面向腫瘤微環境的響應型表面增強拉曼光譜探針的研究進展

張澤東，董建國，張裕英

（南開大學 醫學院，天津 300071）

惡性腫瘤的發病率和死亡率逐年上升，嚴重威脅著人類的健康［1］。腫瘤微環境（TME）是腫瘤發生發展的“土壤”，由細胞和非細胞成分組成。其中，細胞成分包括腫瘤細胞、浸潤性免疫細胞（T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓源性抑制細胞等）和基質細胞（癌癥相關成纖維細胞、內皮細胞、血管上皮細胞等）；非細胞成分包括各種細胞因子、生長因子、趨化因子和細胞外囊泡等［2-3］。在腫瘤生長與惡化的過程中，往往伴隨著pH 降低、氧化應激增強、乏氧、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）濃度增大及某些酶發生過表達等特性的微環境。TME 是一個高度動態的、復雜的環境，其與多步驟腫瘤發生過程一起演變［4］。近年來，人們越來越認識到這個生態系統在腫瘤進展和轉移的過程中起著至關重要的作用［5］。同時，這些因素也為癌癥的診斷與治療提供了更多可能的途徑。

在過去的幾十年里，表面增強拉曼光譜（SERS）分子成像取得了重大進展，在生物醫學和臨床轉化中的應用引起了廣泛關注［6］。SERS是一種利用金屬納米結構的局域表面等離子體共振現象來放大拉曼光譜信號的強大技術，能夠呈現分子的指紋圖譜信息。SERS具有高靈敏度、高特異性和抗生物干擾等突出優點，非常有利于復雜生物基質中的生物標志物檢測［7-9］。與人體正常內環境相比，腫瘤微環境具有弱酸性、乏氧、活性氧水平上升和某些酶的表達上調等生理特性。利用此特征，研究者們在金屬納米粒子表面修飾上對腫瘤微環境敏感的拉曼信號分子制備成響應型SERS 探針（圖1A），通過譜峰位置或強度的變化針對這些區別于正常內環境的生理特征進行鑒別（圖1B）。本文總結了響應型SERS 探針應用于腫瘤微環境檢測的最新進展。

圖1 表面增強拉曼光譜探針的制備（A）及應用于腫瘤微環境檢測（B）示意圖Fig.1 Scheme of fabrication of SERS probes（A） and their applications in detection of TME（B）

1 針對腫瘤酸性微環境的檢測

過去幾年，越來越多的證據表明，與正常的組織相比，TME 在血管生成、有氧呼吸以及代謝狀態等方面有顯著不同。與正常細胞通過氧化磷酸化獲取能量的方式不同，腫瘤細胞因為脈管系統分布不均勻，供氧量不足，所以只能利用無氧糖酵解產生的能量（也稱Warburg效應）。因此，腫瘤細胞會產生大量的乳酸、氫離子以及二氧化碳，從而導致細胞外TME酸化，pH值在6.5~6.9之間，使腫瘤轉移的風險增加，治療難度加大［10-12］。基于此，研究人員設計了pH 響應型SERS 探針對細胞和腫瘤微環境中的pH進行檢測分析，也有一部分研究對酸性微環境刺激納米藥物釋放體系進行跟蹤監測（表1）［13-29］。

表1 pH響應型SERS探針文獻總結Table 1 Application of SERS probes in detection of pH

1.1 細胞外和細胞內pH檢測

細胞外pH 值（pHe）是許多細胞過程和疾病病理的重要化學因子。基于SERS 的pHe 檢測可作為一種重要的原位成像分析方法，用于長期跟蹤pHe的變化，以了解單細胞水平上的細胞過程。Xu等［13］在組裝有AuNPs的玻璃基底上修飾pH 敏感分子4-巰基吡啶（4-Mercaptopyridine，4-MPY）用于細胞凋亡過程中的原位pHe監測，通過4-MPY 的兩個SERS 特征峰強度比值（I1610/I1575）的變化可以識別不同的pH 值（圖2A）。他們發現，在培養基中加入轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）后，pHe 先呈快速下降趨勢，隨后緩慢下降，直至細胞功能完全喪失，細胞內外pH 值趨于相近。Skinner 等［14］將pH 響應拉曼報告分子4-巰基苯甲酸（4-Mercaptobenzoic acid，4-MBA）修飾在金包覆聚氨酯電紡納米纖維表面，開發了一種用于實時測量pHe 的SERS 傳感器。通過在該SERS 傳感器上培養HepG2/C3A 細胞，并在細胞-纖維界面處測量pHe，發現SERS 探針可以區分由于不同代謝活動導致的局部pH 變化。隨后，研究人員用非特異性蛋白激酶抑制劑星形孢菌素（Staurosporine，STS）處理HepG2/C3A 細胞，發現細胞的形態學變化能夠指示細胞凋亡，同時伴隨著局部pHe 的增加。微囊化細胞在多種疾病的治療方案中取得了廣泛的進展，特別是在保護移植細胞免受免疫排斥的方面。然而，由于缺乏合適方法跟蹤監測體內微囊的位置、穩定性和移植后細胞活力和增殖行為的改變，細胞治療仍然存在一些挑戰。Zhang等［15］制備了AuNS-4MBA-PAH SERS 探針放置在微囊細胞外層，用于封裝細胞的微環境成像和局部pH變化的感知，進而能夠以非侵入性的方式提供有關微囊化細胞死亡情況的信息。

圖2 SERS探針應用于腫瘤微環境中pH檢測示意圖Fig.2 Scheme of SERS probes for pH detection

細胞內pH 值（pHi）是細胞生理和病理狀況的關鍵指標，利用SERS對pHi進行可視化監測對了解細胞過程具有重要的作用。然而，傳統的二維成像分析往往不能反映整個細胞體積內的變化。因此，Zhang等［16］設計了一種pH響應的SERS 探針（AuNS-4MBA-PA），在二維和三維尺度對細胞內的pH值進行可視化監測（圖2B）。陽離子聚合物聚L-精氨酸（Poly-L-arginine，PA）作為SERS探針的最外包覆層能夠使探針的細胞內化效率和生物相容性得到顯著提高。他們以乳腺癌細胞系MCF-7為模型，通過二維SERS成像觀察了納米探針在內吞過程中局部pH的變化情況，并通過三維 SERS成像實驗，觀察到探針在細胞核周邊位置積聚，同時所在位置的局部pH 降低。SERS 探針與細胞共孵育后，部分探針被細胞內吞，另一部分黏附于細胞膜或細胞培養皿上，采用光學顯微鏡難以區分探針的確切位置。針對此現象，Bai 等［17］利用一種不能穿透活細胞細胞膜的刻蝕液對樣品進行處理，細胞外的探針被刻蝕失去SERS 信號，而被細胞吞入的探針仍能保持較高的SERS 信號，因此能夠更加準確地對pHi 進行檢測分析。溶酶體的酸性環境在細胞的多種功能中起著重要作用，溶酶體pH值的異常變化可引起包括腫瘤在內的多種疾病。由此，Zhang 等［19］設計了一種基于AuNPs-i-motifs 的SERS 探針對溶酶體內的pH 變化進行動態監測。在溶酶體成熟過程中，探針的質子化會導致富含胞嘧啶的單鏈DNA（Single-stranded DNA，ssDNA）序列構象發生變化，從而引起AuNPs聚集產生熱點使報告分子的拉曼信號顯著增強。該探針可以指示溶酶體成熟過程中pH 的動態變化，這為研究溶酶體功能失調細胞的病理生理事件提供了新的工具。

雖然由金屬納米粒子構成的SERS 探針具有很高的pH 靈敏性，但由于納米粒子在經細胞胞吞后大部分存在于溶酶體中，因此能夠反映的細胞內pH 信息是有限的，并且在細胞中檢測到的pH 值與其生理狀況之間的關系仍不明確。Zhang 等［20］提出了采用一種金沉積銀納米線（Au-dep AgNWs@MBA）SERS探針進行特定位點的pH 傳感，將該探針插入活的HeLa 細胞的細胞質或細胞核中，能夠以高時空分辨率和靈敏度研究細胞質和細胞核的pH 變化（圖2C）。此外，還應用該探針分別監測了CoCl2和順鉑治療前后HeLa 細胞內細胞質和細胞核pH 的變化。Zhao 等［21］報道了一種利用嵌段共聚物刷層模板和配體交換來制造高重復性和穩定性的SERS 活性納米纖維的策略。該SERS 探針具有低侵入性、高靈敏度以及高時空分辨率能力，能夠檢測乳腺癌細胞的pHi 和pHe 梯度。檢測發現MCF-7 細胞內的pH 平均值為7.26 ± 0.27，還觀察到與單層培養MDA-MB-231 細胞不同間距的地方pH 梯度分布廣泛（ΔpH=0.1~0.9），表明了腫瘤細胞的異質性。Guo 等［22］開發了一種4-MBA 修飾SERS 納米管，通過優化納米管的幾何形狀和尖端AuNPs 的表面密度，可在最小的損傷下對單個活細胞進行長期可靠的細胞內pH 分析。隨后，他們改變細胞外pH環境，比較癌細胞和正常細胞細胞質pH值的變化，結果表明宮頸癌HeLa細胞相比于成纖維細胞能夠更好地抵抗pHe 變化，適應弱酸性環境。同時準確檢測pHi 和pHe 對于研究癌細胞復雜的生理活動和探索pH 相關的治療機制至關重要。Fang 等［23］開發了4-MBA@AgNW 作為pH傳感SERS探針。將該探針應用于二維和三維培養腫瘤細胞的原位pH檢測，可以更好地了解pHi和pHe之間的差異。實驗結果表明，三維培養多細胞球（Multicellular cancer spheroid，MCS）的pHi和pHe 均低于二維單層培養腫瘤細胞，這可能是由于 MCS內部細胞缺氧所致。此外，通過4MBA@AgNW 也能準確檢測在順鉑處理期間癌細胞pHi 和pHe 值的變化，這將有助于深入了解pH 相關的病理過程和治療機制。

近年來，pH 響應型SERS 探針已經開始應用于術中影像導航。Yang 等［24］將pH 響應SERS 探針Ag@MPY 應用于快速識別膠質瘤邊界。通過在腫瘤組織表面構建純水滴陣列，使組織間液擴散到水滴中，然后將水滴轉移到SERS基底上，采用便攜式拉曼光譜儀獲得SERS光譜（圖2D）。由于腫瘤區域的酸化特性，他們可以通過所檢測組織的不同pH值準確區分腫瘤組織與正常組織的界限。該技術操作方便，能夠準確、無創、快速地測定局部pH值，從而最大限度地切除腫瘤組織，同時減少對正常組織的損害。與此類似，Jin 等［25］建立了一種智能SERS 導航系統用于描繪膠質瘤的酸性邊緣。他們通過深度學習模型對SERS 芯片采集的拉曼光譜進行自動處理，能夠加快描繪腫瘤切除床的pH 分布圖，并在動物模型的腫瘤邊緣和膠質瘤患者的切除組織中證實了酸度與癌細胞密度和增殖水平相關。與目前臨床實踐中使用的常規方法相比，SERS 系統引導手術切除后，動物模型的總體生存率顯著提高。該SERS檢測系統有望進行臨床轉化，將來應用于酸性邊緣引導的浸潤性實體瘤切除手術。

1.2 pH響應藥物遞送系統的跟蹤檢測

卡鉑（Carboplatin，CBP）是卵巢癌治療中最常用的細胞毒性藥物。Potara 等［26］設計了一種集化療、pH傳感和多模態追蹤功能為一體的CBP-4MBA-chit-AgNTs SERS 探針。他們利用暗場和微分干涉差顯微鏡研究了CBP-4MBA-chit-AgNTs 在NIH∶OVCAR-3 卵巢癌細胞內不同層面的攝取分布情況，并通過雙光子激發熒光壽命成像和共聚焦拉曼顯微鏡進行示蹤分析，對探針所在位置的pH 分布進行檢測。同時，體外細胞增殖實驗清楚地表明所制備的多功能SERS探針能夠有效抑制癌細胞生長。

實時監測藥物釋放的性能是評估載藥系統藥效的關鍵。Huang等［27］提出了一種新型的pH 響應納米載藥系統，用于通過SERS 實時監測藥物釋放和進行光化學治療。他們合成了具有高SERS 活性和穩定性的GO-Fe3O4@Au@Ag-MPBA-DOX 納米復合材料，同時涵蓋實時SERS 監測、磁共振（Magnetic resonance，MR）成像和pH 響應藥物釋放的功能。在這種納米復合材料中，沉積在氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）納米片表面的Fe3O4@Au@Ag NPs-4MPBA 通過硼酸基團與阿霉素（Doxorubicin，DOX）結合形成pH 敏感的SERS探針。以人乳腺癌細胞系MCF-7為模型，研究了SERS探針在癌癥治療中的監測性能，結果表明SERS光譜能監測DOX釋放，化療聯合GO介導的光熱療法能有效地抑制癌細胞和腫瘤異種移植物，且無明顯副作用。該納米復合載體系統具有良好的生物相容性、優異的SERS活性和穩定性、較高的光熱轉換效率、活躍的腫瘤靶向性和靈敏的近紅外及pH響應藥物釋放能力，有利于癌癥的高效光化學治療。Zhang等［28］采用“點擊化學”的方法制備了含有PEG和兩種DNA的Janus納米顆粒（JNPs）。在腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine 5’-triphosphate，ATP）或酸性條件下，所制備的JNPs可形成二聚體，生成的“熱點”有利于癌細胞的原位SERS檢測和成像分析。作為pH傳感器，SERS信號隨pH 值從8.0到4.0的降低而增加；同時，JNPs另一側負載的藥物和光敏劑產生化療和光動力治療的協同抗腫瘤作用。體外和體內實驗驗證了所制備的JNPs具有良好的抗癌作用。在納米顆粒上修飾核蛋白核酸適配體能提高選擇性檢測和進行靶向治療。此外，Managò 等［29］描述了能在結直腸癌細胞中實時監測Galunisertib（LY2157299，LY）釋放的DNP-AuNPs-LY@Gel 納米復合物。從納米復合物中釋放LY 是時間和pH 依賴的，在生理pH 值（7.4）時，明膠層緊密折疊，藥物保留在納米系統中。相反，在酸性環境（5.5）下明膠分子發生降解，釋放LY。在結直腸癌CRC 細胞中，由于外部微環境中乳酸的積累使pH 呈酸性及基質金屬蛋白酶2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）過度表達，從而促進了藥物釋放。通過SERS 可以監測納米顆粒的內化并量化LY 的釋放。DNP-AuNPs-LY@Gel 復合物釋放LY 可抑制CRC細胞增殖并誘導間充質-上皮轉化（Mesenchymal-to-epithelial transition，MET），與游離藥物相比治療效果更好。

2 針對活性氧的檢測

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）主要描述氧在體內的單電子還原物質，包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（?O2-）、單線態氧（1O2）、羥基自由基（?OH）等［30-31］。由于致癌刺激、線粒體功能障礙、細胞增殖失控及代謝活動增加等因素，癌細胞表現出內在氧化應激增加［32］。近年來，針對腫瘤微環境中總體活性氧或單種活性氧物質進行檢測的SERS探針均有文獻報道［33］。

2.1 總體活性氧

Kumar等［34］設計并合成了一種肌紅蛋白和聚多巴胺工程化的SERS（MP-SERS）探針，能對活細胞中的ROS進行檢測和時空成像，并且還可以有效地監測饑餓誘導活細胞的自噬過程。MP-SERS探針中肌紅蛋白包含的六配位Fe（III）-OH2可與ROS 反應形成Fe（IV）=O，其特征拉曼峰可以用于分析和量化ROS（圖3A）。實驗結果表明，癌細胞與非癌細胞表現出不同的ROS分布，采用細胞穿透線粒體靶向肽序列對MP-SERS探針進行修飾可以特異性地將探針遞送到線粒體中以對線粒體ROS進行成像。這是首個能夠實時監測饑餓誘導活細胞自噬過程的SERS 納米探針。ROS 水平和磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol 3 Kinase，PI3K）蛋白含量是表征細胞凋亡狀態的兩個重要參數。Wan 等［35］采用AuNRs@MPBA SERS 探針監測細胞內ROS水平和磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（Phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PI（3，4，5）P3）的含量，反映PI3K/Akt 通路的調控作用。采用拉曼峰強度比I1071/I997計算細胞內ROS水平，776 cm-1處的拉曼峰檢測PI（3，4，5）P3含量。當ROS水平顯著升高時，線粒體膜電位降低，表明細胞內ROS水平對PI3K/Akt通路具有動態調節作用。Lü等［36］提出了一種基于冠狀殼納米顆粒的多模態成像策略，以研究三種典型的癌癥生物標志物（MUC1，miRNA-21，ROS）在活細胞中的相關表達和協同作用。先在共價有機骨架（Covalent organic framework，COF）薄層上修飾ROS 響應的拉曼報告分子2-Mercaptohydroquinone（2-MHQ），然后在COF 層功能化上Cy5 標記的MUC1 核酸適配體和miRNA-21 響應的異硫氰酸熒光素（FITC）標記的發夾DNA。當納米材料與細胞膜接觸時，MUC1 和核酸適配體鏈之間的識別引起Cy5 的熒光恢復；在內化后，miRNA-21 與發夾DNA 間的雜交可誘導FITC的熒光恢復。因此，通過熒光成像可以可視化MUC1和miRNA-21的表達。在ROS存在的情況下，2-MHQ 分子可被氧化為2-Mercaptobenzoquinone（2-MBQ），引起SERS 光譜發生變化。因此，該設計可以實現3 種癌癥生物標志物的多模態成像，為在三維細胞球體和復雜的細胞環境中可視化各種生物標志物鋪平道路。

圖3 SERS探針應用于腫瘤微環境中活性氧檢測示意圖Fig.3 Scheme of SERS probes for ROS detection

電刺激（Electrostimulation，ES）是一種重要的通過細胞內電活動進行治療的方法。此外，它還能誘導細胞凋亡，是一種潛在的腫瘤治療方法。Chen 等［37］設計了一種基于Au@MBN@Ag nanorods 的SERS探針，以檢測在ES過程中產生的細胞內ROS。其傳感機制是基于ROS可以蝕刻銀殼，形成更薄、受損的銀殼，從而削弱SERS 信號。通過在SERS 探針表面修飾多肽，可幫助其靶向到達目標細胞器，以檢測在線粒體、細胞核中產生的局部ROS。監測細胞在化療藥物刺激下產生的ROS 對了解藥物誘導細胞毒性的機制具有重要意義。Wang 等［38］構建了一種基于Ag/Au nanoshell 的新型比色和SERS 雙響應傳感器，用于細胞中ROS的檢測。通過ROS誘導的銀粒子降解，該納米探針的紫外吸收光譜和拉曼信號發生明顯變化。在此基礎上，實現了抗癌藥物刺激的細胞內ROS檢測，證實了順鉑、紫杉醇、阿霉素和5-氟尿嘧啶可以刺激ROS的產生。

2.2 過氧化氫

過氧化氫是細胞內活性氧的代表之一，內源性H2O2水平被認為是反映惡性腫瘤發生和發展的一個重要指標。因此，開發SERS 探針用于活體細胞內的原位和可視化監測對腫瘤的早期診斷和有效治療十分重要。

Peng 等［39］開發了一種基于金納米棒的比例型SERS納米探針，用于活細胞和組織中H2O2的檢測。4-巰基硼酸酯（4-mercaptophenylboronic ester，MPBE）是傳感H2O2的理想底物，苯硼酸酯與H2O2反應生成苯酚，致使993 cm-1處由于B—O 對稱拉伸引起的強拉曼信號降低或消失，而1 071 cm-1處由于C—H 面內變形引起的拉曼信號不變，從而實現基于I1071/I993峰強度比值的H2O2定量檢測。通過比例型策略能克服由于分子吸附不均勻和增強底物分布不規則而導致的SERS 信號重復性差的問題。實驗結果表明，GNR/MPBE 探針可有效地進入活細胞中，對目標H2O2進行特異性、高信噪比成像。Wang 等［40］提出了一種利用Fe3O4@Ag 核-衛星無標記納米顆粒對單個癌細胞內H2O2進行SERS超靈敏原位成像的策略。在H2O2存在下，Fe3O4@Ag NPs 能高效、選擇性地催化過氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺（Tetramethyl benzidine，TMB）的氧化。通過建立H2O2水平與TMB 催化氧化產物的SERS 強度之間的相關性，可對活細胞內的H2O2進行原位監測（圖3B）。在佛波酯（Phorbol myristate acetate，PMA）刺激單個B16 細胞后，采用Fe3O4@AgNP SERS 探針進行原位SERS 成像，能夠量化細胞內H2O2并實現對釋放到胞外H2O2的可視化。小尺寸等離子體納米粒子易于被細胞和細胞器內化，但通常具有較低的SERS 活性，限制了其在細胞內SERS 分析中的應用前景。為了打破目前細胞內SERS應用的瓶頸，Jin等［41］首次提出了一種小尺寸（約10 nm）單分散核殼結構Ag/o-GQDs 納米雜化的有效策略。Ag/o-GQDs 表現出優異的SERS 靈敏度和高效的納米酶催化活性，通過催化類過氧化物酶的反應，可實現在亞細胞水平上精確感應細胞內H2O2。此外，Ag/o-GQDs納米酶催化ROS生成和雙靶向的能力也為腫瘤的特異性協同催化治療提供了一個有前景的新途徑。

Zhang等［42］采用簡單的方法制備了多通道響應型Au@MnO2@MBN SERS 探針，實現了不同生物環境下對H2O2的傳感。在該系統中，MnO2殼被用作H2O2響應調節器來調節拉曼報告分子與SERS 基底之間的距離。伴隨著H2O2對MnO2殼層的降解，裸露的Au NP核和游離的Mn2+被釋放，導致顏色明顯變化和T1-MR 信號開啟。同時，拉曼報告分子吸附在暴露的Au NPs上，產生強SERS信號（圖3C）。該多功能納米平臺已被應用于裸眼感知H2O2的體外檢測、單細胞水平的SERS 成像和體內核磁共振成像。這種多通道響應型SERS 探針為各種領域的H2O2檢測提供了新的平臺。Shen 等［43］設計并合成了一種具有雙響應特性的新型MnO2@Ag@PMBA 核-衛星結構SERS 納米探針用于H2O2的靈敏檢測。在H2O2存在下，MnO2和Ag NPs 發生降解，導致SERS 信號發生變化，進而顯著提高納米探針的靈敏度。此外，實驗驗證了該探針在饑餓誘導的細胞自噬過程中能夠檢測H2O2水平。

Si 等［44］制備了一種超薄多孔硅殼包覆的金銀合金納米顆粒（AuAg@p-SiO2NP），并將其作為一種新型的炔基SERS納米探針，用于活細胞中外源和內源H2O2的比例型SERS成像（圖3D）。首先，將4-巰基苯乙炔（4-Mercaptophenylacetylene，MPAE）和4-巰基苯硼酸（4-Mercaptophenylboronic acid，MPBA）修飾的AuAg@p-SiO2NPs 與多巴胺（Dopamine，DA）一起孵育，通過DA 和MPBA 在納米顆粒表面形成硼酸酯鍵作為中間連接體。然后，將3-（4-（Phenylethynyl） benzylthio） propanoic acid（PEB，2 214 cm-1）的信號炔分子通過PEB 上的羧基與DA 上的氨基之間形成酰胺鍵，結合到納米粒子表面形成比例型SERS納米探針。在H2O2的存在下，苯硼酸酯轉換為苯酚，PEB 上的炔基從Au-Ag 合金納米顆粒表面釋放出來，顯著降低了2 214 cm-1處的拉曼信號。而MPAE 在1 986 cm-1處的拉曼信號保持不變，因此可以根據I1986/I2214的比值對H2O2濃度進行定量分析。多孔SiO2包覆的Au-Ag合金納米顆粒提供了一種具有良好生物相容性、高穩定性和有效抗干擾能力的新型SERS基底。

在腫瘤發生過程中，細胞膜相關的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和超氧化物歧化酶在細胞外空間產生H2O2，刺激細胞增殖并保持轉化狀態。因此，腫瘤細胞的一個特征是在細胞外環境中過量產生H2O2，隨后吸收到細胞質中。由于細胞外H2O2的最顯著梯度只能在與質膜接觸的流體非常近的區域觀察到，因此Hosogi 等［45］設計了一種能夠錨定在細胞外表面膜蛋白處的Au@4MPBE SERS 探針用于H2O2的監測。將細胞表面高度定位的SERS 信息與氧化還原生物學的分析方法相結合，進而評估細胞內負責信號傳導的H2O2的相關水平。這種新方法可能有助于研究實際H2O2濃度參與細胞增殖或死亡的機制。

腫瘤微環境含有的豐富H2O2與炎癥過程也密切相關。Li 等［46］開發了一種新型的AuNNRNAT@Au@MSi-AuNP-MBN/MPA 雙模態比例型核-衛星納米探針，將SERS 和光聲（Photoacoustic，PA）成像相結合，用于體內H2O2的實時定量檢測。在H2O2的存在下，將作為核-衛星之間連接分子的硼酸酯轉化為苯酚，導致AuNPs@MBN 釋放，拉曼信號大大降低，而在納米間隙內NAT 的拉曼信號保持不變。同時，在辣根過氧化物酶催化下封裝于介孔硅中的2，2’-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS）轉化為氧化態，在750 nm 處有很強的吸收，而AuNNRs 在1 250 nm 處的吸收幾乎不變，并且能夠應用于PA成像。該雙模態比例型納米探針不僅可以用于小鼠乳腺癌皮下腫瘤模型H2O2的檢測，還可以根據H2O2的變化實時檢測和跟蹤炎癥的治療過程。雙模態比例檢測可以在空間和時間范圍內獲得多尺度信息，從而實現可靠的疾病診斷。

2.3 過氧亞硝酸鹽

過氧亞硝酸鹽（ONOO-）是各種生理和病理過程中重要的氧化劑，通常由一氧化氮或超氧化物的極限擴散反應產生。因此，迫切需要發展高靈敏和選擇性的SERS 探針用于了解其相關的生理和病理機制。Liu 等［47］開發了一種高靈敏AuNFs/MAPE SERS 探針用于檢測活細胞中的ONOO-。該探針的原理是基于ONOO-可以將苯硼酸酯氧化生成苯酚，從而導致SERS 光譜發生變化。結果表明，在其他干擾離子存在下，AuNFs/MAPE SERS 探針對ONOO-表現出較高的選擇性和靈敏度。在氧化應激下，AuNFs/MAPE SERS探針可以快速、特異地檢測出活細胞中ONOO-的水平。

表2 總結了近年來報道的應用于H2O2檢測的SERS探針［17，39，41-46，48-56］。

表2 H2O2響應型SERS探針文獻總結Table 2 Application of SERS probes in detection of H2O2

3 針對腫瘤乏氧狀態的檢測

腫瘤乏氧的主要原因是供應腫瘤的微血管的結構和功能異常，O2在血管與腫瘤細胞之間的擴散距離增大，因而無法被有效運輸至特定部位［57］。乏氧不僅可以促進腫瘤生長、惡化和轉移，還會降低放療和化療的療效［58］。Qin 等［59］構建了一種由Ag/Au 合金納米顆粒和單壁碳納米管（SWCNT/Ag/AuNPs）組成的比例型SERS 納米探針，該探針具有強SERS 信號、低細胞毒性和優異的化學穩定性。在拉曼靜默區，SWCNT 在2 578 cm-1處呈現尖銳的散射峰，而拉曼報告分子在2 207 cm-1處呈現典型的散射峰。在乏氧條件下，拉曼報告分子被還原并從SERS基底上離開，導致2 207 cm-1處SERS強度降低，從而實現缺氧水平的檢測。在HepG2、HeLa 活細胞和大鼠肝組織中，通過I2578/I2207兩個峰強度的比值能實現比率法檢測乏氧水平，表明該SERS探針可作為乏氧研究和臨床應用的有力工具，有可能成為醫學研究和臨床診斷中體內外乏氧監測的有用方法。

4 針對高濃度谷胱甘肽的檢測

谷胱甘肽（GSH）能夠維持生物系統內的氧化還原平衡，是細胞中最豐富的內源性抗氧化劑。高濃度GSH 是多種腫瘤微環境的顯著特征，過量的GSH 可清除具有細胞毒性的ROS，因而顯著增強癌細胞對依賴ROS 進行治療的抵抗能力。Sa?nchez-Illana 等［60］采用AgNPs 直接檢測全血樣本中谷胱甘肽的SERS 光譜。然而，由于GSH 具有低分子極化和小拉曼散射截面的特性，使得直接應用SERS 檢測GSH具有挑戰性。因此開發用于間接檢測GSH的響應型SERS探針非常必要。

二硫鍵（S—S）可被GSH快速裂解，是構建GSH響應型載體的常見結構。在低濃度GSH的細胞外環境中，二硫鍵可以保持穩定，而在高度還原性的細胞內環境中，通過GSH 介導的硫醇-二硫化物交換反應，使二硫鍵被快速切斷。利用GSH 能將分子中二硫鍵斷裂的特性，研究者們設計了一系列分子用于監測GSH的濃度（圖4A）。Zhu等［61］開發了一種用于檢測細胞內GSH的SERS探針。GSH能夠將5，5’-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）（DTNB）內部的二硫鍵斷裂生成2-Nitro-5-thiobenzoic acid（TNB），然后利用無機鹽MgSO4誘導AgNPs聚集的簡便方法對DTNB和TNB的SERS信號進行區分，進而實現GSH 的高靈敏定量測定。Wei 等［62］設計了一種基于2-（Pyridyldithio） ethylamine（PDEA）修飾的AgNPs@Si SERS 探針用于檢測細胞內谷胱甘肽。GSH 會破壞PDEA 的二硫鍵，釋放PDEA 中的吡啶環，導致SERS 信號減弱。研究人員使用該方法評估細胞GSH水平，發現癌細胞中的GSH水平高于正常細胞。通過這種特殊的表面反應策略，可以快速、靈敏地測定GSH 的含量，該方法在生物醫學診斷中具有很大的潛力，同時能為依賴細胞內GSH 水平的生物醫學應用提供指導。Zong 等［63］開發了一種SERS 可追蹤和刺激響應的納米載藥系統，該系統由拉曼報告分子標記的Au@Ag 納米棒（Au@Ag NRs）作為內部SERS 活性核，介孔二氧化硅（Mesoporous silica，MS）作為外部含藥殼。為了使納米載體具有GSH的響應行為，利用可被GSH 切割的二硫鍵直接將藥物分子附著在MS 上。在高濃度GSH 環境下，二硫鍵斷裂，導致細胞內藥物釋放。通過SERS信號跟蹤納米載體的位置以及熒光跟蹤藥物的位置，可以監測藥物在活細胞內釋放的動態過程。

圖4 SERS探針應用于腫瘤微環境中GSH檢測示意圖Fig.4 Scheme of SERS probes for GSH detection

Hu 等［64］基于GSH 能夠溶解MnO2這一特性設計了一種新型的PMBA@Ag/Au@MnO2核-衛星結構SERS 納米探針。其中，MnO2既可作為Ag/Au NPs 的“熱點”載體增強SERS 信號，又可通過GSH 刺激發生降解來改變SERS 強度（圖4B）。此外，SERS納米探針不僅可測量正常細胞和癌細胞的GSH 水平，還可檢測L-2-氧代噻唑烷-4-羧酸鹽（L-2-Oxothiazolidine-4-carboxylate，OTZ）刺激正常細胞和癌細胞時GSH 水平的變化情況。同樣，Wang等［65］設計并制備了Au@MnO2核殼復合SERS 探針。在MnO2的作用下，TMB 分子被催化形成二聚體電荷轉移復合物（Charge-transfer complex，CTC）。加入GSH 后，MnO2發生溶解，使CTC 分子從表面釋放，其SERS 信號降低，進而間接、靈敏地檢測GSH（圖4C）。研究表明，Au@MnO2-SERS 探針可以快速、可靠地測定細胞中GSH 的含量，在快速診斷GSH 相關疾病方面具有很大的應用潛力。

Li 等［66］開發了一種Neocuproine-Cu（Nc-CuII）功能化Au-Ag“納米碗”（Au-Ag NBs/Nc-CuII）SERS 納米探針用于檢測GSH。其原理是基于經典的氧化還原反應，在GSH 存在下Nc-CuII還原為Nc-CuI，使SERS 光譜發生變化，從而應用于GSH的靈敏和選擇性檢測（圖4D）。Li等［67］通過界面多酚還原法在金屬-多酚膠體球上沉積銀納米粒子制備了Ag NPs/Gu-多酚膠體球（CuTA@Ag）。通過調整銀前驅體的濃度，可以很容易地調節沉積在外層上的銀納米粒子的大小和密度，引起納米酶活性和SERS 特性的差異。該SERS 探針能夠催化TMB，得到具有強SERS 信號的氧化型TMB（oxTMB），而GSH 的加入使oxTMB 減少，信號減弱。這種基于催化反應的SERS 探針能夠準確、可重復地檢測癌細胞中的GSH 含量，捕捉到癌癥標志物水平上升的跡象，有望應用于腫瘤微環境中GSH的高靈敏檢測。

5 針對過表達酶的檢測

酶在生物代謝過程中起著至關重要的作用，腫瘤疾病的病理學進展與酶的活性和表達水平密切相關。在腫瘤組織部位，蛋白酶和磷脂酶等酶的表達和活性均顯著高于正常組織，這對腫瘤的發生和發展有著重要的影響［68］。酶響應型SERS 探針的構建大多是基于可被蛋白酶或酯酶降解的短肽序列或酯鍵。

基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）在腫瘤中高度表達，與腫瘤生長、侵襲和轉移具有密切關系，因此對其檢測對于促進臨床診斷非常重要。Narayanan 等［69］開發了一種MMPSQ@GNR@LAH-DOX SERS 探針，可以靶向MMPs 過表達的癌細胞并結合GNR 的光熱效應和DOX 的細胞毒性進行光熱治療和化療。該探針在接近靶細胞時，酶的識別會引起底物肽鏈斷裂，使拉曼特征分子從GNR 表面分離，導致SERS 信號強度逐漸下降（圖5A）。隨后，LAH-DOX 偶聯物的腙鍵在酸性腫瘤微環境中發生斷裂，釋放DOX。另外，在激光照射下GNR 產生光熱聯合治療作用。同時，該SERS平臺也能夠研究細胞凋亡過程中的分子變化。雖然在癌癥等復雜的疾病中需要進一步的觀察驗證，但目前的研究表明，SERS診斷方法具有監測治療效果的潛力。

圖5 SERS探針應用于腫瘤微環境中酶表達水平的檢測Fig.5 Scheme of SERS probes for detection of overexpressed enzyme

Saranya等［70］制備了具有熒光和SERS之間“開-關”轉換的可編程納米顆粒。該納米系統的設計原理是在AuNPs表面通過（Phe-Lys-Cys，FKC）序列連接上雙響應拉曼活性熒光基團，而腫瘤細胞中過量表達的組織蛋白酶（Cathepsin B，CathB）可使FKC 序列被特異性降解，釋放熒光基團的同時抑制SERS信號強度，從而實現熒光和拉曼模態之間的開關。該納米系統利用3種探針在837、354、617 cm-1處的獨特指紋SERS 峰和450、520、580 nm 處的發射峰，可同時檢測多種生物標志物，具有較高的靈敏度和特異性。酶驅動熒光-SERS 編碼探針能夠通過多模態方法對疾病靶點進行靈敏和特異性分析，是一種有效的生物標志物檢測方案，為開發用于即時診斷和個性化治療應用的臨床篩選探針提供了新的途徑。

亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP）是一種重要的蛋白水解酶，與肝損傷、癌癥等多種疾病密切相關。Guo等［71］開發了一種結合LAP響應性和SERS活性的新型SERS探針（b-（s）-ANT-Leu）。該探針分子通過Ag—S鍵，將b-（s）-ANT-Leu結合在AgNPs表面，其L-亮氨酸酰胺基團可被LAP裂解，轉化為相應的水解反應產物3，3’-disulfanediyldianiline（DSDA），致使其SERS 光譜產生顯著差異。根據SERS信號的變化可實現LAP活性檢測。

Si 等［72］成功開發了一種基于炔-DNA 功能化合金Au/Ag NPs 的比例型SERS 納米傳感器，用于檢測活細胞中的核酸內切酶，具有高靈敏度和良好的信號再現性。將制備的3-［4-（Phenylethynyl）benzylthio］ propanoic acid（PEB）標記在巰基修飾的DNA 上（HS-DNA-PEB），形成巰基/炔雙功能化單鏈DNA 作為拉曼報告分子。通過在合金Au/AgNPs 表面組裝ssDNA 和內標分子4-Thiophenylacetylene（TPA），構建了炔-DNA/合金Au/AgNPs SERS 探針。該SERS 探針可以同時檢測PEB 和TPA 分子的拉曼信號。在存在核酸內切酶的情況下，與ssDNA 偶聯的PEB分子因核酸內切酶的催化導致DNA裂解從粒子表面釋放，導致其SERS 信號大幅降低，而TPA 的拉曼信號不受內切酶的影響，因此可以通過計算峰值強度比實現對核酸內切酶活性的定量檢測。炔作為拉曼報告分子能夠在拉曼靜默區產生無干擾的強拉曼信號，基于炔烴的比例型SERS傳感方法提高了復雜體系中核酸內切酶檢測的可靠性。

近年來，人們發現人羧酸酯酶1（Human carboxylesterase 1，hCE1）的水平異常可能與代謝性肝病和肝細胞癌的發生發展有直接關系。因此，監測hCE1 水平對于研究肝細胞損傷和肝細胞癌的進展非常重要。Yang等［73］開發了一種用于hCE1 檢測的“三明治”結構SERS 免疫磁性生物傳感器（圖5B）。該方法利用ZIF-67/Ag/R6G/antihCE1 作為SERS 探針、磁性CoFe2O4/Ag/anti-hCE1核-衛星納米結構作為SERS 增強基底用于檢測hCE1。存在hCE1 時，SERS 探針與磁性CoFe2O4/Ag/anti-hCE1 基底通過抗原-抗體免疫反應耦合，進一步增強SERS 光譜的強度。利用構建的SERS免疫磁性傳感器能夠快速測定HepG2細胞裂解液和培養上清液中的hCE1 濃度，并實時監測對乙酰氨基酚處理的HepG2 細胞釋放到培養液中的hCE1，進而了解hCE1 水平與肝細胞損傷之間的相關性。

最近，液體活檢因其簡單、無創的取樣方式而引起了廣泛的關注。Wang 等［74］制備了一種腎臟可清除的Glu-RR-AuNC SERS 探針用于通過尿液實時監測癌癥進展和治療響應。將含有炔基的內標分子和酶響應單元（SERS 特征峰分別為2 154 和2 230 cm-1）連接在金納米團簇（Gold nanoclusters，AuNCs）上構成β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase，GUSB）響應的SERS 探針。將納米探針經小鼠靜脈注射到體內后，Glu-RR-AuNCs 被動積累到腫瘤部位，其中酶響應單元被過表達的GUSB 特異性切割斷裂，生成只含有內標分子的AuNCs。在尿液中加入生長液使AuNCs 生長成納米星，進而放大表面保留的內標分子的SERS信號。這些信號位于生物拉曼靜默區，消除了可能的背景干擾。該文獻報道的這種自我校準、無背景、高靈敏度的尿液傳感系統對于無創檢測早期癌癥和定量監測癌癥的發展具有重要的臨床意義。

6 總結與展望

SERS是一種強大的定量檢測和成像分析工具，具有靈敏度高、特異性好、多重檢測、抗光漂白等顯著優點，因此，基于SERS的檢測方法備受活細胞和組織可視化及疾病診斷領域的關注。本文總結了目前常見的針對pH、氧化應激、乏氧、高濃度谷胱甘肽和過表達酶進行檢測的TME 響應型SERS 探針及其響應機理。這些探針具有高度的特異性和強信噪比，能夠清晰直觀地傳遞生物信息，為腫瘤相關疾病的納米診療技術提供有效策略。將診斷與治療相結合是設計雙模式或多模式腫瘤微環境響應型SERS 探針的主要研究方向。通過SERS 探針進行靈敏特異的分子識別，同時在激光輻射下產生光熱、光動力治療或通過TME 刺激激活化療等其他級聯治療方案，這類新型SERS 探針的設計制備已經成為癌癥特異性治療領域的熱門方向之一。

盡管基于腫瘤微環境設計的響應型SERS探針被相繼報道，但要真正應用于腫瘤的臨床研究和診斷治療仍存在許多挑戰，如材料的生物相容性、拉曼信號強度和生物自身信號干擾等。首先，研究人員需要設計和構建具有更好生物相容性的SERS基底，并充分評價材料對細胞、機體的短期長期影響及在體內的分布和代謝情況；其次，對于體內應用，合成具有更強拉曼信號的報告分子、具有更高信號增強能力的SERS 基底，建立具有更大穿透深度的成像方法，對提高探針的檢測靈敏度十分重要，同時，基于拉曼靜默區設計的SERS 探針能夠避免生物體內復雜環境對其產生額外的、不可預測的信號干擾，信噪比更高。此外，設計制備過程簡單、組分少、具有多重響應能力及多重診療功能的腫瘤微環境響應型SERS探針具有良好的發展前景。我們相信，在不久的將來，隨著人們對腫瘤發生發展過程中各種機制的闡明和SERS 技術的快速發展，具有更大優勢的新型診療一體化SERS 探針也將隨之被開發并應用于腫瘤的臨床診斷和治療。