線粒體活性氧靶向成像熒光探針概述

李穎穎，瞿 瑛，朱凌云

（國防科技大學 理學院，湖南 長沙 410073）

1 線粒體的結構與功能

1.1 線粒體簡介

1980 年，德國生物學家Altmann 通過光學顯微鏡在動物細胞中發現了一種顆粒狀的物質，并將其命名為小體（Bioblast），但Altmann 認為小體是一種共生于細胞的細菌。隨后，1897 年生物學家Benda也觀察到了小體并將其命名為線粒體（Mitochondria）。隨著對線粒體的研究和認識不斷加深，1948年科學家發現線粒體是細胞進行三羧酸循環的場所。自此，科學家逐漸認識到線粒體在生命活動中的重要位置，并對其開展了深入的研究［1-2］。

線粒體是一類包含雙層膜的封閉細胞器，一般為短棒狀或者球狀，直徑約為0.5~10 mm［3］。常規的線粒體，其長度約3 μm，直徑1 μm 左右，部分細胞中的線粒體長度可達10~20 μm（圖1A）［4］。線粒體的數量在不同類型的細胞中也存在差別，一般而言，每個細胞含有幾百到幾千不等的線粒體，但在心臟、肝臟、小腸等代謝旺盛的器官中，需要消耗更多能量，因此組成這些器官的細胞的線粒體數目更多，以為細胞活動提供充足的能量。上述細胞中線粒體在細胞質中所占的比例也較大，如在心肌細胞中，線粒體占細胞質的50%。此外，線粒體在細胞中的分布也存在一定的規律，在細胞代謝旺盛的區域，其分布密度更大，如在腎細胞中線粒體緊靠微血管分布，而在動物精子中，線粒體分布在鞭毛中區。在細胞代謝過程中，當細胞對能量的需求發生改變時，線粒體會根據細胞的需要，在細胞質中進行定向運動、變形、增殖以及相互融合［5］。總之，線粒體是一種動態的細胞器，是細胞能量的“能量工廠”，在細胞的生命活動中起著較為關鍵的作用。

圖1 線粒體的基本結構［4］（A），線粒體內ROS的生成及其基本種類（B）Fig.1 The basic structure of mitochondria［4］（A），the generation of ROS in mitochondria and its general species（B）

線粒體作為細胞內主要的能源產生室，在多種細胞事件中發揮著重要作用，例如三磷酸腺苷（ATP）的產生以及細胞死亡、凋亡等過程。線粒體除了給細胞提供生命活動所需的能量，還是細胞的“化工廠”，是細胞中物質氧化分解的場所。此外，線粒體還有維持細胞機能的各種功能，比如調節細胞的氧化還原水平、維持細胞的Ca2+穩態、氧自由基的生成、細胞凋亡、電解質平衡、調控細胞生長和細胞周期等。

1.2 線粒體內的活性氧

線粒體進行三羧酸循環時，消耗氧氣（O2），傳遞電子，最后將二磷酸腺苷（ADP）氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（ATP），這一過程伴隨著活性氧（ROS）的產生［6］。線粒體中ROS的種類很多，最常見的有超氧化陰離子、過氧化氫（H2O2）、過氧亞硝基陰離子（ONOO-）等（圖1B）。其主要形成原理是，氧原子的最外電子層含有兩個未配對的電子，O2得到1 個電子形成，得到2 個電子并結合質子（H+）后形成過氧化氫（H2O2），方程式為H2O2通過芬頓反應得到3 個電子后，產生高活性的羥自由基（.OH）—（Fe2++H2O2→Fe3++.OH+OH–）［7］。ROS 作為信使分子參與許多生理過程［8-9］，因此線粒體功能紊亂會導致線粒體呼吸鏈產生過量的ROS，并導致疾病發生。當ROS含量超過細胞允許濃度時，則會造成細胞的氧化應激（Oxidative stress），從而影響細胞的正常生理過程，甚至會誘導細胞發生凋亡，導致衰老、神經性退行等疾病的發生［10-11］。與此同時，研究者也利用ROS 殺死瘧原蟲或癌細胞，如青蒿素及其衍生物含有過氧橋（—O—O—）結構，瘧原蟲代謝所產生的螯合鐵或者癌細胞中的鐵可使過氧橋還原，從而產生ROS 殺死瘧原蟲或癌細胞［12-14］。由此可見，對線粒體內的ROS進行研究，了解其在線粒體中的濃度和時空分布的變化，對揭示活性氧與生命體的相互作用有著重要的意義。目前用于檢測不同類型活性氧的方法很多，其中熒光成像具有高時空分辨率、高靈敏等優勢，是監控線粒體中ROS 的首選方法。ROS 在體內存在的半衰期僅為15 s 左右，大量靈敏的熒光成像方法被開發并應用于ROS成像和檢測，下文將對近幾年報道的活性氧熒光探針進行簡單介紹。

2 線粒體內活性氧的熒光探針

2.1 具有線粒體靶向功能的O2?-熒光探針

圖2 基于ICT的探針設計策略（A），探針HQ的結構及其響應機理［17］（B），探針HKSOX-1的結構及其響應機理［18］（C），探針1的結構及其響應機理［19］（D）Fig.2 The ICT based probe（A），the structure and response mechanism of probe HQ［17］（B），the structure and response mechanism of probe HKSOX-1［18］（C），the structure and response mechanism of probe 1［19（］D）

圖3 基于PET的探針設計策略（A），O2.-探針MF-DBZH的結構及其響應機理［20］（B）Fig.3 The strategy of the PET based probes（A），the structure and response mechanism of probe MF-DBZH［20］（B）

2.2 具有線粒體靶向功能的次氯酸熒光探針

作為生物體內最重要的活性氧簇之一，次氯酸（HClO）/次氯酸鹽（ClO-）是髓過氧化物酶（MPO）催化H2O2和氯離子（Cl-）所產生的氧化產物。在免疫系統中，HClO 能夠對微生物的入侵起到一定的防御作用。據報道，人體體液中HClO/ClO-的平均濃度約200 μmol/L，當HClO/ClO-的含量低于或高于平均濃度時，會產生致病性氧化應激損傷，導致疾病的產生［21］。

目前的次氯酸熒光探針主要有3類。首先是以C=C 鍵為HClO/ClO-識別基團的熒光探針，其結構中的飽和C=C 鍵可以延長共軛結構，使熒光發射波長紅移。但當其與ClO-反應時，探針內的C=C鍵被破壞，形成醛基和環氧化合物等基團，使得探針分子的共軛結構及電子分布發生改變，進而導致探針的熒光增強或者發射波長改變。如Zhang 等［22］以吡啶陽離子為線粒體靶向基團，設計合成了基于熒光共振能量轉移（FRET）的比率型熒光探針Zcp-Me（圖4A）用于 HClO/ClO-檢測。在420 nm 的光激發下，該探針發生FRET，在波長486 nm 下有微弱熒光，在波長609 nm 下有較強熒光。基于同樣的反應機理，Yin等［23］設計合成了探針PZ-PY（圖4B），該探針具有選擇性高、檢出限（17.9 nmol/L）低等優點。彭孝軍課題組［24］在2013年也報道了一種以C=C鍵為識別基團的熒光探針PTZ-Cy2（圖4C），該探針是一種比率型的熒光探針，其通過將苯并噻嗪和半菁以雙鍵相連，可實現HeLa細胞線粒體中內源性ClO-的成像。

圖4 次氯酸熒光探針Zcp-Me［22］（A），PZ-PY［23］（B）及PTZ-Cy2［24］（C）的結構及其響應機理Fig.4 The structures and response mechanism of HClO probes Zcp-Me［22］（A），PZ-PY［23］（B） and PTZ-Cy2［24］（C）

由于HClO/ClO-具有強氧化性，含硫族化合物（S 和Se）的熒光分子可以和HClO/ClO-發生氯化或氧化反應生成相應的氧化物，引起熒光探針光譜信號的變化。利用這一特性，彭孝軍課題組設計合成了用于ClO-檢測的熒光比色探針SeCy7［25］（圖5A），該探針以七甲川菁為熒光基團，Se 為檢測基團，具有響應速度快、近紅外發光的優勢，可實現活體大鼠體內ClO-的成像。

圖5 次氯酸熒光探針SeCy7［25］（A），MitoClO［26］（B），Rh-Py［27］（C）以及RMClO-2［28］（D）的結構及其響應機理Fig.5 The structures and response mechanism of HClO probes SeCy7［25］（A），MitoClO［26］（B），Rh-Py［27］（C） and RMClO-2［28］（D）

HClO/ClO-的強氧化性使之可以和一系列基團發生反應，也可以將醛肟基團氧化為相對應的醛、羧酸或腈氧化物。基于這一氧化還原反應可設計合成HClO 的反應型熒光探針。2013 年，Peng 課題組［26］以氟硼二吡咯化合物（BODIPY）為熒光母體，肟基為HClO/ClO-識別基團，合成了反應型熒光探針MitoClO（圖5B）。該探針是一種熒光增強型探針，其與NaClO 反應后，熒光增強35 倍，可被用于活體細胞MCF-7線粒體內ClO-的監測。

HClO/ClO-的強氧化性還可將酰肼/磺酰肼氧化為醛基和羧酸等基團。Li 等［27］以羅丹明為母體，設計合成了檢測ClO-的關開型熒光探針Rh-Py（圖5C）。該探針與ClO-結合后，羅丹明上的酰肼部位發生開環反應，使羅丹明母體的熒光恢復。Rh-Py 可被用于檢測HeLa 細胞線粒體中的ClO-分子。Hou 等［28］將香豆素與羅丹明進行連接，設計合成了探針RMClO-2（圖5D），該探針是首例用于檢測線粒體內ClO-含量的比率熒光探針。RMClO-2對ClO-的響應非常快（5 s內），且靈敏度高、選擇性好，可用于線粒體外源性和內源性ClO-的檢測。

2.3 具有線粒體靶向功能的H2O2熒光探針

H2O2是線粒體中一種重要的ROS［29］，正常生理濃度下的H2O2是有益的，但其含量異常會導致多種疾病的發生，比如炎癥性疾病、糖尿病、神經系統性疾病和心血管疾病等。

硼酸頻哪醇是常見的H2O2檢測基團，在H2O2的氧化下，硼原子上形成氫鍵，然后經過遷移、重排和水解生成羥基化合物，含有硼酸頻哪醇的探針結構發生變化，其熒光性質也隨之改變（圖6A）。如Shao 等［30］以甲基硼酸頻哪醇酯作為H2O2的反應基團，季銨喹啉單元作為線粒體的靶向基團構建了探針Mito-H2O2，該探針與H2O2反應后“開啟”，釋放出咔唑衍生物的熒光，使體系在527 nm 處的熒光強度增強33 倍（圖6B）。Chang 等［31］基于該原理設計了具有線粒體靶向功能的熒光探針MitoPY1，可用于監控氧化應激情況下線粒體中過氧化氫的濃度變化（圖6C）。Kim 等［32］使用苯硼酸頻哪醇酯作為H2O2識別基團，設計合成了可以檢測線粒體H2O2含量的比率型熒光探針SSP-Mito，可以檢測到深度大于100 μm的組織中的H2O2含量（圖6D）。

圖6 基于硼酸酯的H2O2熒光探針（A），H2O2熒光探針Mito-H2O2［30］（B），MitoPY1［31］（C），SSP-Mito［32］（D）的結構及其與H2O2的反應機理Fig.6 The borate-based fluorescent probe of H2O2（A），the structures and response mechanism of H2O2 probes of Mito-H2O2［30］（B），MitoPY1［31］（C），SSP-Mito［32］（D）

2.4 具有線粒體靶向功能的NO與ONOO-熒光探針

Xiao 等［33］以內酰胺為NO 識別位點，設計合成了能夠檢測線粒體內源性NO 的熒光探針Mito-Rh-NO（圖7A）。該探針可通過與NO 反應，使內酰胺開環并使羅丹明分子的熒光恢復。Guo 等［34］以鄰苯二胺為反應位點，基于NO 與鄰苯二胺的成環反應可阻止PET 使體系熒光恢復構建的探針（圖7B）也可用于內源性NO成像。

圖7 NO熒光探針Mito-Rh-NO［33］（A）及探針1［34］（B）的結構式及其反應原理Fig.7 The structures and response mechanism of NO probes Mito-Rh-NO［33］（A） and probe 1［34］（B）

Lu小組［35］設計了一種三苯胺衍生物比率型熒光探針TP-1Bz，該探針帶有1個乙烯基連接的N-甲基苯并噻唑，可用于線粒體中粘度和ONOO-的雙重成像（圖8A）。TP-1Bz 可與商業化線粒體燃料Mito Tracker Green 相媲美，共定位率高達0.98，已被用于活體組織內ONOO-的檢測。Zhang 等［36］設計了一個可在數秒內快速響應ONOO-的熒光增強型探針1，其與ONOO-反應后的熒光強度增強了85 倍，而且檢出限低至 4 nmol/L。Cheng 等［37］基于FRET 機理，設計了一個靶向的線粒體ONOO-雙光子比率型熒光探針MITO-CC（圖8B），其在試管溶液中對ONOO-的檢出限低至11.30 nmol/L，熒光強度增強了93 倍，20 s內即可快速響應ONOO-。

圖8 ONOO-熒光探針TP-1Bz［35］（A）和MITO-CC［37］（B）的結構及其反應機理Fig.8 The structures and response mechanism of ONOO-probes TP-1Bz［35］（A） and MITO-CC［37］（B）

3 總結與展望

靶向線粒體的ROS熒光探針對闡明線粒體內ROS對活細胞、組織和生物體的復雜影響具有重要意義。通過合理巧妙的設計和改造能夠提高這些探針的特異性、動力學響應和應用范圍，監測線粒體內H2O2、HClO、NO、ONOO-等ROS。雖然此類探針眾多，但其水溶性、靈敏度和準確度仍有待進一步提高；此外，活細胞超分辨熒光成像技術發展迅猛，如受激輻射損耗（STED）顯微術，突破了傳統顯微鏡200 nm 的分辨率極限，可觀測數十甚至數納米尺度死亡細胞的微觀結構，但高功率STED 對熒光團的快速光漂白以及對細胞的光損傷很大程度上限制了其應用。因此開發亮度高、穩定性強的熒光染料以滿足特定的成像要求，將有助于活體診斷和成像等生物醫學研究。