表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)在細(xì)菌生理活性因子和代謝產(chǎn)物分析領(lǐng)域的研究進(jìn)展

朱怡亭，李芷瑤，謝茂梅，顏月玲，張 桐，王海霞，2*

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617；2．現(xiàn)代中醫(yī)藥海河實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

細(xì)菌是地球上最早出現(xiàn)并廣泛存在的一類原核生物，通常以單細(xì)胞形式存在，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。然而，一些致病性細(xì)菌對(duì)人類的健康構(gòu)成極大威脅，可引發(fā)感染性疾病如肺炎、尿路感染和皮膚感染等。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的致病性與其生理活性或代謝產(chǎn)物密不可分。例如金黃色葡萄球菌在輔助基因調(diào)控下，生理活性發(fā)生改變后可形成生物膜，這種生物膜能阻礙抗生素的穿透作用，使得抗生素難以對(duì)細(xì)菌發(fā)揮治療效果并進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性，增加治療難度和并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)［1］。此外，細(xì)菌的代謝產(chǎn)物也可能對(duì)人體造成不良影響。例如，肺炎球菌的代謝產(chǎn)物溶血素可引發(fā)炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致肺部損傷［2］。因此，精確分析細(xì)菌的生理活性和代謝產(chǎn)物至關(guān)重要，對(duì)于理解它們?cè)卺t(yī)學(xué)、生態(tài)學(xué)和生物工程等領(lǐng)域的作用具有重要意義。這些研究不僅有助于深入了解細(xì)菌的致病機(jī)制和抗生素耐受性，還在環(huán)境監(jiān)測(cè)和藥物研發(fā)生產(chǎn)等方面具有廣泛應(yīng)用。對(duì)于該領(lǐng)域的深入研究，準(zhǔn)確而高效的分析方法是不可或缺的。

當(dāng)前，質(zhì)譜［3］、核磁共振［4］和熒光光譜［5］等技術(shù)已在細(xì)菌生理活性和代謝產(chǎn)物分析方面有所應(yīng)用。然而，上述方法通常需要大量樣本和復(fù)雜的樣品前處理步驟，很難做到在線分析，且檢測(cè)成本較高。近年來，SERS 技術(shù)在微生物學(xué)領(lǐng)域嶄露頭角，其高靈敏度、高分辨率和高檢測(cè)效率等特點(diǎn)使之具備了廣泛的應(yīng)用前景。SERS 技術(shù)可以精準(zhǔn)識(shí)別并分析細(xì)菌中的多種物質(zhì)組成，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和碳水化合物等。同時(shí)根據(jù)SERS 圖譜還可推斷分子的鍵合情況、官能團(tuán)的存在以及分子構(gòu)象等信息［6］，為進(jìn)一步解析細(xì)菌生理活性及代謝過程提供了依據(jù)。然而，獲得精確的拉曼光譜需要具備高活性和高熱點(diǎn)性能的表面增強(qiáng)基底材料。本文首先總結(jié)了金屬納米材料基底和復(fù)合納米材料基底，然后綜述了SERS技術(shù)在不同細(xì)菌生理活性因子分析方面的研究，包括溫度、pH值、培養(yǎng)基類型對(duì)細(xì)菌生理活性的影響。此外，還探討了SERS技術(shù)在酚類化合物、揮發(fā)性有機(jī)物、色素類代謝產(chǎn)物以及其他代謝產(chǎn)物分析中的研究應(yīng)用（如圖1所示）。本文首次對(duì)SERS技術(shù)在細(xì)菌生理活性因子及代謝產(chǎn)物方面的分析工作進(jìn)行綜述，顯示出SERS技術(shù)在復(fù)雜生理環(huán)境下對(duì)細(xì)菌監(jiān)測(cè)及檢測(cè)的突出優(yōu)勢(shì)，以期為細(xì)菌性疾病的預(yù)測(cè)、診斷和治療提供指導(dǎo)。

圖1 SERS技術(shù)對(duì)細(xì)菌生理活性因子及代謝產(chǎn)物的分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of SERS analysis of bacterial physiological active factors and metabolites

1 SERS技術(shù)概述、增強(qiáng)機(jī)制及增強(qiáng)基底材料

拉曼散射是指入射光與物質(zhì)分子發(fā)生能量交換，改變光子頻率形成拉曼頻移，能夠提供物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、振動(dòng)和化學(xué)成分信息的一種光譜類型［7］。目前公認(rèn)的兩種表面增強(qiáng)機(jī)理為電磁增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)。盡管這兩種機(jī)制目前尚未完全解析，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)電磁增強(qiáng)與金屬納米結(jié)構(gòu)形狀、大小、排列、光波長(zhǎng)密切相關(guān)［8］，而化學(xué)增強(qiáng)與目標(biāo)分子幾何形狀、電子結(jié)構(gòu)、分子與基底相互作用相關(guān)［9］。因此，近年來研究者們從上述幾個(gè)方面對(duì)增強(qiáng)基底材料進(jìn)行了深入研究，旨在提高拉曼增強(qiáng)效果。目前，常見的增強(qiáng)基底材料有金屬納米和復(fù)合納米基底材料等。這些基底材料在進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)分析時(shí)，能夠與細(xì)菌通過靜電吸附、物理吸附和表面相互作用等方式緊密結(jié)合，從而顯著增強(qiáng)細(xì)菌的散射信號(hào)，極大提高了細(xì)菌檢測(cè)的靈敏度和可靠性。根據(jù)基底材料的組成，可將基底分為金屬納米基底和復(fù)合納米基底兩大類。

1.1 金屬納米基底

金屬納米常被用作拉曼增強(qiáng)基底材料，這是由于金屬納米顆粒與激發(fā)光相互作用時(shí)，可引發(fā)表面等離子激元共振效應(yīng)（LSPR）。該效應(yīng)可導(dǎo)致電場(chǎng)在金屬表面聚集，從而增強(qiáng)相鄰分子的電磁場(chǎng)，進(jìn)而提高待測(cè)分子的拉曼散射強(qiáng)度［8］。其中金納米顆粒（Au NPs）和銀納米顆粒（Ag NPs）是細(xì)菌SERS檢測(cè)過程被廣泛使用的基底材料［10］。它們?cè)谔囟ǔ叽绾托螤顥l件下，引發(fā)的LSPR效應(yīng)可引起電子振蕩并產(chǎn)生具有高增強(qiáng)效果的局部電場(chǎng)（俗稱“熱點(diǎn)”），進(jìn)一步促使附近的分子振動(dòng)、旋轉(zhuǎn)和電荷重新分布產(chǎn)生增強(qiáng)的拉曼散射信號(hào)［11］。除了LSPR 效應(yīng)外，Au NPs 和Ag NPs 的電荷分布可以促進(jìn)納米顆粒與細(xì)菌之間的電荷轉(zhuǎn)移和相互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)菌的SERS信號(hào)。

為進(jìn)一步優(yōu)化拉曼增強(qiáng)效果，研究人員通過調(diào)整納米基底材料的形狀和構(gòu)型，獲得了比表面積更大、表面更為均一的基底材料，如金納米星（GNS）［12］、金納米棒［13］、金尖端［14］等，不僅顯著提高了局部電場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)SERS信號(hào)［15］，同時(shí)也有效提高了增強(qiáng)基底的重現(xiàn)性，為獲得穩(wěn)定的拉曼信號(hào)提供了保障。Chen 等［16］通過在細(xì)菌表面原位合成球形銀納米顆粒，獲得多條表面等離子體共振帶，大大增強(qiáng)了細(xì)菌的拉曼信號(hào)強(qiáng)度，已成功用于飲用水中常見致病菌的鑒別，并且可用于臨床樣本中不同亞型細(xì)菌的區(qū)分。此外，納米銀陣列［17］及納米金低聚物［18］的引入可為檢測(cè)基底提供豐富的多孔結(jié)構(gòu)，為細(xì)菌的黏附提供更多位點(diǎn)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌與納米材料的緊密結(jié)合，進(jìn)而顯著提高細(xì)菌的拉曼檢測(cè)信號(hào)。

1.2 復(fù)合納米基底

為進(jìn)一步提高基底材料的拉曼活性響應(yīng)，研究人員通過嘗試組合應(yīng)用多種基底材料，使獲得的復(fù)合基底材料具有更優(yōu)異的拉曼增強(qiáng)活性。將Au NPs和Ag NPs相結(jié)合，可以制備多種不同構(gòu)型的基底如Au@Ag NPs［19］和Au@Ag NS［20］等。它們既具有LSPR 效應(yīng)，又有多重散射效應(yīng)，兩種效應(yīng)相互疊加可增強(qiáng)散射信號(hào)的強(qiáng)度，并有效提高了金屬顆粒的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了在SERS分析檢測(cè)中的使用壽命。

除了Au NPs 和Ag NPs 材料間的復(fù)合，研究人員還將這兩種金屬材料與硅材料進(jìn)行復(fù)合，制備Au@Ag@mSiO2［21］、SiO2-Au 超晶體［22］、Au**Ag*SiNWs［23］和Au-CNP［24］等復(fù)合材料。硅材料具有豐富的介孔或微孔結(jié)構(gòu)，可使金屬離子聚集從而增強(qiáng)金屬離子的濃度，引發(fā)LSPR效應(yīng)，同時(shí)，硅的多孔結(jié)構(gòu)和金屬納米結(jié)構(gòu)的層疊組合可以增加不同界面間的電場(chǎng)效應(yīng)和散射效應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)SERS 信號(hào)［25］。此外，硅基底的多孔結(jié)構(gòu)還具有良好的細(xì)菌吸附能力，能夠促使細(xì)菌與基底緊密結(jié)合。相關(guān)研究通過物理吸附、化學(xué)吸附以及沉積等手段將金屬納米粒子固定于纖維素基材、蛋白薄膜和聚合物薄膜柔性材料上，制備得到Zein/Au-Au NPs［26］、Ag NPs-tape［27］、3D paper-Au［28］等復(fù)合基底材料，不僅可有效增加基底的柔韌性和可塑性，使其能夠適應(yīng)不同形狀和結(jié)構(gòu)的表面，同時(shí)也提高了金屬粒子的聚集性，進(jìn)一步增強(qiáng)SERS 響應(yīng)［29］。Huang 等［30］將原位制備的黑磷-Au 納米片吸附在天然濾紙片上，經(jīng)過多次浸泡-漂洗-干燥循環(huán)制備了一種新型柔性SERS 基板—BP-Au 濾紙基底，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法成功用于金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌和大腸桿菌的鑒別分析。

上述兩類基底的研制為獲取細(xì)菌的拉曼增強(qiáng)信號(hào)提供了便利。近年來，研究人員廣泛利用這兩類基底，對(duì)不同應(yīng)力下細(xì)菌的生理活性及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，有助于深入理解細(xì)菌的生物學(xué)功能，為人類認(rèn)識(shí)細(xì)菌提供了一種有利工具。

2 SERS技術(shù)對(duì)細(xì)菌生理活性因子的分析

細(xì)菌生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，其生理活性受多種因素的調(diào)節(jié)與影響，如溫度、pH值、培養(yǎng)基種類等。這些影響因素會(huì)引起細(xì)菌生理活性的變化，從而影響其行為和功能。通過觀察不同生理活性因子誘導(dǎo)下的細(xì)菌SERS光譜峰位和強(qiáng)度變化，可推斷出細(xì)菌生理活性的細(xì)微變化，有助于揭示細(xì)菌生存策略，并為抗菌治療、疾病控制和環(huán)境保護(hù)等提供理論指導(dǎo)。

2.1 溫 度

細(xì)菌通常具有最適生長(zhǎng)溫度或溫度范圍，超出或低于該溫度或范圍會(huì)對(duì)其生理活性產(chǎn)生不利影響［31］。當(dāng)外界溫度明顯高于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，細(xì)菌被殺死；如果在低于細(xì)菌的最低生長(zhǎng)溫度時(shí)，細(xì)菌代謝活動(dòng)會(huì)受到抑制。通過研究不同溫度下細(xì)菌的生理活性，可以更深入了解細(xì)菌對(duì)溫度的適應(yīng)能力和對(duì)生物代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。這有助于揭示細(xì)菌在不同溫度條件下的適應(yīng)策略，包括調(diào)節(jié)酶的活性和表達(dá)機(jī)制，以及適應(yīng)環(huán)境溫度變化所產(chǎn)生的遺傳機(jī)制等。Wang等［32］通過在刀豆蛋白A修飾的細(xì)菌纖維素納米晶（BCNC）上沉積Au NPs 制備了一種復(fù)合基底，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同溫度下生長(zhǎng)的丁香假單胞菌生理活性的分析。刀豆蛋白A 具有較高的親和力，能夠牢固地吸附在細(xì)菌表面成分上，從而使細(xì)菌有效地固定在基底上。同時(shí)，基底中的Au NPs因聚集而形成“熱點(diǎn)”效應(yīng)，使細(xì)菌的SERS信號(hào)顯著增強(qiáng)。研究結(jié)果表明，室溫條件（25 ℃）下培養(yǎng)的丁香假單胞菌在面臨營(yíng)養(yǎng)限制和滲透壓變化時(shí)，其SERS 光譜發(fā)生了明顯變化，表現(xiàn)為與蛋白質(zhì)和碳水化合物相關(guān)的拉曼峰值強(qiáng)度增加，而與DNA相關(guān)的拉曼峰值強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。此時(shí)，丁香假單胞菌還會(huì)分泌細(xì)胞外生物分子，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并導(dǎo)致上清液細(xì)胞外生物分子的SERS 信號(hào)增加。而在低溫條件（4 ℃）下培養(yǎng)的丁香假單胞菌的拉曼光譜幾乎保持不變，此時(shí)丁香假單胞菌代謝減緩、生長(zhǎng)速度減慢，膜流動(dòng)性降低，無法產(chǎn)生大量細(xì)胞外生物分子，并且不觸發(fā)細(xì)胞死亡和SERS 信號(hào)增加。因此，利用SERS 技術(shù)可對(duì)不同溫度下細(xì)菌的生理活性進(jìn)行深入分析。

2.2 pH值

pH 值可直接影響細(xì)菌的生理活性和生長(zhǎng)繁殖能力，極低或極高的pH 值均可能導(dǎo)致其生理功能受損甚至死亡［33］。了解細(xì)菌對(duì)不同pH條件的響應(yīng)，有助于揭示其適應(yīng)機(jī)制和生存策略，幫助人們更好地理解細(xì)菌的生態(tài)特性和調(diào)控細(xì)菌生長(zhǎng)活性。范美坤團(tuán)隊(duì)［34］以Ag NPs 作為基底，對(duì)不同pH 條件下細(xì)菌的生理活性進(jìn)行了研究。Ag NPs 引發(fā)的LSPR 效應(yīng)可產(chǎn)生強(qiáng)烈的局部電場(chǎng)，這一局部電場(chǎng)可以促進(jìn)細(xì)菌表面分子的吸附，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)菌的SERS 信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，痢疾鏈球菌和糞腸桿菌在660 cm-1處的拉曼峰值強(qiáng)度隨著pH值的增加而增強(qiáng)，而大腸桿菌在該處的峰值強(qiáng)度下降。這可能是由于痢疾鏈球菌和糞腸桿菌對(duì)堿性環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，堿性環(huán)境有利于其生長(zhǎng)。而大腸桿菌是一種嗜中性的細(xì)菌，堿性環(huán)境對(duì)其生長(zhǎng)不利，因此在較高pH 值下，其在660 cm-1處的峰值強(qiáng)度較低。此外，還發(fā)現(xiàn)與革蘭氏陽性（G+）菌相比，革蘭氏陰性（G-）菌更易受到pH 值影響，這可能是由于G-細(xì)菌的細(xì)胞壁組成簡(jiǎn)單，更容易受到外部應(yīng)激的影響所致。

2.3 培養(yǎng)基種類

不同種類培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生理活性可產(chǎn)生顯著不同的影響，培養(yǎng)基的成分和條件可調(diào)節(jié)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度和代謝途徑等。魏林波［35］以Ag NPs 為基底，研究了在溶菌肉湯（LB）、LB 瓊脂和酵母浸出粉胨葡萄糖（YPDA）培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的4 種細(xì)菌的SERS 光譜變化。結(jié)果顯示，在YPDA 和LB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的志賀氏痢疾桿菌1 型在1 097、1 139、1 582 cm-1處顯示出拉曼特征峰，而這些峰在LB 瓊脂培養(yǎng)基中則不存在。上述峰通常與糖類和核酸成分相關(guān)，表明該菌在LB 瓊脂培養(yǎng)基中的代謝速度相對(duì)較慢。此外，相比于YPDA 培養(yǎng)基，在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的該菌還檢測(cè)到1 405 cm-1處的特征峰，可能與細(xì)菌生長(zhǎng)過程中釋放的顯色化合物有關(guān)。對(duì)于志賀氏痢疾桿菌2型，其在YPDA和LB瓊脂培養(yǎng)基中的SERS光譜非常相似，而在LB 培養(yǎng)基中則表現(xiàn)為660、798、868、898、1 139、1 416、1 695 cm-1處的特征峰強(qiáng)度增加，其中868、898、1 416 cm-1處的特征峰可能與細(xì)菌生長(zhǎng)釋放的顯色化合物有關(guān)。對(duì)于大腸桿菌，LB和LB瓊脂培養(yǎng)基中的SERS光譜出峰位置相似，而在 YPDA培養(yǎng)基中，在1 048、1 097 cm-1處新增的拉曼峰可能與C—C 或C—O—C 有關(guān)。此外，1 405、1 452 cm-1處的特征峰也有不同程度的增強(qiáng)，其中1 452 cm-1處的特征峰與蛋白質(zhì)相關(guān)。而糞腸球菌在不同培養(yǎng)基下的SERS 光譜差異顯著，包括特征峰數(shù)量、位置以及峰的相對(duì)強(qiáng)度。與其他兩種培養(yǎng)基相比，LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的糞腸球菌在660、960、1 126、1 452、1 582、1 695 cm-1處的特征峰強(qiáng)度明顯增加，同時(shí)798、872 cm-1處的特征峰強(qiáng)度也有所增加。上述SERS光譜的特征變化反映了培養(yǎng)基種類對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響，表明不同培養(yǎng)基可以引發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，為研究細(xì)菌在不同環(huán)境下的生長(zhǎng)和代謝提供了有利信息。

3 SERS技術(shù)對(duì)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的分析

細(xì)菌代謝產(chǎn)物是細(xì)菌在其生長(zhǎng)和代謝過程中產(chǎn)生的化合物，反映了細(xì)菌與環(huán)境的生長(zhǎng)、發(fā)育和相互作用［36-38］。細(xì)菌代謝產(chǎn)物種類繁多，包括酚類化合物、揮發(fā)性有機(jī)物、色素類以及其他類別的產(chǎn)物，其中一些細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)特定的細(xì)菌種類具有高度指示作用，可作為鑒定和檢測(cè)細(xì)菌的標(biāo)志物，從而提高疾病的診斷水平［39］。然而，許多細(xì)菌代謝產(chǎn)物具有低分子量和濃度較低的特點(diǎn)，需要采用靈敏度較高的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。近年來，SERS技術(shù)在細(xì)菌代謝物的高靈敏度檢測(cè)方面已獲得突出應(yīng)用，下文對(duì)SERS 技術(shù)在細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行介紹。表1 總結(jié)了SERS 技術(shù)在多種細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢測(cè)方面的應(yīng)用。

表1 SERS技術(shù)在細(xì)菌代謝產(chǎn)物分析中的應(yīng)用Table 1 Applications of SERS technology in bacterial metabolite analysis

3.1 酚類化合物

酚類化合物是一類廣泛存在于自然界的有機(jī)物，細(xì)菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生多種酚類代謝物，如兒茶酚、酚酸、羥基苯乙酸和香豆素等。它們具有多種生物活性，包括抗真菌、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用，這對(duì)于細(xì)菌在其自身的生存環(huán)境中起到一定的調(diào)節(jié)作用［40］。此外，上述物質(zhì)具有廣泛的應(yīng)用前景，涵蓋醫(yī)藥、食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域，具備顯著的醫(yī)療和商業(yè)價(jià)值。大腸桿菌可通過酪氨酸解氨酶將酪氨酸轉(zhuǎn)化為具有獨(dú)特香氣和風(fēng)味的香豆素，由于香豆素具有多種作用，引起了人們的關(guān)注。Morelli 等［24］使用微流控支持提取液膜技術(shù)將大腸桿菌生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物香豆素（pHCA）進(jìn)行分離富集，并將金蓋納米柱作為增強(qiáng)基底，通過SERS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。金蓋納米柱由硅納米柱和金膜構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生LSPR效應(yīng)，從而增強(qiáng)局域電磁場(chǎng)。同時(shí)，金蓋納米柱具有較大的表面積，能夠有效吸附待測(cè)物質(zhì)pHCA，進(jìn)而增強(qiáng)其SERS 信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pHCA 的檢測(cè)限和定量限分別為5 μmol/L和15 μmol/L，并可以通過pHCA 的產(chǎn)量變化來區(qū)分培養(yǎng)條件的影響。隨后，研究人員改進(jìn)了分離富集方法，利用液液萃取技術(shù)（LLE）將大腸桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物pHCA 和肉桂酸（CA）從復(fù)雜基質(zhì)中分離富集并進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在1 634 cm-1和1 002 cm-1處觀察到CA 的拉曼特征峰，而在1 603 cm-1和1 169 cm-1處觀察到pHCA 的拉曼特征峰。研究表明通過結(jié)合LLE 技術(shù)和SERS傳感技術(shù)，可成功實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌代謝產(chǎn)物pHCA和CA的同時(shí)檢測(cè)和鑒別［41］。

3.2 揮發(fā)性有機(jī)物

細(xì)菌可通過其特定的代謝途徑產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs），而不同的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生不同種類的VOCs。例如，丁香假單胞菌通過硫氧化代謝產(chǎn)生二甲基二硫醚，金黃色葡萄球菌通過糖酵解代謝產(chǎn)生丁酸、2-甲基丁酸、異丁酸等化合物，大腸桿菌通過糖酵解代謝產(chǎn)生二氧化碳，通過發(fā)酵代謝產(chǎn)生氫氣等［42］。這些VOCs 通常在食品腐敗的過程中產(chǎn)生，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的食源性疾病，如胃腸炎和敗血癥。通過監(jiān)測(cè)和評(píng)估VOCs，可以及早發(fā)現(xiàn)食品腐敗，并采取相應(yīng)的措施防止食源性疾病的發(fā)生，提供及時(shí)的醫(yī)療干預(yù)。因此，方便、可靠的VOCs評(píng)估在醫(yī)療保健領(lǐng)域具有重要意義。

Dejong 等［14］首次成功地利用SERS 技術(shù)直接檢測(cè)細(xì)菌釋放的VOCs，并通過其特征峰對(duì)不同細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。他們將襯底放置于帶有水溶液的頂空或標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿中，將VOCs 被動(dòng)地吸附到納米結(jié)構(gòu)襯底的金尖端上，并使用便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行測(cè)量。采用乙醇對(duì)納米結(jié)構(gòu)襯底的金尖端進(jìn)行處理，導(dǎo)致納米結(jié)構(gòu)向內(nèi)坍塌。這一坍塌過程在金尖端之間形成納米間隙，產(chǎn)生了高電場(chǎng)，從而增強(qiáng)了拉曼信號(hào)。研究結(jié)果表明，在大腸桿菌的光譜中觀察到與其釋放的VOCs 相關(guān)的特定SERS 峰，包括645、760、1 120、1 400、1 485 cm-1峰，而伊氏梭狀芽孢桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌的SERS光譜中未觀察到這些峰。上述3種細(xì)菌在770、1 600、1 240 cm-1處的SERS峰值存在差異，可以通過這些峰位和峰值的變化將它們區(qū)分開。

Wang 等［27］將Ag NPs 沉積在膠帶上，制備了低成本的多層復(fù)合基底（SERS tape），Ag NPs 的聚集產(chǎn)生了大量的SERS“熱點(diǎn)”，增強(qiáng)因子高達(dá)3×107，能夠顯著增強(qiáng)分析物的SERS信號(hào)。將SERS膠帶倒置在培養(yǎng)皿的蓋內(nèi)，被動(dòng)捕獲丁香假單胞菌生長(zhǎng)代謝過程中形成的二甲基二硫醚，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在680 cm-1處出現(xiàn)高強(qiáng)度的拉曼特征峰，并且該峰的強(qiáng)度隨著時(shí)間的變化而變化，具有時(shí)間依賴性，可提供關(guān)于代謝物產(chǎn)生的實(shí)時(shí)信息，并用于定義代謝活動(dòng)，從而監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)。

另外，有研究將GNS 材料加載在帶真空過濾的平面過濾器支架上，通過金納米基底材料的密集積累，形成大量“熱點(diǎn)”，增強(qiáng)了SERS 信號(hào)，并對(duì)細(xì)菌釋放的氣體代謝物表現(xiàn)出敏感響應(yīng)，從而構(gòu)建了一個(gè)能夠快速實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)代謝物的“SERS 鼻子”［43］。其具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可以利用SERS 信號(hào)對(duì)氣體目標(biāo)進(jìn)行定量分析。研究人員利用“SERS鼻子”對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生的氣態(tài)代謝物進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其SERS光譜呈現(xiàn)出與甲基硫化物、烷烴、酮、醛和芳香族化合物相關(guān)的峰值，與質(zhì)譜測(cè)量結(jié)果一致。此外，不同細(xì)菌的VOCs 在相同峰值處的峰強(qiáng)度存在差異，表明“SERS鼻子”能夠區(qū)分不同細(xì)菌產(chǎn)生的氣態(tài)代謝物。研究團(tuán)隊(duì)還驗(yàn)證了在豬肉上接種上述3 種細(xì)菌并檢測(cè)其產(chǎn)生的氣態(tài)代謝物的實(shí)際應(yīng)用可行性，并使用活性炭吸附變質(zhì)豬肉的氣態(tài)代謝物進(jìn)行了傅里葉紅外光譜（FTIR）檢測(cè)。與FTIR 檢測(cè)方法相比，SERS 方法提供了更多關(guān)于氣態(tài)代謝物的光譜信息，從而提高了對(duì)氣態(tài)代謝物的分析性能。因此，這種“SERS鼻子”方法可用于食品變質(zhì)的早期篩查，并可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品變質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

3.3 色素類代謝產(chǎn)物

細(xì)菌在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生豐富多樣的色素類代謝產(chǎn)物，主要包括類膽紅素色素、類胡蘿卜素色素、橙黃素、膿青素（PYO）等［44］。其中PYO 是常見致病菌銅綠假單胞菌通過酪氨酸代謝途徑產(chǎn)生的一種特有的有毒色素［45］。PYO 可造成多種感染，且與其群體感應(yīng)密切相關(guān)。監(jiān)測(cè)PYO 的產(chǎn)生不僅可以特異性識(shí)別銅綠假單胞菌，還可以追蹤其群體效應(yīng)（QS）行為，為進(jìn)一步闡明該菌株的致病機(jī)理和制定防控措施提供重要依據(jù)。基于此，鞠熀先團(tuán)隊(duì)［46］設(shè)計(jì)了一種多功能的SERS便利貼用于檢測(cè)PYO，并可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)追蹤細(xì)菌產(chǎn)生的QS 信號(hào)。該便利貼采用多尺寸GNS 密集包裹在兩個(gè)hBN 片之間，并在上層hBN 表面包覆4-巰基苯甲酸（MBA）作為內(nèi)標(biāo)，當(dāng)?shù)撞縣BN 片與待分析物接觸時(shí)，該便利貼就具有SERS 定量的自校準(zhǔn)能力。由于生物相容性和超薄的hBN 包裹，AuNSs 可在不直接接觸的情況下位于銅綠假單胞菌生物膜附近，對(duì)銅綠假單胞菌生成的PYO 產(chǎn)生快速、高質(zhì)量的SERS 響應(yīng)，從而可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期實(shí)時(shí)追蹤QS 的能力。研究結(jié)果顯示，該便利貼對(duì)PYO 的檢測(cè)限為0.58 nmol/L，表明其對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的PYO 具有高度敏感性。此外，該團(tuán)隊(duì)還利用該便利貼實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物膜中膿青素分泌的實(shí)時(shí)成像以及對(duì)細(xì)菌間QS信號(hào)的實(shí)時(shí)追蹤。

為減少環(huán)境污染和降低檢測(cè)成本，研究人員開發(fā)了多種新型基底用于檢測(cè)PYO。如Jia等［26］將倒金字塔形狀的金涂層納米結(jié)構(gòu)印在玉米蛋白膜上，形成了可降解的玉米蛋白金膜，并將Au NPs沉積固定在其表面，成功制備了一種環(huán)保的SERS 平臺(tái)（Zein/Au-Au NPs）。該平臺(tái)中Au NPs 與金膜通過接觸產(chǎn)生了大量的“熱點(diǎn)”，使SERS增強(qiáng)因子提高至2.8×104。利用該平臺(tái)，能夠靈敏、快速地檢測(cè)飲用水和囊性纖維化患者痰中的PYO，檢測(cè)限為25 μmol/L。另外，Zukovskaja 等［23］制備了一種簡(jiǎn)單、高效且成本低的SERS 檢測(cè)平臺(tái)（Au**Ag*SiNWs），并用于人工痰復(fù)雜基質(zhì)中PYO 的檢測(cè)。該SERS 平臺(tái)通過在垂直排列的硅納米線（SiNWs）的底部沉積Ag NPs，并在其頂部沉積雙金屬Ag/Au NPs，使金屬顆粒大量聚集形成“熱點(diǎn)”，產(chǎn)生較強(qiáng)的增強(qiáng)因子，從而增強(qiáng)平臺(tái)上PYO 分子的SERS信號(hào)。利用這一SERS平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人工痰中PYO 的高靈敏度和高重現(xiàn)性的檢測(cè)，檢測(cè)限為6.25 μmol/L。此外，Atta等［12］調(diào)整了不含表面活性劑GNS 的形態(tài)，成功制備了一種低成本、快速和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的SERS 平臺(tái)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)PYO的高靈敏度檢測(cè)。通過將GNS的形態(tài)調(diào)整為鋒利的尖端可以獲得強(qiáng)烈的局部電磁場(chǎng)，從而最大程度地增強(qiáng)了SERS信號(hào)。該研究使用MBA作為SERS探針，在沒有任何預(yù)純化的情況下可檢測(cè)飲用水、人類唾液和尿液樣本中的PYO，飲用水的檢測(cè)限為0.05 nmol/L，人類唾液和尿液的檢測(cè)限均為0.4 nmol/L。此外，將SERS技術(shù)與其他技術(shù)（如伏安法、微流控平臺(tái)、微針等）結(jié)合后也可用于PYO的檢測(cè)［18，47-49］。

3.4 其 他

除了以上介紹的幾類典型代謝產(chǎn)物，SERS檢測(cè)技術(shù)還可用于其他細(xì)菌代謝產(chǎn)物的分析檢測(cè)中。吲哚是由色氨酸通過胰蛋白酶（tnaA）在許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌中合成的，具體而言，色氨酸水解可產(chǎn)生吲哚、丙酮酸和氨［50］。在微生物學(xué)中，吲哚通常作為特征代謝物間接鑒定大腸桿菌或評(píng)價(jià)大腸桿菌活性。此外，吲哚作為胞外信號(hào)分子通過細(xì)胞外環(huán)境中濃度的變化作為一種信號(hào)傳遞機(jī)制，調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激、腸道炎癥和激素分泌等生理活動(dòng)［51］。基于此，De Marchi等［52］通過對(duì)比在Au@瓊脂上生長(zhǎng)的大腸桿菌MG1655和缺乏色氨酸酶大腸桿菌產(chǎn)生的代謝物的SERS光譜，成功地識(shí)別了與吲哚相關(guān)的SERS 信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌代謝物的SERS 圖譜在607、760、895、1 063、1 506 cm-1處展現(xiàn)出特征峰，與標(biāo)準(zhǔn)吲哚溶液的特征峰一致，而大腸桿菌tnaA突變菌株代謝物的SERS圖譜并未出現(xiàn)上述特征峰。同時(shí)，他們利用Kovacs 分析法測(cè)量了吲哚的產(chǎn)量，每個(gè)菌落的吲哚平均產(chǎn)量約為18 μm。

另外，Jayan 等［19］以Au@Ag 核殼納米顆粒為底物，利用SERS 技術(shù)對(duì)野生型大腸桿菌O157：H7 產(chǎn)生的吲哚進(jìn)行了檢測(cè)。相比于單獨(dú)的Au NPs 和Ag NPs，Au@Ag 核殼納米顆粒在激發(fā)狀態(tài)下具有更高的 SERS 增強(qiáng)能力，這是由于兩者結(jié)合后，Ag NPs 的表面電子態(tài)與Au NPs 之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，在局域電磁場(chǎng)和界面電荷分布之間產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)了SERS效應(yīng)。研究結(jié)果表明，該方法能在標(biāo)準(zhǔn)溶液中檢測(cè)到0.088 6 mmol/L 的吲哚。在10 mmol/L 外源性色氨酸的存在下，大腸桿菌產(chǎn)生的吲哚濃度比正常水平高20 倍，與未添加外源性色氨酸的培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)目下降了3 個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能是由于高濃度吲哚抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)所致。

在最近的一項(xiàng)研究［53］中，研究人員利用鹵化物修飾Ag NPs 結(jié)合液體獨(dú)立膜制備了一種新基底（即Br-Ag NPs-3D-FSM），能夠?qū)Υ竽c桿菌在調(diào)控孢子形成過程中產(chǎn)生的種間信號(hào)分子吲哚進(jìn)行檢測(cè)。在該研究中，鹵化物誘導(dǎo)Ag NPs 聚集形成更多的SERS“熱點(diǎn)”，吲哚與鹵化物離子之間的靜電相互作用促進(jìn)了吲哚在“熱點(diǎn)”周圍的分布，從而使其SERS 信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)。通過觀察吲哚的SERS 光譜，發(fā)現(xiàn)在1 063 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度隨吲哚濃度的增加而增強(qiáng)，即使在吲哚濃度為1 μmol/L的情況下，仍能夠檢測(cè)到1 063 cm-1處的特征峰。因此，研究人員選擇使用1 063 cm-1處的峰強(qiáng)度對(duì)吲哚進(jìn)行定量分析，檢測(cè)限為0.3 μmol/L。

4 總結(jié)與展望

本文主要總結(jié)了SERS技術(shù)在不同細(xì)菌生理活性因子和細(xì)菌代謝產(chǎn)物分析方面的應(yīng)用。作為一種快速、靈敏、選擇性好的檢測(cè)技術(shù)，SERS 具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力和優(yōu)勢(shì)，為深入研究細(xì)菌提供了有利工具。我們認(rèn)為，未來這項(xiàng)技術(shù)可在以下三方面持續(xù)發(fā)力，為細(xì)菌的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用分析提供更準(zhǔn)確、高效的信息。首先，應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化SERS基底材料及修飾方法，以提高靈敏度和選擇性，從而實(shí)現(xiàn)更低濃度的細(xì)菌分析，以用于病原菌的早期診斷以及細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性研究［55-58］。其次，可將SERS 技術(shù)與成像或質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)而獲得更全面的細(xì)菌生理活性因子和代謝產(chǎn)物分析結(jié)果，以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的多模態(tài)、全方位分析，提高對(duì)細(xì)菌生理代謝活動(dòng)的認(rèn)知水平［59-61］。此外，SERS技術(shù)在應(yīng)用于臨床診斷、食品安全監(jiān)測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等實(shí)際領(lǐng)域時(shí)，需要開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化程度更高，使用更為便捷的檢測(cè)器件［62-63］，以實(shí)現(xiàn)對(duì)致病微生物、有害化學(xué)物質(zhì)快速、準(zhǔn)確、高靈敏的分析檢測(cè)。

然而，SERS 技術(shù)在細(xì)菌分析中也面臨挑戰(zhàn)。首先，細(xì)菌樣品的制備和預(yù)處理對(duì)于SERS 分析結(jié)果至關(guān)重要。當(dāng)前的制備方法可能相對(duì)復(fù)雜且耗時(shí)，因此需要進(jìn)一步簡(jiǎn)化和標(biāo)準(zhǔn)化制備步驟以提高操作的可重復(fù)性和效率。其次，在分析細(xì)菌代謝產(chǎn)物和應(yīng)激響應(yīng)時(shí)，對(duì)于SERS數(shù)據(jù)的解析和識(shí)別是一個(gè)關(guān)鍵步驟。我們需要開發(fā)更精確的數(shù)據(jù)解析算法，并建立更多的數(shù)據(jù)庫和參考譜庫，以提高對(duì)細(xì)菌代謝產(chǎn)物分析的準(zhǔn)確性和鑒定的可靠性。總體而言，SERS技術(shù)在細(xì)菌分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但需要不斷突破當(dāng)前面臨的各種挑戰(zhàn)和壁壘，并不斷推動(dòng)SERS 技術(shù)與其他技術(shù)的融合發(fā)展，相信SERS 技術(shù)在細(xì)菌研究與分析檢測(cè)中將會(huì)發(fā)揮更為重要的作用。