基于能量轉移的光響應型生物探針在分子醫學方面的應用

黃文文，張 玉，李 琪，方興如，劉洪林

（合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230601）

現代醫學已從傳統醫學時代進入到精密分子醫學時代，需要從分子水平上，即通過對DNA、RNA、多肽、蛋白質及代謝產物等的識別、定量與定位等方式來揭示疾病的發生與發展［1-3］。開發各種生物分析方法精準測定疾病相關特定生物分子與相關微環境的變化，并在復雜的生物系統中監測這些動態過程，有助于解析這些生物分子與相關微環境變化在疾病發生、發展與治療中的作用。生物傳感與成像技術具有無創性、近實時反饋、高精度、高可靠性等特點，逐漸成為藥物發現、疾病診斷和治療預后的重要技術手段［4］。在各種生物傳感和成像探針中，光譜分析法［5］、熒光分析法［6］和光學成像法［7］等光學方法由于具有高特異性和高靈敏度等優點而被廣泛應用。目前已開發出許多能夠在細胞甚至單分子水平上監測生物事件發生發展的光學納米探針，可用于疾病的早期檢測、準確診斷和治療。基于光學納米探針的生物傳感和光學成像具有能夠連續監測關鍵的代謝物、成像靈敏度高（在μmol/L范圍內）、成本低等特點，能夠提供高分辨率圖像，無需使用放射性造影劑、無電離輻射，是一種方便、安全的可視化生物過程和疾病進展的先進實驗技術［4，8-11］。光學生物傳感和光學生物成像技術能輔助疾病的鑒定與治療。例如，檢測生物標志物變化（如pH值［12-13］），對細胞或代謝產物的種類與含量等進行定位［14-17］與定量分析［18-22］。其中，基于能量轉移的光學生物傳感和生物成像技術除了具備高特異性和高靈敏度的優點外，還具有靈活精確的距離控制［23］，可以實現更靈敏、更廣泛和更精準的傳感。上述優點使基于能量轉移的光學探針特別適合于研究活細胞體系中的分子事件動態變化，逐漸應用于腫瘤成像、藥物篩選和疾病標志物等醫學研究與應用。

各種能量轉移模式如生物發光共振能量轉移（BRET）、化學發光共振能量轉移（CRET）、F?rster 共振能量轉移（FRET）及等離子體參與的納米金屬表面能轉移（NSET）和等離子體共振能量轉移（PRET）等被廣泛應用。其中BRET 使用生物發光蛋白產生的生化能量激發熒光團，是一種基于遺傳編碼和鄰近距離的檢測工具，用于研究生物分子間的相互作用，但由于其需要利用遺傳編碼技術，對含有外源性報告基因的轉基因技術的安全性問題阻礙了該技術在人類研究中的應用［24-26］。CRET通過化學發光供體向相應受體進行非輻射能量轉移，由于其背景自發熒光可忽略而在生物傳感方面顯示出巨大潛力，但仍受到其復雜化學偶聯和短半衰期發光的限制［27］。FRET是最廣泛應用于生物分析、傳感和成像的分子標尺，其能量供體和能量受體均為熒光團，但能量轉移效率依賴于散射光譜和受體分子吸收光譜之間的重疊程度，且其發生距離在1~10 nm 范圍內［28-29］。NSET 效應中的能量供體和能量受體分別是熒光團和等離子體納米粒子，與FRET 效率高度依賴于能量供體-受體光譜重疊和作用距離范圍不同，NSET在光譜重疊方面沒有明確的要求，且突破了FRET 作用距離的壁壘，具有更大的距離分辨率，極大地擴展了NSET 的應用領域［30］。PRET 效應中等離子體納米粒子作為能量供體，熒光團作為能量受體，通過等離子體納米金屬的瑞利散射光譜進行信號反饋，避免了熒光團自猝滅和光漂白現象，具有更高的信噪比和穩定性，在單個納米顆粒水平的精確跟蹤和敏感檢測方面具有無與倫比的優勢［31］。本文總結了目前基于3種能量轉移方式（即FRET、NSET及PRET）的光學探針在分子醫學領域的一些應用范例。

1 基于FRET的光學探針及其生物傳感和成像應用

1948年，F?rster在理論上首次建立了FRET模型［28］。在FRET模型中，能量從供體熒光團轉移到受體熒光團，其發生距離在1~10 nm范圍內［28-29］。在FRET中，供體和受體均被認為是點偶極子，被激發的供體將非輻射激發能轉移給受體。這一過程由高能共振中供體發射和受體吸收的過渡偶極矩之間的偶極-偶極相互作用驅動。FRET 技術非常方便，可在單分子檢測極限下常規應用。目前，基于FRET過程，研究人員開發了相關納米尺模型，其是最廣泛應用于生物分析、傳感和成像的分子標尺。FRET納米尺熒光靈敏度高，成本相對低，具有在活細胞中進行實時生物化學測定和多路復用等優勢［32］。

1.1 基于FRET的生物傳感

基于FRET 能量轉移的光學生物傳感器已獲得廣泛應用，其因獨特的檢測性能在疾病診斷和治療中發揮著非常重要的作用，可從多種類型的臨床標本（體液、細胞、組織）中量化靶標（蛋白質、核酸、代謝物、藥物、毒素、人體細胞和其他病原體）［33-35］，用于多種類型的癌癥生物標志物監測［36］。快速和高靈敏度的DNA 檢測是診斷遺傳病的關鍵，基于FRET 的光學傳感器在基因診斷和分析以及癌癥風險預測等方面發揮了重要作用。如Wabuyele 等［37］利用單對熒光共振能量轉移（spFRET）檢測KRAS癌基因的點突變，能夠直接從未擴增的基因組DNA 中檢測低豐度點突變，處理時間僅為5 min，比傳統方法快近100 倍。作者基于連接酶的點突變檢測試驗，使用等位基因特異性鑒別靶標引物和普通引物，兩種引物各具有10個堿基對（bp）的互補臂，在其5'和3'端用熒光染料標記；各有一個能夠與點突變的目標DNA 模板鏈互補配對的臂序列，以供FRET 過程的發生發展。當這兩個引物與發生點突變的目標DNA模板鏈完美匹配時，熱穩定的DNA連接酶將兩個相鄰的引物以共價鍵形式連接，形成一個分子信標，此時熒光標簽距離變近，FRET 發生。相反，未連接的引物不發生FRET。因此，根據FRET 熒光信號的變化，可以鑒別DNA 鏈是否發生突變，從而推斷癌癥發生的可能性（圖1A）。除了能監測DNA是否發生突變之外，基于FRET 的光學生物傳感器還能對極低濃度靶標分子進行量化分析。如Zhang等［38］構建了一種基于FRET 技術的超靈敏納米傳感器，該傳感器能夠以無分離形式檢測低濃度靶標DNA，檢測限低至5 fmol/L。該系統使用量子點（QD）與DNA探針相連以捕獲DNA靶標鏈。DNA靶標鏈與染料標記的報告鏈結合，從而促使FRET 供體-受體間發生能量轉移過程。QD 還被用作集中器，通過將幾個DNA 靶標限制在納米級域中放大目標信號，即使與少量DNA靶標（約50個拷貝或更少）結合，它們也會產生非常明顯的FRET 信號，其中未結合的納米傳感器產生接近零的背景熒光（圖1B）。這種一個能量供體捕獲多個受體的能力不僅有助于提高整體的能量轉移效率、放大熒光信號達到高精度檢測低豐度靶標，還可以通過熒光信號強度對靶標進行定量研究。蛋白質也是疾病的生物標志物之一，對蛋白質構象變化進行監控有利于了解疾病的發生與發展。Lo等［39］開發了一種時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）生物傳感器，用于在高通量篩選（HTS）平臺上檢測神經退行性疾病相關的一種內在紊亂蛋白（IDPs），即微管結合蛋白Tau（Microtubule-associated protein Tau，Tau）低聚物和單體構象的微小變化。此外，HTS 平臺與細胞熒光生物標志物結合，可以應用于開發其它基于IDPs引起的神經退行性疾病的藥物（圖1C）。近來，Xiao 等［40］利用QD 為能量供體和水溶性AIEgen 染料（（E）-4-（4-（二苯基氨基）苯基）-1-（3-（三甲氨基）丙基）吡啶-1-溴化鋁，命名為TVP）為能量受體，設計了一種基于FRET 信號的細胞外囊泡（EV）膜蛋白檢測系統（EV－MPDS），該系統消除了EV 的提取和純化，從而快速簡便地診斷肺癌。具體來說，使用TVP 標記EV 膜，附加適體的量子點（AP-QDs）作為特異性蛋白標記探針標記癌細胞分泌的EV 膜上的目標蛋白，利用FRET 技術不分離地檢測癌細胞分泌的EV，當FRET 信號開啟，表明TVP 和AP-QDs 共同標記同一個EV 粒子膜上，證實此EV 與癌細胞分泌相關，這種雙標記系統可用于評估目標EV濃度。與傳統ELISA檢測方法相比，該系統在癌癥診斷方面顯示出更高的準確性（100%與65%）和靈敏度（100%與55%），且該系統能夠直接從細胞培養上清液或血液中分析EV，消除了復雜的EV提取過程，從而避免了樣品的異質性和潛在的誤差，具有幫助肺癌診斷和早期篩查的潛力（圖1D）。

圖1 用于分析KRAS癌基因低豐度點突變的單對熒光共振能量轉移（spFRET）檢測示意圖［37］（A）；基于FRET的單量子點DNA納米傳感器示意圖［38］（B）；用于篩選Tau低聚物和單體構象的微小變化的時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）生物傳感器檢測示意圖［39］（C）；基于FRET的EV-MPDS用于準確便捷診斷肺癌示意圖［40］（D）Fig.1 Schematic diagram of single-pair fluorescence resonance energy transfer（spFRET） detection for the analysis of low abundant point mutations in KRAS oncogenes［37］（A）；schematic diagram of FRET-based single-QD DNA nanosensor［38］（B）；schematic diagram of time-resolved fluorescence resonance energy transfer（TR-FRET） biosensor detection for screening Tau oligomers and small changes in monomer conformation［39］（C）；schematic illustration of EV-MPDS based on FRET for accurate and convenient diagnosis of lung cancer［40］（D）

1.2 基于FRET的生物成像

基于FRET技術的光學探針可在活細胞體系中可視化相關的分子事件，并且基于FRET的生物成像技術可以利用活細胞成像研究生物系統結構、細胞內微環境變化分析或進行疾病診斷等。如Wen 等［41］報道了一種基于萘酰亞胺－羅丹明的FRET 比例熒光探針用于細胞pH 的感應，該探針通過比例熒光強度精確地響應不同的pH 值，可以根據細胞中不同的熒光信號強度區分癌細胞和正常細胞（圖2A）。Lei等［42］開發了一種FRET-肽測定方法，用于分析甲狀腺乳頭狀癌（PTC）和甲狀腺結節（TN）患者的各種細胞系和臨床甲狀腺組織樣本中的多重基質金屬蛋白酶（MMPs）活性（圖2B）。Huang等［14］報道了一種基于FRET的雜交鏈式反應（HCR），用于在單個細胞和組織切片中高度敏感和選擇性地原位可視化腫瘤相關mRNA 的表達。該策略基于3個可編程DNA 發夾結構的使用，即H1、H2和H3 3種發夾結構。H1被設計為包含與靶標TK1 mRNA 互補的序列。在適當的位置分別用熒光受體羧基四甲基羅丹明（TAMRA）和供體羧基熒光素（FAM）標記H2 和H3。在靶標mRNA 存在的情況下，H1 被靶標通過互補配對作用打開，打開的H1 與H2 的粘性末端配對，H2 通過無偏差鏈位移置換反應打開發夾結構。新暴露的H2 與H3粘性末端配對，打開發夾結構，露出H3上的粘性末端，從而再次打開H2。靶標mRNA 的每個拷貝均可在H2和H3發夾結構之間產生雜交連鎖反應，形成有切口的雙鏈體。每對H2-H3雜交事件均會產生FRET 信號，形成級聯效應來放大熒光信號。然而，當沒有靶標mRNA 存在時，由于各發夾結構是閉合的，保持亞穩態，不發生FRET 過程（圖2C）。這種級聯效應放大熒光信號策略可以避免多次洗滌步驟，并在一定程度上避免由于探針積累或降解而產生的假陽性信號。半胱天冬酶可通過天冬氨酸特異性裂解多種細胞底物介導細胞凋亡和炎癥，與多種疾病密切相關［43］。近來，Procházková 等［44］合成了一種新型的基于FRET 的光穩定熒光探針，在熒光顯微鏡下對細胞中半胱天冬酶的酶活性進行長期敏感和選擇性的監測。此探針由1 個具有半胱天冬酶特異性可切割肽組成，在肽的兩側分別修飾有能量供體QD和黑洞猝滅劑-2（BHQ2），在沒有半胱天冬酶時，QD和猝滅劑BHQ2發生FRET，QD激發態能量轉移給BHQ2，QD 的熒光信號關閉；當存在半胱天冬酶時，連接QD 和BHQ2 的肽段被切割，QD 和BHQ2的距離超過FRET 作用距離，QD 的熒光信號恢復。根據細胞成像結果，可監測半胱天冬酶活性。這種發光探針比商業產品提供了更長的半胱天冬酶成像時間，在細胞內發光信號的穩定性超過14 天。此探針用QD和BHQ2作為FRET的能量供體-受體，避免了傳統熒光團的光漂白和自猝滅，使成像效果更穩定（圖2D）。

圖2 基于FRET的比例熒光探針通過監測細胞內pH區分癌細胞和正常細胞的工作原理［41］（A）；Au/Ag@SiO2底物的制備及FRET肽微陣列MEF檢測MMPs活性的原理［42］（B）；基于FRET的HCR法原位檢測TK1 mRNA的工作原理［14］（C）；基于FRET的光穩定熒光探針用于單個細胞內半胱天冬酶活性長時間成像的工作原理［44］（D）Fig.2 Working principle for distinguish cancer cells from normal cells by monitoring intracellular pH in living cells using the FRET-based proportional fluorescent probes［41］（A）；preparation of Au/Ag@SiO2 substrate and the principle of FRET-peptide microarray-based MEF detection for multiple profiling of MMPs activities［42］（B）；working principle for the in situ detection of TK1 mRNA using the FRET-based HCR method［14］（C）；working principle for a long-time imaging of active caspases inside individual cells［44］（D）

現有基于FRET 能量轉移構建的傳感器或診療技術，往往受限于FRET 檢測量程（＜10 nm）。并且，FRET 模型中涉及的熒光團不可避免地存在光漂白、自猝滅、可選擇性有限等弊端。但是，基于FRET能量轉移的光學生物傳感和生物成像技術在基礎研究和臨床診斷等方面仍具有一定的潛力和應用前景。

2 基于NSET的光學探針及其生物傳感與成像應用

2005年，Strouse課題組［30］首次報道了NSET模型。在NSET模型中，能量從供體熒光團轉移到受體納米金屬表面，其檢測量程打破了傳統FRET 的障礙，即＞10 nm。在NSET 中，供體熒光團被認為是點偶極子，而受體納米金屬表面被看作薄膜鏡面以容納更多的能量［30］。Strouse 課題組研究表明，對于直徑1.4 nm 的金納米顆粒（AuNPs），NSET 檢測量程可擴展到22 nm，這是傳統FRET 檢測極限的兩倍多。與FPRE 分子間的偶極-偶極相互作用機制不同，NSET 過程中存在等離子體納米粒子，其主要由偶極子-納米金屬表面非輻射能量轉移機制驅動，即從分子偶極子轉移到納米金屬表面的強相互作用。此外，NSET 的顯著優點不僅在于探測距離比FRET 更長，還在于NSET 猝滅效率更高，具有較優異的高信噪比和靈活的檢測距離，能夠實現更靈敏、更廣泛的傳感探測與分析［23］。

2.1 基于NSET的生物傳感

基于NSET過程構建的生物傳感器已被用于疾病相關生物標志物的檢測。如Griffin等［45］報道了超敏感的基于金納米顆粒的NSET 方法用于篩查丙型肝炎病毒RNA，獲得了優異的靈敏度（800 fmol/L）和選擇性（單堿基對錯配）（圖3A）。Yuan 等［46］利用4-磺酸苯基卟啉（TPPS4）為能量供體和金納米棒（AuNRs）為能量受體構建的NSET 平臺，高選擇性、高靈敏度地痕量檢測人尿液中惡性腫瘤標志物精胺含量，用于癌癥的早期診斷。當精胺不存在時，具有雙鏈結構的小牛胸腺DNA（ctDNA）對AuNRs 表現出更強的靜電相互作用，從而驅使TPPS4 遠離AuNRs 表面，使TPPS4 熒光恢復。當精胺存在時，在酸性條件下，精胺表現出多陽離子性質，通過靜電吸引和凹槽結合，對ctDNA 陰離子磷酸主鏈具有很強的親和性，形成縮聚聚集并從AuNRs 表面釋放，TPPS4 被吸附到AuNRs 表面，激發態能量從能量供體TPPS4轉移到能量受體AuNRs 上，導致TPPS4 的熒光發生猝滅，且猝滅效率與精胺的濃度成正比（圖3B）。Pramanik 等［47］利用羅丹明6G（Rh-6G）染料和金納米星分別作為能量供體和能量受體構建了基于NSET過程的傳感平臺，可用于檢測和滅活冠狀病毒SARS-CoV-2。在沒有抗原或病毒存在時，Rh-6G 染料偶聯刺突蛋白特異性適配體附著在金納米星上，此時，Rh-6G 的激發態能量轉移給金納米星，發生NSET，Rh-6G 的熒光信號關閉，當SARS-CoV-2抗原或病毒存在時，由于刺突蛋白特異性適配體與抗原或病毒上的刺突蛋白結合，金納米星與染料之間的距離增加，熒光信號持續存在。通過NSET 信號變化可以檢測抗原或病毒并根據信號強度進行定量研究，且此探針具有快速檢測刺突抗原和病毒的能力，可在不到10 min 的時間內獲得結果，具有高度敏感性，對SARS-CoV-2 刺突重組抗原的檢測限低至130 fg/mL，對病毒的檢測限為8顆粒/mL。且作者證明了附著有刺突蛋白特異性適配體的金納米星可以通過阻斷宿主血管緊張素轉換酶2受體和病毒的結合以及破壞病毒的脂質膜來阻止病毒感染（圖3C）。各種蛋白質之間的受體-配體相互作用對維持正常的生理代謝至關重要，發展原位觀察活細胞系統中受體-配體相互作用的策略有助于開發基于適體的診斷方法。基于NSET 過程開發光學納米尺也被用于測量活細胞膜表面受體蛋白水平上兩配體結合位點之間的分離距離。如譚蔚泓院士課題組［48］基于NSET過程開發了一種光學納米尺，用于測量活細胞膜表面轉鐵蛋白受體（CD71）上兩配體結合位點之間的分離距離。首先采用指數富集的配體系統進化（SELEX）策略獲得稱為XQ-2d 的ssDNA 適配體，此XQ-2d適配體能特異性結合在腺導管腺癌細胞（PL45）膜表面的CD71 上。使用XQ-2d 適配體修飾一系列不同直徑的金顆粒，使用熒光蛋白標記抗體，分別作為能量轉移受體和供體構建NSET 納米尺，來測量XQ-2d和抗CD71抗體在PL45細胞膜表面受體蛋白CD71上兩個不同結合位點之間的距離，基于“當金顆粒的半徑在2~8 nm 范圍內時，r0是常數”的前提，測得兩結合位點之間的距離約為15 nm（圖3D）。為分子醫學的研究提供了一種新的方向。同樣地，本課題組基于NSET 過程開發了一種具有單核堿基分辨率的納米尺，與譚蔚泓院士課題組設計的納米尺不同，本課題組利用熒光染料標記的適體和單一尺寸的金納米顆粒-抗體復合物分別作為能量轉移供體和受體，在活細胞膜上推斷CD71蛋白亞基水平上兩個結合配體之間的分子距離［49］。本課題組建立的能量供體-受體體系，降低了材料合成的復雜程度，使用單一尺寸金納米顆粒提高了制備穩定性和可重復性；相比于熒光蛋白標記抗體，小分子熒光團標記適體更簡便快速、成本低廉。另一方面，我們利用單一尺寸的金納米顆粒與熒光團作為能量轉移受體和供體構建的NSET納米尺，具有確定的r0值。此外，通過在XQ-2d適配體末端修飾帶有不同堿基對數目的熒光團，可以精細調控熒光團與金顆粒表面距離，控制分子間距；該納米尺具有較高的精度，從分子距離的角度，將適體的每個堿基在生物系統的特定平面上進行原位投影，對于建立靈敏、可靠、便捷的基于適體的診斷方法具有重要意義（圖3E）。

圖3 基于NSET過程的傳感器用于篩查丙型肝炎病毒RNA［45］（A）；基于NSET過程的傳感平臺痕量檢測人尿液中惡性腫瘤標志物精胺含量的示意圖［46］（B）；基于NSET過程的傳感平臺用于冠狀病毒超靈敏檢測與滅活的示意圖［47］（C）；基于NSET過程的光學納米尺用于測量活細胞膜表面CD71上兩個配體結合位點之間距離的示意圖［48］（D）；利用單核堿基分辨率的NSET納米尺原位測量活細胞膜上CD71蛋白亞基水平上兩個結合配體之間分子距離的示意圖［49］（E）Fig.3 Schematic diagram for screening hepatitis C virus RNA based on NSET process［45］（A）；schematic diagram for trace detection of spermine，a malignant tumor marker，in human urine based on NSET［46］（B）；schematic diagram for ultrasensitive detection and inactivation of Corona Virus of the sensing platform based on NSET［47］（C）；schematic diagram for measuring the separation distance between two ligand binding sites on CD71 on the surface of living cell membranes using the optical nanoruler based on NSET process［48］（D）；schematic illustration of in situ measurement of the molecular distance between two binding ligands at the CD71 protein subunit level on the living cell membrane using NSET nanoscale with single-nucleobase resolution［49］（E）

2.2 基于NSET的生物成像

基于NSET 能量轉移的光學探針除了能通過檢測生物標志物進行疾病診斷，還可通過生物成像技術進行腫瘤成像引導治療。如Li 等［50］開發了一種基于NSET 模型的納米探針，不僅能夠實時和原位監測癌細胞凋亡，而且能夠評估肽誘導的癌細胞凋亡程度和給藥治療效果，因此有望成為癌癥成像診斷和后期治療的靶向載體。在該傳感和成像系統中，作者首先合成功能肽包被的金納米團簇（AuNCs），隨后可通過NSET 過程使功能肽上修飾的熒光團處于熒光關閉狀態。此外，修飾在AuNCs 表面的肽保留了其固有的結構和生物學功能，在進入癌細胞后可被凋亡蛋白（caspase 3）水解并產生顯著的熒光信號。通過監測熒光信號的打開與關閉，分步實現了caspase 3 指示的細胞凋亡的實時成像和通過添加藥物前后熒光強度變化評估給藥治療效果的目標（圖4A）。Sun 等［51］提出了一種可原位激活并包含阿霉素（Dox）的“納米簇炸彈（AuNCs/Dzs-Dox）”，由內源性腫瘤細胞過表達的豆科蛋白引爆，利用NSET過程增強腫瘤成像和控制藥物釋放。利用功能肽作為生物配體，制備了具有靶向性、正電荷和豆科蛋白特異性以及TAMRA 環的AuNCs，此時TAMRA 作為能量供體將能量轉移給能量受體AuNCs，TAMRA 的熒光通過NSET 過程被形成的AuNCs 完全猝滅。同時AuNCs 可以保護脫氧核酶（DNAzyme）和Dox 組成的治療物質（Dzs-Dox），聚集成更大的AuNCs/Dzs-Dox納米顆粒，這些納米顆粒通過整合素介導的內吞作用選擇性地內化到癌細胞中，然后在溶酶體中豆科蛋白的幫助下局部水解。隨后監測到一種“炸彈樣”行為和“火花樣”熒光，這是由于TAMRA 和AuNCs 的NSET 過程減弱以及Dzs-Dox 的藥物釋放引起。結果表明，豆蔻素觸發的基于NSET 過程的AuNCs/Dzs-Dox 分解方式顯著提高了成像對比度。同時，體外細胞毒性實驗表明，基于AuNCs/Dzs-Dox 的引爆策略很容易實現有效的基因/化療聯合治療。此外，通過在體內治療異種移植的MDA-MB-231 腫瘤模型，進一步證明了聯合治療的超強效果（圖4B）。這種治療性納米簇炸彈設計利用內源性刺激反應性，建立起多管齊下的成像和給藥治療聯用策略，為高對比度成像和按需給藥的精確癌癥治療提供了一種新的策略。

圖4 基于NSET模型的納米探針用于caspase 3指示的細胞凋亡實時成像示意圖［50］（A）；基于NSET效應的納米簇炸彈系統（L-AuNCs/Dzs）合成示意圖以及用于對比度增強型癌癥成像和聯合治療的引爆策略［51］（B）；基于NSET過程的傳感器用于監測阿霉素在活細胞內釋放的示意圖［52］（C）；以CPT為基礎的聚合物前藥包覆AgNPs的NSET效應示意圖［53］（D）Fig.4 Schematic illustration of real-time imaging for caspase 3 directed apoptosis of based on NSET model nanoprobes［50］（A）；schematic illustration of nanocluster-bomb system（L-AuNCs/Dzs） synthesis and the detonation strategy for contrast enhanced cancer imaging and combination therapy based on NSET［51］（B）；schematic illustration for monitoring adriamycin release in living cells based on NSET process sensor［52］（C）；schematic illustration of NSET effect of AgNPs coated by the CPTbased polymeric prodrug［53］（D）

基于NSET 的生物成像技術不僅能用于腫瘤成像引導治療，還可以利用熒光強度變化進行生物成像來檢測細胞內藥物的釋放，評估治療效果。Wang 等［52］開發了一種藥物遞送系統，基于NSET 過程監測細胞內藥物釋放。通過酸不穩定的連接將Dox 與聚乙二醇間隔物拴在AuNPs 表面，此時，由于Dox與AuNPs 發生NSET，能量從能量供體Dox 轉移給能量受體AuNPs，使Dox 的熒光信號關閉；當此偶聯物進入細胞并在酸性細胞器中響應性地在細胞內釋放Dox 后，熒光信號打開。通過監測熒光信號，可以可視化Dox的細胞內響應釋放（圖4C）。Li等［53］通過將化療藥物喜樹堿（CPT）的光響應性聚合物前藥系在銀納米顆粒（AgNPs）表面上，開發了一種混合藥物遞送系統。當AgNPs被基于CPT的聚合物前藥包裹時，CPT 與AgNPs 之間的距離足夠近，基于NEST 過程，CPT 的能量轉移給AgNPs，使CPT 的熒光被AgNPs猝滅；當混合納米顆粒釋放CPT分子后，CPT的熒光恢復。因此，可以通過觀察細胞內CPT熒光強度的變化來追蹤細胞內藥物釋放過程和藥物分布（圖4D）。熒光強度的變化與藥物釋放行為息息相關，使得基于NSET的藥物傳遞系統可以追蹤細胞內藥物釋放過程，觀察釋放的藥物在細胞內的分布和治療效果。因此，基于NSET的生物傳感和生物成像在生物化學和分子醫學的發展中發揮著重要作用。

雖然基于NSET的光學探針和基于FRET的光學探針均在分子檢測和腫瘤治療等方面應用廣泛，但由于NSET打破FRET作用距離的壁壘，基于NSET的光學探針在醫學研究領域應用范圍更廣，比如在構建光學納米尺方面具有FRET和PRET不具備的絕對優勢，有助于開發全新的診斷方法。

現有基于NSET構建的傳感器或診療技術，雖然其檢測量程突破了FRET 量程的壁壘。但仍然存在一些弊端，例如，熒光團的光漂白、自猝滅，金屬納米材料的細胞毒性，關鍵參數r0的不準確。總而言之，基于NSET 能量轉移的光學生物探針和生物成像技術在現代分子醫學領域等方面具有重要應用價值。

3 基于PRET的光學探針及其生物傳感和成像應用

2007年，Liu等［54］在暗場顯微鏡下觀察到從單個AuNPs到吸附的細胞色素c引起的AuNPs散射光的猝滅，這是PRET過程的首次發現。在PRET模型中，能量轉移發生在等離子體納米顆粒和有機染料之間［55］。與FRET 過程類似，PRET 同樣是基于等離子體納米顆粒供體和受體分子之間通過偶極子-偶極子相互作用的非輻射能量轉移過程。當等離子體納米顆粒的局部表面等離子體共振帶的頻率與吸附在納米粒子上或距離納米粒子幾納米的分子的電子吸收帶頻率非常匹配時，就會產生瑞利散射信號的相應變化［56］。其能量轉移效率在很大程度上取決于等離子體納米顆粒的散射光譜和受體分子的吸收光譜之間的重疊程度［23］，這與NSET 有明顯差異。然而，等離子體納米材料比熒光分子具有更好的光穩定性和更大的光學橫截面［57］，使得PRET 模型具有更高的靈敏度、光譜分辨率以及優異的選擇性，并逐漸在光學生物成像方面備受關注。

3.1 基于PRET的生物傳感

近年來，基于PRET 的生物傳感和生物成像技術已被作為一種非破壞性和無標記的活細胞實時監測方法［58］，不僅可用于蛋白酶活性研究，還可以定量檢測生物分子以觀察細胞內的動態代謝活動。如基于簡單的靜電吸附，Yan等［59］利用海膽狀的金納米等離子體（UGPs）和氧化態的3，3'，5，5'-四甲基聯苯氨（oxTMB）建立了一種新的PRET 供受體對，用于酸性磷酸酶（ACP）的靈敏檢測。當ACP 不存在時，由于oxTMB 的電子共振峰與UGPs 的等離激元共振峰重疊，能量從oxTMB 轉移到UGPs 上，使UGPs 的散射強度減弱即發生PRET 過程。當ACP 存在時，ACP 催化2-磷酸-L-抗壞血酸三鈉鹽（AAP）分解產生的水解產物抗壞血酸水解物（AA）能有效地將oxTMB還原為TMB，從而阻斷PRET過程（圖5A）。

圖5 基于PRET納米傳感器用于酸性磷酸酶靈敏檢測的示意圖［59］（A）；基于PRET的等離子體納米探針GNPs@CD對活細胞中NO成像機制的示意圖［60］（B）；基于PRET的生物傳感器用于血漿中前列腺特異性抗原定量分析的原理圖［62］（C）Fig.5 Schematic illustration for sensitive detection of acid phosphatase based on PRET nanosensor［59］（A）；schematic illustration for the imaging mechanism of NO in living cells using the plasmonic nanoprobe GNPs@CD based on PRET［60］（B）；schematic diagram for the quantitative analysis of prostate-specific antigens in plasma using the PRET-based biosensor［62］（C）

3.2 基于PRET的生物成像

基于PRET 的生物成像技術在單個納米顆粒水平的精確跟蹤和敏感檢測方面提供了無與倫比的優勢。Wang等［60］提出了一種基于PRET過程的傳感策略，用于活細胞中一氧化氮（NO）的超靈敏成像。將具有獨特剛性結構和環形空腔的超分子環糊精（CD）分子連接在金納米顆粒（GNPs）上，并對其進行修飾，構建了PRET納米傳感器。在沒有NO分子時，羅丹明B衍生物（RdMs）通過疏水相互作用進一步插入到CD 分子的空腔中，形成主客體結構。在NO 分子存在的情況下，RdMs 與目標物反應并生成羅丹明（RdB）。由于GNPs和CD 分子偶聯物（GNPs@CD）和RdB 分子之間的光譜重疊，能量從RdB 分子轉移到GNPs@CD 上，PRET 發生導致GNPs@CD 的散射強度降低，此傳感平臺實現了活細胞中外源性和內源性NO分子的單粒子成像分析（圖5B）。同樣地，此課題組［61］利用基于PRET過程的主客體結構，實現對0.02 ~2.0 μmol/L線性范圍內的膽固醇進行檢測，并達到6.7 nmol/L的檢測限，可直接用于檢測血清樣品中的膽固醇，具有高靈敏度和特異性。這種基于PRET 的策略為檢測膽固醇和其他疾病相關生物標志物提供了一種有效的臨床潛在手段。Liu等［62］利用由AuNPs和QD作為供-受體對的PRET生物傳感器，前列腺特異性抗原（PSA）作為模型抗原評估基于PRET的均質免疫分析法的性能。結果表明，這種基于PRET 的生物傳感器可對血漿中的前列腺特異性抗原進行定量分析，建立了一種無分離的均質免疫測定方法，具有定量各種生物標志物的潛能（圖5C）。本課題組利用PRET 過程設計了一種無連接子單分子偶極的PRET 納米尺模型，在活細胞受體蛋白分子水平上檢測了位點間分離距離和蛋白質相互作用［63］。與傳統PRET 模型相比，本課題組的無連接模型以單一分子為受體，單一大小的GNPs 為供體，證明了以單分子偶極子為受體的無連接體PRET 模型的可行性，對于未來測量生命系統中的單分子事件具有重要意義。此外，與利用NSET模型檢測配體分離距離相比，本課題組構建的基于PRET 的納米尺避免了染料光漂白的特性，以及不同尺寸的GNPs和染料種類之間不確定r0值，具有觀察單分子事件的獨特優勢，可以作為納米尺度距離測量的替代工具。

然而，目前基于等離子體納米粒子的PRET 在大范圍光譜檢測方面受限，限制了對化學物質的連續跟蹤或對活細胞分泌分子的分析［64］。此外，由于單個等離子體納米粒子具有特定且狹窄的光譜寬度，因此只能檢測到吸收峰靠近納米粒子等離子體共振的分子，可能會破壞用于監測各種類型分子的多路PRET 方法。基于此，Kim 等［65］提出了一個基于PRET 的超表面驅動的多路復用納米光譜平臺。利用間隙等離激元和光柵效應，首次在整個可見光范圍內設計了具有工程散射光譜的像素化的超表面，有效地擴大了PRET 檢測的光譜范圍。3種不同的生物分子（即葉綠素a、葉綠素b和細胞色素c）被應用于超表面作為調色板，以獲得選擇性分子指紋成像。當元像素散射峰與特定共軛生物分子的吸收頻率相匹配時，超表面與生物分子之間會發生強PRET，導致散射譜發生高效率猝滅，通過在整個細胞區域進行連續監測來推進分子傳感。該平臺可以檢測分子之間的電子轉移和細胞中ROS 的產生（圖6）。這種超表面驅動的PRET高光譜成像，擴大了PRET檢測的光譜范圍，將為多路實時分子傳感和成像方法開辟了一條新的途徑，擴大了基于PRET的光學生物傳感和生物成像技術的應用范圍。基于PRET的光學探針是通過等離子體納米粒子的瑞利散射光譜變化進行信息反饋，對比基于NSET和FRET構建的光學探針通過熒光信號進行信息反饋，避免了熒光團的光漂白、自猝滅的影響，具有更高的精確度和穩定性。

圖6 多路PRET分子成像元表面的示意圖［65］Fig.6 Schematic illustration of the metasurfaces for multiplexed PRET molecular imaging［65］

基于PRET 的光學探針在生物傳感和分子檢測方面具有更優異的精確度，在單個納米顆粒水平的精確跟蹤和敏感檢測方面擁有比基于FRET、NSET 的光學探針望塵莫及的優勢，這些優點使其在疾病診斷方面具有極大潛力。但在腫瘤治療或藥物遞送應用等方面具有極大挑戰性，由于基于PRET 的光學探針是通過瑞利散射光譜變化進行信號輸出，光譜信號采集受到生物體組織深度的限制。

現有基于PRET 構建的傳感器或診療技術，具有更高的靈敏度、光譜分辨率以及良好的穩定性。但仍然存在一些弊端，例如，等離子體納米材料的細胞毒性，PRET 供-受體對的可選擇性有限等。總之，基于PRET 能量轉移的光學生物傳感和生物成像技術在現代分子醫學領域等方面仍具有重要應用價值，有望在基礎生物醫學研究、疾病診斷和治療等方面得到持續發展。

4 基于能量轉移的其它光學探針

除了上述列舉的基于FRET、NSET 和PRET 能量轉移的光學探針，還有基于金屬增強熒光（MEF），也稱為表面增強熒光（SEF），以及等離子體增強熒光（PEF）等能量轉移的光學探針，其中熒光團與金屬納米顆粒的近場相互作用可能在特定條件下產生較大的熒光增強。這種熒光信號的放大可以大大提高檢測靈敏度和增強對比度，從而提高基于熒光的傳感和成像技術的性能。MEF/SEF 和PEF 能量轉移在生物醫學領域的研究越來越廣泛，包括生物標志物的檢測，如DNA［66］、RNA［67］和蛋白質［68］監測等，免疫測定［69］和腫瘤成像［70］等。但其熒光增強效應受到供體-受體間分離距離的限制，精確的距離控制是誘發熒光增強效應的關鍵。誘發MEF/SEF過程發生發展的最佳距離在7~8 nm左右［71］，其它距離下，熒光增強效應會減弱或被其它效應掩蓋。此外，如要實現實質性的熒光增強效應，除了精確的距離控制，通常還需要金、銀和銅等金屬作為有效襯底［68］，這些因素大大限制了基于MEF/SEF 和PEF 能量轉移的光學生物傳感和生物成像技術在現代分子醫學早期診斷和治療等方面的應用。

5 總結與展望

基于各種能量轉移的光響應型生物傳感和光學成像技術已在疾病研究和臨床實踐中廣泛應用并不斷發展。但是，考慮到生物相容性、細胞毒性以及潛在遺傳毒性等因素，目前大多數對疾病診斷與治療方面的研究仍處于實驗室層面，需要克服這些問題使研究落實在真實臨床診斷和治療中。因此，基于能量轉移的光響應型生物傳感和光學成像技術在助力分子醫學的成像、示蹤和手術導航等方面任重道遠，仍需要繼續推進、提升和發展。由于能量轉移的光響應型生物探針的多優點性和多功能性，這項技術將繼續推進臨床診斷和治療的簡單性、敏感性、特異性和多路復用性。我們相信基于能量轉移的光響應型生物探針具有巨大潛力，將繼續為醫學研究和應用提供源源不斷的動力。