial number represents the number of slices of pork ham covered）（A），photograph of pork ham（the total thickness of 10 slices is 3 cm and the thickness of each slice is ~3 mm）［40］（B）

2.2 生物發光

生物發光是一種特殊類型的化學發光，是指生物體發出的光輻射，其發光強度與標記細胞的數量呈線性相關性。生物發光成像是利用熒光素酶基因標記細胞或DNA，培養出能穩定表達熒光素酶的細胞株，然后將標記好的細胞接種到動物體內，再外源性給予熒光素，在三磷酸腺苷、氧氣存在的條件下，熒光素酶和熒光素反應，生成氧化熒光素并發光，最后利用光學檢測器直接監測活體中細胞活動和基因行為的成像技術。通過該技術，可以觀測活體內腫瘤的生長與轉移、疾病的發展以及特定基因表達等生物學過程。生物發光成像的探測深度通常也可達厘米水平，例如將生物發光染料的發射波長擴展至近紅外區域可以對活體小鼠的整個身體（>1 cm）進行探測［8，41］。生物發光成像目前已被用于蛋白質-蛋白質相互作用、基因表達模式和基因功能、傳染病與干細胞免疫學以及細胞凋亡等研究［42-45］。與熒光斷層掃描類似，生物發光也可以實現斷層掃描獲得三維信號源分布信息，并得到量化信息［46-47］。然而，外部光源的缺乏使生物發光層析成像（BLT）復雜化，導致其數學上的建模和解析更加困難，而且準確性可能降低。結合多視角成像和組織異質性的先驗信息可以提高生物發光逆問題求解的能力。2006年，有研究建立了一個獨立的BLT/CT雙模式成像系統，先對小鼠進行BLT數據采集，然后確保小鼠不動再采集CT 數據，最后利用從CT 中獲取的解剖信息對小鼠進行BLT 重建，提高了BLT 成像的準確性［48］。生物發光層析成像在體內的應用正在研究階段，未來有望得到應用。

化學/生物發光成像無需外部光源照明，避免了背景組織信號對檢測信號的影響，在深層成像領域中具有良好的應用前景。然而其適用范圍受到一些限制，例如有些物質無法進行生物發光標記，如抗體、多肽等。

3 光聲成像

光聲成像（PAI）是一種融合了光學照明和超聲檢測的成像模式，同時具備光學與超聲檢測的優勢，近幾十年在生物醫學成像領域獲得了飛速發展［49］。如圖4A所示，光聲成像技術通常使用短脈沖光源作為入射能量，內源性色素團（如氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白）或外源性造影劑（如有機染料和納米顆粒）吸收入射光源并將光能轉化為熱能使溫度上升，發生熱彈性膨脹及發射出超聲波并被超聲檢測器收集。由于聲信號在組織中的散射和衰減通常比光信號少得多，因此基于光聲的成像模式具有以更大的組織穿透性確定組織中光學吸收物質信息的潛力［50］。光聲成像可以在光學和聲學兩個維度上縮放其空間分辨率和成像深度，基于光學分辨的光聲顯微鏡（OR-PAM）具有較高的側向分辨率，但其成像深度通常限制在1 mm左右［51］。而當空間分辨率由聲學定義時，雖然高的中心頻率換能器可以提供高的空間分辨率，但頻率相關的聲學衰減也會限制成像深度。因此，基于聲學分辨的光聲顯微鏡（AR-PAM）系統的成像深度通常為幾毫米［52］。低頻的傳感器通常用于光聲斷層掃描（PAT），并已被證明可深入5.2 cm的離體雞肉組織檢測目標物的光聲信號（圖4B），而對應的入射激光輻射量僅為美國國家標準協會規定的皮膚最高激光照射閾值的七分之一，遠低于FMT 所需的輻射劑量［28，53-54］。且如果采用新的照明方案，例如通過從兩側照亮物體，可使成像區域翻倍，實現更高的成像深度［55］。將激發波長拓展到近紅外二區也可以提高成像深度，例如有報道利用基于磷酞菁的有機探針在1 064 nm 下進行光聲斷層掃描成像，在雞胸組織中達到了11.6 cm 的成像深度［56］。隨著光聲斷層掃描技術的發展，光聲成像在基礎科學、臨床前研究和臨床轉換等領域具有廣闊的應用前景。然而，聲學帶來高穿透性的同時，也帶來了其固有的局限，例如骨頭和氣腔會阻礙超聲傳播，對腫瘤的探測靈敏度低等，限制了其在相關疾病診斷中的適用性。

圖4 光聲成像（PAI）的原理圖［50］（A），深入穿透生物組織的PAI［54］（B）Fig.4 Principle of photoacoustic imaging（PAI） ［50］（A），deeply penetrating PAI in biological tissues［54］（B）photographs of the cross-section of chicken breast tissue in which a transparent tube containing methylene blue is embedded（i） and the entire sample（ii），PAI of the tube containing methylene blue（iii），overlaid PAI（pseudo color） and US（gray） image（iv）；the thresholded photoacoustic signals in the yellow dotted box in（iii） were overlaid with the US image in（iv）（嵌入含有亞甲基藍的透明管的雞胸組織橫截面（i）和整個樣品的照片（ii），含有亞甲基藍管的PAI（iii），PAI（偽彩色）和US（灰色）重疊圖像（iv）；（iii）中黃色虛線框內的閾值光聲信號與（iv）中的超聲圖像疊加）

4 拉曼成像

拉曼散射（Raman scattering），又稱拉曼效應，是指入射光波被物質散射后頻率發生改變的現象，可以用分子的振動能級進行解釋。若出射光與入射光頻率一致，則稱為瑞利散射，兩種散射的分子振動能級圖如圖5A所示［57］。當有入射光照射到樣品時，該樣品的分子產生的振蕩極化導致電子躍遷到受激虛態，處在虛擬能級上的電子會向低能級躍遷并向外輻射光子即散射光。當入射光能大于散射光能時，稱為斯托克斯（Stokes）散射；入射光能小于散射光能時，則稱為反斯托克斯（anti-Stokes）散射，Stokes和anti-Stokes散射統稱為拉曼散射［58-62］。Stokes散射通常比anti-Stokes散射強很多，因此，拉曼光譜儀檢測的通常為Stokes 線。入射和散射光子的能量差與入射光波長無關，只與材料不同振動能級的能級差有關。

圖5 拉曼散射與瑞利散射分子振動能級圖［57］（A），表面增強拉曼散射現象［65］（B），局域表面等離激元共振效應示意圖［67］（C），傳統的背散射拉曼檢測示意圖：激光激發和拉曼光子收集發生在同一點［74］（D）Fig.5 Diagram of Raman scattering and Rayleigh scattering molecular vibrational energy levels［57］（A），surface-enhanced Raman scattering phenomenon［65］（B），schematic diagram of localized surface plasmon resonance effect［67］（C），schematic of conventional backscattering Raman geometry：laser excitation and Raman photon collection take place at the same point［74］（D）

拉曼成像是指利用拉曼散射現象進行成像的手段，一般包括逐點掃描拉曼成像和寬場拉曼成像［63］。逐點掃描拉曼成像是最常見的一種拉曼成像方式，指在樣品的感興趣區域逐點激發并采集拉曼信號生成的圖像［64］。寬場拉曼成像則是將寬光束激光照射到樣品上感興趣的區域，散射光從整個區域被同時采集并被過濾，只有選定的較窄波段范圍內的拉曼散射光子被收集［63］。

4.1 表面增強拉曼光譜技術

拉曼光譜具有分子指紋特征，可以與背景很好地區分開；拉曼峰寬極窄，非常適合進行多重檢測或成像；且拉曼信號穩定性較高，不易發生猝滅或漂白。特別地，當分子靠近或吸附在金屬納米結構表面時，在入射光的激發下，分子的拉曼信號可被極大地增強，增強因子高達1014~1015，該現象稱為表面增強拉曼散射（SERS）效應（圖5B）［65-66］。SERS 效應自1974 年被首次發現以來，已被廣泛研究，其增強機制主要有兩種：電磁場（EM）增強和化學增強效應。EM 增強由金屬納米結構的局域表面等離激元共振（LSPR）效應引起，占主導地位。當照射到納米金屬結構與介質界面的入射光頻率與金屬中的自由電子振蕩頻率一致時，金屬表面的自由電子會產生集體振蕩，這一現象被稱為LSPR 效應（圖5C）［67］。LSPR 會導致金屬納米結構上局域電場的再分配，使在金屬納米結構表面附近形成一個電磁場增強區域，該區域通常被稱為“熱點”。吸附在“熱點”附近的分子除可以獲得極強的入射激光激發外，其拉曼散射過程也可以以同樣的方式被增強。

基于SERS 效應制備的納米探針稱為SERS 探針，主要由金屬納米基底和拉曼報告分子兩部分組成，有些SERS 探針還包括保護層和靶向分子［68］。與熒光染料和量子點等類似，SERS 探針也具有光學標記功能，是一種新型的成像造影劑［69-70］。近年來，SERS探針由于特異性強、靈敏度高、不易受光漂白、不受組織背景熒光干擾等優點，被廣泛應用于多重檢測或成像，已成為最具發展前景的光學探針之一。目前SERS探針在小鼠腦膠質瘤、前哨淋巴結和前列腺癌等模型中均成功實現了腫瘤邊緣浸潤和多灶性局部腫瘤擴散的精確成像［71-73］。常規的拉曼檢測方式是背散射式檢測（圖5D）［74］，然而由于生物組織對光子的散射和吸收較強，背散射拉曼檢測受到組織穿透深度的限制，一般約為幾個毫米［75］。

4.2 深穿透拉曼光譜技術

深穿透拉曼光譜（DRS）技術的出現極大地提高了拉曼光譜的深層檢測與成像能力［74，76-77］。DRS 檢測基于生物組織的高散射特性，即來自深層的光子到達組織表面時會產生較大的空間偏移。因此DRS技術在空間上對激光入射區域與信號收集區域進行分離，有效抑制了淺層的背景信號，并可獲取更多來自深層的拉曼光子，從而提高來自深層目標物（即信號源）的信背比，實現更大的檢測深度。深穿透拉曼光譜技術通常包括兩種形式：空間偏移拉曼光譜（SORS）和透射拉曼光譜（TRS）。

SORS 由Matousek 等在2005 年提出［78］，他們通過在激發區域和收集區域之間實現一定的背向散射物理偏移，獲取了更高信背比的深層信號源的信號，并將利用該檢測方式獲得的光譜稱為空間偏移拉曼光譜（圖6A）［78-79］。SORS與SERS的結合，稱為表面增強空間偏移拉曼光譜（SESORS），該技術兼具了SERS 的信號增強能力與SORS 的深穿透優勢，可以實現更深層的樣品檢測。空間偏移量僅為微米到毫米水平時，即可在深達0.5~0.675 cm 的離體豬肌肉組織和0.8 cm 的骨中檢測到SERS探針的信號［80-82］。此外，Nicolson 等［83］將靈敏度更高的表面增強共振拉曼散射（SERRS）探針與空間偏移拉曼光譜相結合，成功通過2.5 cm 厚的離體豬肌肉組織檢測到該納米探針的信號，并實現了離體豬肌肉組織1.5 cm深處三維乳腺癌腫瘤模型的檢測。Berry 等［84］則利用SORS 技術成功檢測到埋在4.8 cm 豬肌肉深處的SERS探針的信號，是目前報道的利用SORS技術實現的最大離體組織檢測深度（圖6B）。最近，Nicolson等［85］繼續成功在活體小鼠中通過顱骨檢測出膠質母細胞瘤多形性腫瘤（圖6C）。雖然此項研究已經證實了在體小鼠腫瘤的共振SESORS成像，但探測深度僅限于穿過小鼠顱骨的厚度（~0.2 cm）。

圖6 SORS原理圖和利用514 nm波長測量由1 mm 聚甲基丙烯酸甲酯球層和2 mm反式二苯乙烯粉末層組成的雙層系統收集的拉曼光譜［78-79］（A），使用手持式SORS光譜儀通過60 mm豬組織追蹤1，2-二（4-吡啶基）乙烯（BPE）納米探針［84］（B），整合素靶向SERRS納米探針的示意圖、用于多形性成膠質細胞瘤的體內成像以及使用SORS成像方法通過顱骨檢測到的SERRS探針/骨的約束最小二乘貢獻結果［85］（C）Fig.6 Principle of SORS and Raman spectra collected from a two-layer system consisting of a 1 mm layer of poly（methyl methacrylate）（PMMA）spheres followed by a 2 mm layer of trans-stilbene powder measured using the 514 nm probe wavelength［78-79］（A）（ΔS：spatial offset），the tracking of BPE nanotags through porcine tissue up to 60 mm using a handheld SORS spectrometer［84］（B），concept of integrin-targeted SERRS-nanotags for in vivo imaging of glioblastoma multiforme using SORS and the detection and constraint least squares contribution of SERRS NPs/bone through the skull using a SORS imaging approach［85］（C）

TRS 是DRS 的另一種形式［86］。TRS 通過將激光入射區域和拉曼探測區域分離在樣品的對側實現檢測（圖7A）［87］，可被認為是SORS 的一種特殊形式，即其激光照明區域和信號收集區域的空間偏移量達到了無限大，因此TRS 與SORS 一樣，均具有深層檢測能力［88-89］。但與SORS 不同的是，TRS 模型反映的是檢測體積內整體信息的組成，因此不受檢測系統的影響或不同空間偏移量采樣問題的限制，這使其在非侵入性檢測樣品內部信息領域（如藥物樣品的主成分含量等）具有廣闊的應用前景。例如Aina等［90］使用TRS 對待測藥物模型配方中的多晶成分含量進行定量研究，結果表明，使用TRS 對多晶型進行量化的準確性遠遠超過基于SORS 的準確性。此外，該技術還有效抑制了從涂層或膠囊層發出的熒光和拉曼信號。

圖7 透射拉曼光譜示意圖［87］（A），透射拉曼測量示意圖（左）及不同厚度豬肉組織覆蓋下測得的透射拉曼光譜（右）［93］（B），將SERS管（填充有SERS納米探針）埋在豬肉組織中的TRS裝置照片和將SERS管放置在信號收集面（d=0）時透過不同厚度的豬組織收集到的拉曼光譜［94］（C），對深部腫瘤進行無創體內成像的示意圖和SERS凝膠（含有SERS納米探針的瓊脂糖凝膠充當腫瘤類似物）的植入過程照片（左）以及透射成像結果（右）［94］（D）Fig.7 Schematic diagram of TRS ［87］（A），schematic diagram of transmission Raman measurement（left），transmission Raman spectra measured with different thicknesses of pork tissue covering（right）［93］（B），the photograph of TRS setup with a SERS tube（filled with SERS nanoparticles） buried in pork tissue and the collected Raman spectra through pork tissue with different thicknesses when the SERS tube was placed on the collection surface（d=0）［94］（C），schematic of noninvasive in vivo imaging of deepseated tumor and photographs of the implantation process of SERS gel（agarose gel containing SERS nanoparticles that act as tumor analogues）（left），and the transmission imaging results（right）［94］（D）the inset in D shows the photograph of the two SERS gel cubes and the green box indicate the plane positions of the two SERS gels（D圖插圖展示了兩個SERS凝膠立方體的照片，綠色框表示兩個SERS凝膠的平面位置）

除上述優勢外，基于檢測形式的差異，TRS的可穿透組織厚度理論上可達SORS可檢測深度的兩倍或以上，這是因為SORS 收集的是背向散射拉曼光子，入射光進入到組織并激發拉曼光子后，該拉曼光子必須再按原方向返回到組織表面才能被檢測到。近年來，將TRS與SERS相結合的表面增強透射拉曼光譜（SETRS）技術為醫療應用開辟了新的途徑，如進行骨成分分析和癌組織分析等［86，91］。Xie等［91］將納米探針放置在2 cm 厚的豬肌肉組織樣本中，通過SETRS從骨骼表面的納米探針精細分布中獲得可識別的納米探針信號，證明了SETRS 具有非侵入性跟蹤體內雙膦酸鹽的潛力。Stone 等［92］將4 種獨特的SERS納米顆粒注射到一個厚2 cm 的豬組織塊中，首次從2 cm 厚的組織中檢測到多重SERS信號，并重建出偽彩色圖像證明了SETRS進行多重成像的能力。而通過增加納米顆粒的數量/濃度，他們還成功透過5 cm 厚的豬肌肉組織檢測到了埋在其中的SERS納米探針信號。此外，2022年Stone等通過進一步研究并使用更大的顆粒注射劑量，利用SETRS 成功通過厚度約7.1 cm 的生物組織檢測到了小鼠腫瘤（圖7B）［93］。

為了進一步提高可探測的組織厚度，最近本研究小組從光子在透射拉曼檢測中的傳播過程以及測量因素入手，系統研究了實驗參數（組織厚度、SERS 探針的深度位置、探針亮度、激光功率和光斑尺寸）對SETRS 探測厚度的影響［94］，發現：（1）透射拉曼信號與信號源的深度位置之間呈不對稱的U 型關系，說明病變位于組織中部時信號最弱，對SETRS 的檢測最具挑戰性；（2）提高SERS 探針的亮度是增加檢測深度/透射組織厚度最直接有效的途徑；（3）激光光斑尺寸的增大對深部病灶的透射拉曼信號強度幾乎沒有影響。因此，可以采用較大的激光束尺寸來降低功率密度，這對SETRS 的臨床轉化至關重要，因為過高的激光輻射量會對被照射的組織表面造成潛在的光輻射危害。基于上述發現，筆者團隊設計制備了超亮的近紅外SERS 探針，開發了一個具有深層檢測能力和光安全性（即入射激光劑量低于MPE閾值）的拉曼檢測/成像系統。基于該系統，首次利用符合MPE標準的入射實現了包埋在體外14 cm厚的豬組織中SERS探針的檢測（圖7C），比目前已報道的TRS最高檢測厚度提高了約1倍。該數值接近成人身體的厚度（腹部-背部距離15~30 cm），揭示了將TRS技術推向人體無創全身檢查的可能性。此外，還在MPE標準內實現了未剃毛小鼠（1.5 cm厚）體內深層SERS探針的活體無創成像（圖7D）。相比之下，傳統的背散射檢測方式無法實現拉曼成像。該工作為透射拉曼光譜技術在體內非侵入性生物醫學檢查方面的發展提供了新的思路，證明透射拉曼光譜有望成為未來臨床癌癥診斷的可行工具。

5 總結與展望

綜上所述，隨著光學探測技術的不斷發展，已產生出了針對不同檢測深度進行研究的成像技術，組織深度覆蓋微米到數厘米甚至10 cm以上的范圍（表1），并且所使用的入射激光劑量能夠在臨床安全范圍內，極大地提升了光學檢測與成像技術的臨床轉化能力。例如基于深穿透拉曼光譜的拉曼檢測與成像技術特異性強，目前已能透過14 cm 的生物組織探測信號，在生物檢測、成像、診斷、術中導航等領域具有廣闊的應用前景。深度限制的進一步改進將極大地促進治療策略設計、手術規劃和手術導航技術的完善以及臨床應用的發展。預計未來可從以下幾個方面繼續深入研究，進一步提高光學檢測與成像技術的深層探測能力：

表1 各個成像模態的組織檢測深度與特點Table 1 Tissue detection depths and characteristics of each imaging modality

（1）將光學窗口拓展至更長的波長，如近紅外二區（NIR-Ⅱ），以降低生物組織對光子的散射及吸收作用，包括NIR-Ⅱ成像探針的設計與合成以及具有高靈敏度的NIR-Ⅱ檢測裝置的設計與搭建［7，75，95］；

（2）結合組織光學透明化技術，降低生物組織對光的散射與吸收，提高光子在組織中的穿透能力［96］；

（3）對于需要激發光源的熒光、光聲和拉曼成像技術，可以結合波前整形技術，實現散射介質深處的光學聚焦，提高病變處產生的信號強度，進而提高生物組織的檢測深度/厚度極限［97］；

（4）利用多角度投影和檢測的方式提高穿透性能。目前部分光學探測技術例如熒光成像（熒光分子斷層掃描）和光聲成像（光聲斷層掃描）已利用多角度投影與檢測的方式實現了更高的探測深度，未來深穿透拉曼光譜技術可從該方向入手，進一步提高檢測深度至超過成人軀干厚度水平（腹部-背部距離15~30 cm）［30-31，53］。

此外，納米探針在體內的生物相容性和靶向腫瘤的效果也值得關注，可以通過選擇合適的表面修飾或配體來改善顆粒的體內適用性。開發局部注射和使用納米探針的體內應用場景（如前哨淋巴結成像）也是非常有前景的研究方向。在這些場景下，需要在前哨淋巴結/病灶周圍注射納米探針，探針在前哨淋巴結/病灶中富集，而去除前哨淋巴結/病灶以及包含在其中的納米探針將會顯著降低生物安全的風險。另外，隨著生物光學成像技術深層檢測能力的不斷提高，一些病灶定位方法的發展，包括病灶深度快速預測原理、深度預測算法、光學重建算法以及多個探測角度等軟件和硬件的配合，將使光學檢測與成像技術的應用更加廣泛［84，98-100］。