環境敏感型碳點響應機制及其在生物傳感領域的應用

霍澤鵬，徐蔚青，徐抒平，2，3*

（1．吉林大學 化學學院，超分子結構與材料國家重點實驗室，吉林 長春 130012；2．吉林大學 化學學院，超分子化學生物學研究中心，吉林 長春 130012；3．吉林大學 化學學院 理論化學研究所，吉林 長春 130012）

碳點是一種新穎的熒光納米材料，憑借良好的生物相容性、光穩定性和水分散性常被用于檢測、生物成像等領域［1］。碳點主要分為石墨烯量子點、碳量子點、碳納米點和碳化聚合物點四種類型，其發光機制則可分為碳核態、表面態、分子態和交聯增強發射等［2］。碳核態熒光機制強調碳點的熒光是由于其所具有的共軛結構所產生，其熒光強度受到共軛大小的制約［3］。表面態發光機制主要強調連接在碳核或者碳點表面的短鏈結構以及含有氮、氧等元素的官能團與碳核的協同作用［4］。分子態發光理論不同于表面態，是指在自下而上合成碳點反應的初期階段，前驅體通過分子內或者分子間脫水，形成低碳化程度的產物，即分子殘基［5］，這些分子殘基或有機分子發光團會發射熒光。交聯增強發射指在碳點形成過程中，這些潛在的熒光中心通過聚合物化學交聯、錨定作用以及超分子網絡放大其熒光特性，而其所形成的結構也通過限制這些官能團的振動和轉動抑制其非輻射躍遷過程，提高熒光發射的效率，進而增強熒光［6］。

環境敏感碳點可對所處介質的微環境（如溶劑極性、溶劑粘度、pH 等）產生響應，并導致自身發射、吸收光譜的改變，從而可以實現對周圍環境的傳感和測量。目前具有此類性質的發光碳材料的發光機制仍不清晰。本文對環境敏感型碳點的發光機制及相關應用進行了綜述，具體可分為pH敏感型碳點、極性敏感型碳點、粘度敏感型碳點和溫度敏感型碳點四個類型。簡述了環境敏感型碳點的合成原料、傳感性能，并綜述了其在生物分析檢測領域中的應用。

1 pH敏感型碳點

1.1 pH敏感碳點的響應機制

pH 值是非常重要的生理指標，在多種生物過程中起著重要作用。pH 可誘導碳點的發光發生改變，主要有以下解釋：①能級改變；②表面的含氧、氮官能團發生質子化和脫質子化；③分子內電子轉移的調制；④聚集形態轉變。在機制的探索過程中，人們通過多種表征手段探究了不同酸堿條件下碳點表面官能團的變化，并通過諸如瞬態吸收等光譜手段詳細闡述了其發光機制。

針對pH 敏感碳點設計，許多pH 敏感型碳點在選擇前驅體時會使用一些含有氨基、羧基的有機小分子，這是由于表面的含氮、氧官能團會發生質子化和脫質子化從而影響能級結構，進而影響其熒光行為。因此，在設計pH敏感型碳點時，通常會考慮選擇含有上述官能團的碳點。

碳點官能團的差異可使碳點對pH 有響應。Wang 等［7］采用水熱合成方法通過1，2，4-三氨基苯和NaOH 制備了一種pH 敏感碳點，以630 nm 和590 nm 處的熒光發射峰位強度比和pH 數值進行擬合，發現碳點隨著溶液pH值的增加，熒光強度逐漸上升，但在接近中性之后熒光強度略有下降并伴隨峰位藍移，這暗示部分結構發生了質子化和脫質子化，改變了激發能級。他們通過Zeta電位數據得出在pH變化的過程中—OH 和—COOH 基團變為—O—和—COO—，從而導致熒光行為變化（圖1A~E）。Karami等［8］通過傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法詳細探究了不同pH下的碳點，發現偶氮基團（1 545 cm-1）在中性pH 時強度最高，在酸性pH 時強度最低。他們通過滴定方法對合成碳點的pKa 進行測定，證明了不同酸堿環境下的發射峰位差異來源于表面基團的質子化和去質子化（圖1F）。Sui等［9］通過飛秒瞬態吸收光譜描述了不同pH下碳點的載流子動力學，發現在堿性環境中碳點的衰減速率較快，而在酸性環境中卻較慢。通過全局擬合的方式對碳點激發態弛豫過程進行探究，發現在不同酸堿性環境中碳點經歷了不同的中間態，且不同酸堿環境下每種組分所占的比例具有很大差異。通過結合碳點的結構對實驗結果進行分析，作者認為碳骨架周圍的碳原子和含氧官能團導致了pH的變化，羧基的質子化和脫質子化影響了整個發光過程（圖1G）。

圖1 CDs的準備步驟（A），吸收光譜（B）及發射強度（C）隨pH值的變化［7］；不同pH值下CDs溶液在可見光和紫外線燈照射下的照片［7］（D）；在可見光和紫外線燈照射下，不同pH值下CDs的pH試紙的照片［7］（E）；CDs在pH值為3.0、7.0和9.0時的ATR-FTIR光譜［8］（F）；CDs在不同pH值溶液中被400 nm激光脈沖激發后在600 nm處的歸一化瞬態衰減動力學［9］（G）；Cu2+鈍化CDs在不同pH值下的紫外-可見吸收譜［11］（H）；在室內照明下，制備的（上）和Cu2+鈍化的（下）CDs在不同pH值下的照片［11］（I）；用405 nm激光激發Cu2+鈍化的CDs的熒光pH依賴性行為［11］（J）；CDs在pH 4.0和pH 11.0的水溶液中的TEM圖像［13］（K）Fig.1 Schematic illustration of the preparation procedure for the CDs［7］（A） . The absorbance intensity ratio changes（B） and emission intensity ratio changes（C） varied with pH values［7］.Photographs of the CDs solutions at different pH values under visible light and UV lamp irradiation［7］（D） . Photographs of pH test paper loaded with CDs at different pH values under visible light and UV lamp irradiation［7］（E）. ATR–FTIR spectra of CDs at pH 3.0，7.0，9.0［8］（F） . Normalized transient decay dynamics of CDs at 600 nm at different pH solutions after being excited by 400 nm laser pulse［9］（G）. UV–Vis absorption of Cu2+ passivated CDs under different pH values［11］（H） . Photographs of as-prepared（up） and Cu2+ passivated（down） CDs aqueous colloid with the same low concentration at different pH under indoor lighting［11］（I）.The pH dependent behavior for the PL of CDs with Cu2+ passivation excited by 405 nm laser［11］（J）.TEM images of CDs in aqueous solution at pH 4.0 and pH 11.0［13］（K）

pH誘導碳點產生的質子化和脫質子化除了改變碳點的能級結構外，還會引起碳點官能團與發射位點之間的電子轉移，從而引起熒光發射的變化。Lü 等［10］發展了一種pH 敏感碳點，隨著pH 值的減小，熒光強度逐漸減弱。他們將碳點的這種傳感機制歸因于碳點表面的氨基質子化增強了—NH3+和碳點之間的分子內電子轉移能力，從而導致熒光猝滅。

除上述官能團的差異會造成碳點對pH 響應之外，H+/OH-所引起的能級變化也被認為是碳點對pH響應的原因之一。Kong 等［11］報道了具有不同表面修飾的pH 敏感性碳點。隨著pH 值的改變該碳點熒光發射峰位可產生顯著變化，發射顏色從藍色變為綠色。這變化是由于OH—鈍化碳點表面缺陷，形成了一種保護殼層，進而使得碳點被周圍溶液所隔離，而輻射躍遷受到抑制，從而導致熒光強度和發射峰的改變。當溶液環境變為酸性時，H+可破壞OH-所形成的保護殼層，增加碳點尺寸，進而導致熒光猝滅和發射峰紅移（圖1H~J）。

碳點產生pH 敏感特性的另一個原因是pH 導致的碳點聚集和解聚集。通常在酸性環境中碳點會通過聚集形成較大顆粒，從而猝滅其熒光，這種敏感機制可通過TEM 觀測不同環境下碳點的粒徑得以判斷。Chen 等［12］通過對苯二胺和氨水合成了一種碳點，通過觀察不同pH 下的顏色變化，發現當pH 值從9.0變為1.0時，碳點的顏色從橙色變為棕色，表明碳點可能產生了聚集。他們認為，這種傳感機制是由于胺基在強酸條件下的質子化導致了碳點發生聚集，進而使得熒光被猝滅。在另一項研究中，Sun等［13］同樣通過對苯二胺制備了pH 敏感碳點，并發現其熒光強度隨pH 值從10.62 到6.2 逐漸降低，但隨pH 從6.2到4.0卻急劇降低。為了驗證傳感機制，作者使用Zeta電位和TEM 對不同酸堿環境中的碳點進行測量。結果表明，隨著pH 值的增加，電位由正變負。相應地，TEM 圖像顯示隨著pH 值的降低出現了碳點的聚集體。綜合上述結果，表明碳點表面羧基的去質子化削弱了包括氫鍵在內的非共價分子相互作用，誘導碳點聚集體的出現，從而導致強烈的熒光猝滅效應（圖1K）。

1.2 pH敏感碳點的應用

pH 值的調節和穩態對活細胞的生存至關重要。除了生理環境下pH 值的監測，許多反應體系和反應過程也依賴于體系中pH的波動。pH敏感碳點因其優異的響應性能常被用于溶液環境內pH傳感、細胞內pH 成像檢測、納米藥物遞送等方面的研究。Yang 等［14］通過微波輔助水熱法從1，2，4-三氨基苯和尿素中制備了橙色發射的碳點，該碳點在pH 5.0~9.0 時呈現比色和熒光的雙重pH 敏感性。將其與棉布復合制作新型傷口繃帶可實現信號傷口愈合過程中pH的動態可視化監測（圖2A、B）。

圖2 O-CDs/MCC在實際應用中的示意圖［14］（A）；不同pH值下緩沖溶液處理的O-CDs/MCC在自然光和紫外光（在365和254 nm激發）下的熒光圖像［14］（B）；CDs的制備和溶酶體pH監測的示意圖［15］（C）；用于可追蹤、靶向遞送抗癌藥物的多功能GQD的結構示意圖及其與癌癥細胞的相互作用［16］（D）Fig.2 Schematic and conceptual view of the O-CDs/MCC in practical application［14］（A）. Photographs showing color appearance under natural light and fluorescence images under UV ligh（texcited at 365 and 254 nm） of the O-CDs/MCC treated by buffer solution at different pH value［14］（B）. Schematic representation of CD preparation and lysosomal pH monitoring［15］（C）.Schematic illustration of the geometry of multifunctional GQDs for the traceable，targeted delivery of anticancer drugs and their interactions with cancer cells［16］（D）

細胞內溶酶體的酸性微環境是很多靶向載體藥物釋放的設計依據。Zhang 等［15］基于官能團保護策略，通過加熱對苯醌和乙二胺合成了一種pH敏感碳點。在該碳點合成過程中，氨基的良好親水性及其對pH 敏感的性質均得以保留，在生理環境下表現出對pH 的靈敏響應且具備良好的光穩定性。該碳點可主動靶向溶酶體，能實時成像檢測地塞米松誘導的細胞凋亡過程中溶酶體的pH變化。將其與藥物分子復合后作為納米藥物載體，通過控制pH可實現對于藥物的可控釋放（圖2C）。Qiu等［16］通過將碳點與阿霉素（Dox，一種抗癌藥物）復合，發展了一種同時具有載體跟蹤和藥物釋放能力的納米診療載體。該載體當細胞內小泡酸化時，Dox 被觸發釋放，載體則在癌癥細胞攝取后在小泡酸化處被利用，從而實現了靶細胞內pH觸發的藥物遞送（圖2D）。

2 極性敏感型碳點

2.1 極性敏感碳點的響應機制

極性是化學反應中重要的參數，溶劑的極性會影響化學反應的走向。極性并不是單一發揮作用，它包含一系列復雜的效應如氫鍵、偶極性等。此外，作為一種重要的物理參數，極性也與多種生理過程密切相關，如膜融合、蛋白質變性、酶構象變化等，這種異常的行為會導致如阿爾茨海默病等多種疾病的發生。已有的極性敏感探針大部分為有機小分子熒光探針，包含電子供體和電子受體結構，兩者為共軛結構所連接，形成D-π-A 結構。此類結構容易發生分子內電荷轉移（ICT），導致正負電荷分離，易出現較大的偶極矩。基態和激發態的偶極矩會隨著溶劑極性的變化而變化，最終導致吸收和發射光譜隨之改變。此外，極性敏感探針的設計原理還包含分子內電荷轉移、激發態分子內質子轉移（ESIPT）和扭曲分子內電荷轉移（TICT）等機制。對于碳點來講，無論是合成還是最后的分散，都依賴于溶劑。因而溶劑的特性也必將引起碳點性質的改變。碳點的極性敏感特性與碳點本身結構、其特殊的發光機制以及碳點和周圍溶劑分子的作用等因素相關，但目前關于碳點具體的極性敏感和溶致變色特性的發光機制未形成統一認識。

針對極性敏感碳點的設計，通常選擇含有氨基并且能夠引入其他官能團的有機小分子作為反應前驅體，所形成的產物通常包含電子供體和電子受體，易形成D-π-A 結構和發生ICT 效應，從而導致正負電荷分離，并出現較大的偶極矩，而基態和激發態的偶極矩會隨著溶劑極性的變化而變化，最終導致吸收和發射光譜隨之改變。

不同極性的溶劑會影響碳點的激發態能級結構，產生溶劑極性依賴的發射特性。Khan等［17］利用時間分辨發射光譜揭示了碳點的激發依賴特性。經典的卡莎規則認為分子在躍遷至高能級激發態后會弛豫至最低的能級，進而返回基態，從而產生與激發無關的發射。但Khan等認為碳點的這種激發依賴特性是由于碳點和溶劑之間的相互作用所導致，這從原理上違背了卡莎規則。首先，在碳點吸收光子后會發生兩個過程，即振動弛緩和溶劑弛緩；其次才是熒光發射，其中的溶劑弛緩過程由溶劑性質所決定。這種快速的溶劑化會導致分子在熒光衰減前完全弛豫，隨后產生不同能量的發射，進而產生激發依賴性，具體機制如圖3A所示。Arshad等［18］發現隨著溶劑極性的增加，碳點的熒光發射峰發生明顯移動。通過對碳點的發光機制進行探究發現，邊緣帶和附著在邊緣上的表面基團對熒光發射峰移動有所貢獻，但氫鍵對激發態無穩定作用，而主要來源于電子躍遷。進而得出結論，碳點的溶致變色現象的產生主要由溶劑的偶極/極化效應引起，這種作用可以更好地穩定激發態，而對基態幾乎無影響，從而使發射發生紅移。

圖3 CDs的各種熒光現象的動力學方面的示意圖［17］（A）；所制備的CDs的能態和電子躍遷過程的示意圖［19］（B）；分子態和溶劑之間相互作用導致的氫鍵誘導的CDs發射機制示意圖［19］（C）；CDs在H2O和CCl4中的G帶位置（D）和D/G峰積分強度比的變化（E）［21］；CDs的內部形態圖，展示了含氯溶劑分子和發光中心之間的相互作用［21］（F）；密度泛函理論（DFT）在不同模型CDs上的計算結果［22］（G）；CDs中有助于觀察到的發射和溶劑化過程的示意圖［23］（H）Fig.3 Schematics of the dynamical aspects of various fluorescence phenomena of CDs［17］（A）. Schematic of the energy states and electron transition process for the asprepared CDs［19］（B） . Schematic of the HB effect dominating the CDs emission mechanism between molecule states and solvents［19］（C）. The change of the G band position（D） and D/G peak integral intensity ratios of CDs（E）in H2O and CCl4［21］. Scheme of the inner morphology of CDs which demonstrates interactions between the Cl-containing solvent molecules and luminescent centers［21］（F）. Density functional theory（DFT） calculation results on different model CDs［22］（G）.Sketch of the processes in CDs that contribute to the observed emission and solvatochromism［23］（H）

溶劑和碳點之間的特殊相互作用會對碳點的發射產生進一步的影響。碳點的結構中包含高度碳化的核和外部包覆的聚合物鏈或者官能團，這種結構因素導致碳點對周圍環境響應時的反應位點主要集中在其表面。Zhang 等［19］制備了一種氮摻雜碳點，通過對其在16 種溶劑中的光物理參數、光譜行為和溶劑特性的關聯性分析，發現碳點在質子性溶劑和非質子性溶劑中具有不同的響應現象，作者通過研究發現該碳點的氨基可與溶劑分子形成氫鍵，促進內轉換效應，導致譜峰發生移動，從而影響碳點的發光壽命和效率（圖3B、C）。此外，徐抒平等［20］也通過測量氮摻雜碳點和未摻雜的多種光物理參數，并借助Lippert-Mataga 模型和Kamlet-Taft 參數揭示了質子性溶劑中存在的氫鍵對碳點發光的影響。評估了氫鍵供體和受體對氫鍵效應的貢獻比例，分析了氮元素摻雜在碳點溶致變色效應中的重要作用，給出了許多溶劑敏感碳點的光物理參數。

以上研究認為碳點溶劑響應的發光特性主要來源于表面態，但最近的一項研究表明溶劑分子也可以進入到碳點內部，影響碳點中的碳核結構。Stepanidenko等［21］通過對檸檬酸和乙二胺合成的碳點的光學性質進行研究。發現在吸收帶和熒光發射帶內可以分解出一組窄峰，通過對水中（高極性）和四氯化碳（低極性）中碳點的拉曼光譜進行測定，發現碳點在不同極性溶劑中的拉曼光譜響應行為有所差異，這與含氯溶劑與碳核的相互作用有關。因此，他們認為含氯的溶劑會穿透碳點進入內層，進而導致發光中心之間的距離增加，從而影響碳點的發光（圖3D~F）。

碳點自身形成的微觀分子結構也會影響其極性敏感特性，Wang等［22］制備了兩種具有極性敏感特性的碳點。通過對比實驗發現由鄰苯二胺合成的碳點表現出微弱的熒光發射（QY 約為2.8%~6.1%）和39 nm 的溶致變色位移。相反，由鄰苯二胺和4-氨基苯酚所合成的碳點則顯示出更高的溶致變色位移（87 nm）和發光量子產率（QY 約為18.4%~32.5%）。通過對合成的兩種碳點的結構、組成進行分析，驗證了碳點的極性敏感特性來源于吡咯氮和氨基氮的形成，并通過密度泛函理論計算進行了證實（圖3G）。

上述列舉的4種發光機制或者影響因素并非單獨作用，其存在一定的協同效應。Reckmeier 等［23］通過分析碳點在水和DMSO 溶劑中的吸收、發光、壽命等光譜信息研究了氮摻雜和氮硫共摻雜碳點中的極性敏感特性。結果表明，碳核態、邊緣帶和表面官能團均會參與其中，共同影響碳點的發射（圖3H）。

2.2 極性敏感碳點的應用

得益于碳點優異的發光特性，極性敏感碳點在細胞成像和細胞內極性傳感領域取得了諸多進展。鄭州大學李朝輝教授課題組［24］發展了多種極性敏感碳點。如圖4A所示，2021年，該課題組通過對對苯二胺結構進行改進，利用N-苯基-苯二胺作為前驅體合成了一種新型的極性敏感碳點。其具有強烈的分子內電荷轉移特性，對溶劑極性表現出靈敏的響應，在1，4-二氧六環和水中的熒光強度差異可達到509 倍。細胞成像結果顯示該碳點可以定位在細胞內的溶酶體中，并能監測饑餓條件下溶酶體的極性變化。借助于這種探針，他們首次監測了斑馬魚傷口愈合過程中極性的動態變化，為評價傷口愈合程度奠定了基礎。2022 年，該課題組繼續通過改進苯胺結構前驅體，以2-甲酰苯硼酸頻哪酯作為改性劑，合成了一種可對極性實現超敏感響應的碳點。該碳點的特殊之處在于不僅其熒光強度與極性之間存在線性關系，且其最大發射波長也與極性存在線性關系，可實現對細胞內的極性評估。他們使用成像設備中的原位發射光譜對脂滴和細胞質中的極性變化進行雙色成像定量分析，揭示了脂滴的極性異質性和細胞質中的極性均勻性，并對癌細胞和正常細胞進行了區分［25］（圖4B）。該課題組2022年又通過6-氨基苯并［c］［1，2］氧雜硼雜環戊-1（3H）-醇鹽酸鹽和酒石酸合成了一種具有極性和粘度雙敏感的溶酶體靶向碳點，該碳點具有水溶性好、發射不受pH依賴、生物相容性好和光穩定性優異的優點，可以根據癌細胞內溶酶體微環境極性較低、粘度較高的特征區分癌細胞與正常細胞，在癌癥診斷領域具有廣闊的應用前景［26］。徐抒平等［27］通過N，N-二乙基對苯二胺溶劑熱合成出了一種新型發光碳點，該碳點具有明顯的溶致變色特征，對溶劑的極性變化極為敏感。得益于上述特性，該團隊將此碳點應用于細胞內脂滴的成像，并通過其極性響應特性測量了細胞內脂滴簇的極性（圖4C）。

圖4 對極性敏感的PPh-CDs的合理設計以及CDs在監測斑馬魚截肢過程中極性變化的應用［24］（A）；脂滴和細胞質成像示意圖［25］（B）；CPDs的合成及其在脂滴成像中的應用示意圖［27］（C）Fig.4 Rational design of the polarity-sensitive PPh-CDs and the use of the CDs in monitoring polarity changes during amputation of zebrafish［24］（A）. Schematic representation of the lipid droplets and cytoplasm imaging with different emission windows and high-fidelity detection of polarity by in situ emission spectrum［25］（B）. Schematic diagram of synthesis of CPDs and their applications in lipid droplet imaging［27］（C）

3 粘度敏感型碳點

3.1 粘度敏感碳點的響應機制

粘度為擴散過程中的一個關鍵參數。在生物系統中，黏度影響著有機體和細胞水平上的各種生物活動，如細胞內的粘度影響著生物體代謝水平、細胞間信號的轉導以及生物大分子之間的相互作用。在亞細胞器水平，多種細胞器也受周圍粘度微環境的影響，進而產生各種各樣的生理過程變化。另外，包括脈粥樣硬化、阿爾茨海默病在內的多種疾病也均與粘度的異常相關。

粘度敏感碳點的研究目前尚處于初步探索階段，在設計粘度敏感碳點時通常需參考小分子熒光探針中的分子轉子理論。粘度敏感碳點在特定波長的激發下，通過分子內旋轉失去活性，通常情況下量子產率較低。但在高粘度環境中，分子轉子受周圍介質粘度的影響而轉動受限，失活過程則主要轉變為熒光發射，從而導致在高粘度介質中熒光發射增強。Guo 等［28］通過前驅體設計，選擇檸檬酸和1-苯基吡咯烷作為反應物，使其高溫高壓下發生Friedel-Crafts 反應形成碳點。該探針利用檸檬酸所含的羧基和羥基，脫水碳化形成碳核；利用吡咯烷基高溫碳化后殘留在碳點表面作為分子轉子官能團，兩者互為補充。該粘度敏感碳點可響應溶劑粘度范圍為0.89~945 cP（圖5A、B）。Jing 等［29］通過飛秒瞬態吸收光譜探究了粘度對于碳點溶劑化弛豫過程的影響，結果表明在粘度較高的溶液中，溶劑和碳點之間具有更強的摩擦作用，影響溶劑化弛豫過程，進而影響發光（圖5C~F）。但由于關于粘度敏感的碳點報道有限，其響應機制是否可以通過小分子熒光團的敏感機制被揭示？是否會由于自身特殊的結構因素帶來更為復雜的粘度敏感響應機制？這些問題都有待于進一步研究。

圖5 CDs的合成路線和隨著粘度增加而增加的CDs的熒光強度［28］（A）；使用CDs通過熒光變化和位置切換同時監測線粒體粘度動力學和MMP［28］（B）；CDs相對于溶劑粘度的重新定向排列時間［29］（C）；計算的結構（D）和不同模式的能級（E）；N和O摻雜CDs的吸收、溶劑化弛豫、受激發射和激發態吸收過程的模型［29］（F）；溶酶體靶向和區分癌癥細胞和正常細胞的CDs合成途徑和傳感模型［26］（G）Fig.5 Synthetic route of CDs and turn-on fluorescence of CDs with increasing viscosity［28］（A）. Illustration of simultaneous monitoring of mitochondrial viscosity dynamics and MMP through fluorescence variation and location switching using the CDs［28］（B）.Reorientation times for CDs versus viscosity of solvents（C）.Calculated structures（D） and energy levels of different modes（E）.Model of absorption，solvation relaxation，stimulated emission，and excited state absorption processes in N and O-doped CDs［29］（F）. Synthetic route and sensing model of the CDs for lysosome targeting and distinguishing between cancer cells and normal cells［26］（G）

3.2 粘度敏感碳點的應用

粘度敏感碳點的應用相對少，僅限于細胞內的粘度傳感。Xiao等［26］制備了一種新型粘度/極性雙響應溶酶體靶向碳點，實現細胞免洗熒光成像，用于癌細胞和正常細胞的區分（圖5G）。Guo 等［28］設計了線粒體靶向粘度碳點，建立了線粒體膜電位與粘度的關系，闡明了兩者之間的相互作用。該研究發現在線粒體膜電位正常的活細胞中，碳點聚集在線粒體中，而當線粒體膜電位消失時細胞死亡，此時的碳點則聚集在核仁中，通過熒光信號的變化以及碳點的空間位置實現線粒體粘度和線粒體膜電位波動的檢測。研究中還觀察到在藥物刺激的細胞中線粒體表現出粘度增加并伴隨膜電位減少的現象，這為線粒體相關生物學效應的研究提供了有價值的信息（圖5A、B）。

4 溫度敏感型碳點

4.1 溫度敏感碳點的響應機制

溫度是一個基本的熱力學參量。細胞內中眾多生物過程均受到溫度的影響，癌癥、炎癥等疾病均和細胞內溫度的異常相關。目前已經開發出多種新型發光材料用于溫度的傳感，包括量子點、稀土摻雜發光材料、MOFs等。碳點的溫度敏感機制還不具備完備的溫敏解釋理論。部分學者結合碳點的發光機制將其溫敏特性歸因于表面態的非輻射通道的熱激活效應。在低溫情況下，非輻射通道未被激活，因此可以通過輻射光子發射熒光。相反，隨著溫度的升高，更多的非輻射通道被激活，激發的電子通過非輻射過程回到基態，導致熒光強度降低。

Yu等［30］在2012年首次報道了碳點溫度依賴熒光發射的特性，并將其與半導體納米顆粒的溫敏性質進行比較。通過時間相關單光子計數技術（TCSPC）測量了碳點在不同溫度下的熒光壽命，發現在溫度較高時，其非輻射衰變速率較快，從而導致更快的發光弛豫過程。此外，通過對于光譜峰的指認發現其中兩類特殊的熒光峰（高能帶和低能帶峰）與溫度并不相關，推論電子-電子散射效應是碳點產生溫敏效應的來源（圖6A~C）。Kalytchuk 等［31］通過將樣品的輻射躍遷和非輻射躍遷常數與碳點的熒光量子產率相關聯，通過探究碳點的溫度依賴吸收特性繪制了輻射躍遷和非輻射躍遷常數與溫度的關系，結果發現非輻射躍遷常數隨著溫度的增加持續上升，而輻射躍遷常數卻在此溫度范圍內變化不大，該實驗證實了溫度對于非輻射躍遷的影響大于輻射躍遷。Guo 等［32］發現溫度除了影響碳點的非輻射躍遷過程外，還顯著影響其輻射捕獲效率。為了證實這一點，作者將熒光強度和阿倫尼烏斯公式相關聯，描繪了熱活化能和熒光強度的關系，并闡述了輻射和非輻射重組率與溫度的關系，進一步證實了在溫度上升時，碳點非輻射速率提高的現象，表明了碳點的溫敏特性是非輻射弛豫通道的激活和輻射捕獲效率變化雙重作用的結果（圖6D）。

圖6 CDs的兩個發光位點：核心（帶Ⅰ）和表面（帶Ⅱ）［30］（A）；CDs的熒光強度與兩個波段溫度的擬合關系［30］（B）；作為溫度函數的550 nm下的時間分辨熒光光譜測量［30］（C）；ln［（I0/IT）-1］對1/kT Cys-CDs溶液的依賴性［32］（D）；CDs在20°C和80°C水溶液中的紫外-可見吸收光譜［34］（E）；CDs在80°C水溶液中的TEM圖像，尺寸增加到（4.4±0.2）nm［34］（F）；dCD孵育的HeLa細胞在不同溫度下的熒光顯微圖像［37］（G）Fig.6 Two luminous sites of CDs：core（bandⅠ） and surface（bandⅡ）［ 30］（A）. Fitting relationship between CDs PL intensity and temperature of two bands［30］（B） . Time-resolved PL measurements at 550 nm as a function of temperature［30］（C）. The dependence of ln［（I0/IT）-1］ on 1/kT Cys-CDs solution［32］（D）. UV-Vis absorption spectra of CDs in aqueous solution under 20 and 80 ℃［34］（E）. TEM image of CDs in aqueous solution at 80 °C and the size increased up to（4.4 ± 0.2） nm［34］（F）.Fluorescence microscopy images of dCD incubated HeLa cells at the different temperatures［37］（G）

除了利用熱力學相關理論和光物理參數外，研究者也嘗試其他手段探究碳點的溫度敏感行為。He等［33］通過測量不同溫度下碳點的水合半徑，發現隨著溫度的提高，碳點的粒徑不斷增加，表明溫度會導致碳點的聚集，從而影響發光。Wang等［34］也通過透射電子顯微鏡（TEM）觀測到溫度發生變化時，碳點粒徑增加的現象（圖6E、F）。Yang 等［35］通過利用強還原劑硼氫化鈉對碳點表面進行處理，由氧化態變為還原態。還原后消除了碳點表面較多的羰基官能團，碳點表現出熒光減弱、溫敏程度降低的趨勢，他們將這一現象歸因于碳點表面官能團對溫敏特性有所貢獻。通過將固態碳點分散在不同介質中的碳點的熒光行為進行對比，發現固態碳點仍能保持熒光性質，但溫敏特性幾乎消失。而分散在乙醇中的碳點相較于分散于水中的碳點也表現出不靈敏的溫度響應，這一現象歸因于氫鍵的作用。

4.2 溫度敏感碳點的應用

溫敏碳點常被應用于細胞及活體溫度傳感領域，并開發了多種模式的傳感探針，包括強度依賴型、熒光壽命依賴型、熒光比率型等。

Wang等［36］通過溶劑熱處理合成了8種新型碳點，并選取了溫度敏感性能最好的Y-CDs實現了對溶液溫度的精確識別。這種碳點具有良好的溫敏循環性和再現性，可分布在細胞質和細胞核中，輔助熒光共聚焦顯微鏡觀察細胞溫度改變。Kalytchuk 等［31］建立了碳點的熒光壽命和溫度之間的關系，通過矯正曲線對細胞內每次測量的溫度進行確定。基于該碳點的溫度敏感探針檢測結果與參考探針的測試結果吻合度良好，可通過熒光壽命的變化指示細胞內的溫度差異。Macairan 等［37］通過碳點發展了一種比率型納米溫度傳感探針，通過藍色和紅色通道成像HeLa細胞在不同溫度下的熒光強度建立比率型溫度探針。該熒光探針不受測試條件、碳點濃度變化的影響，展現了良好的應用前景（圖6G）。

5 結論與展望

環境敏感性碳點作為一種智能型碳納米材料，表現出巨大的應用潛力。本文匯總了近年四類環境敏感型碳點的響應機制及其在生物傳感研究中的最新進展，以期為設計和合成更易調控、高敏感的環境敏感型碳點提供參考。在環境敏感型碳點發光機制探究方面仍需要大量的研究投入和探索。目前大多數報道是通過對照實驗或者通過響應前后產物的結構分析推演出的經驗規則，大多僅適用當下實驗，較難成為普適性的碳點設計原則。建立更貼合實際的理論模擬模型和方法，對其形成過程、響應過程進行探究，將有助于進一步理解碳點的形成機制和響應機制。此外，建立多種碳點原位的結構分析技術，以及對環境響應過程的原位跟蹤和解析，將有助于我們理解其發光機制和調控機制。

目前，領域內關于碳化聚合物點的具體發光機制問題尚未形成統一認識，相信隨著研究的不斷深入，碳化聚合物的理論體系會逐漸完備，最終形成具有普適性的發光理論體系，完善的發光機制也將極大地促進環境敏感碳點在膠體界面、藥物分析、生物治療和生物代謝物示蹤等方面的應用。環境敏感型碳點可以應用于膠體界面領域。表面活性劑在超過臨界膠束濃度（CMC）后可以形成微膠束，而CMC 前后膠束的親水親油性質會發生顯著改變。環境敏感型碳點可以感知周圍環境的油/水環境改變，從而影響其發光行為，使得其可以實現CMC 的傳感和測量，進而實現微膠束形成過程的動態表征。在生物應用方面，環境敏感型碳點可以響應細胞/體內不同酸堿性及極性的微環境，從而影響碳點的發光和響應行為，實現生物體內微環境的成像和光譜模式的傳感及測量。更進一步，細胞/體內的微環境也可以影響碳點以及碳點和藥物復合物的行為，而實現生物局部敏感及特異性的靶向給藥，有望在生物診療領域具有一定的應用價值。