基于內(nèi)標(biāo)型花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)拉曼粒子的pH傳感

張銘中，關(guān)鵬程，林嘉盛，許珊珊，張凡利，張?jiān)吗ǎ钪居拢顒︿h，，，6*

（1．中國(guó)計(jì)量大學(xué) 光學(xué)與電子科技學(xué)院，浙江 杭州 310018；2．廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005；3．廈門大學(xué) 材料學(xué)院，福建 廈門 361005；4．廈門大學(xué)第一附屬醫(yī)院，福建 廈門 361005；5．廈門大學(xué) 能源學(xué)院，福建 廈門 361005；6．嘉庚創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005）

汗液檢測(cè)作為一項(xiàng)重要的生理監(jiān)測(cè)方法，其應(yīng)用前景十分廣闊。通過汗液中豐富的生理信息，能夠?qū)崿F(xiàn)更有效的健康管理，不僅可提升監(jiān)測(cè)效率，還提供了更舒適的監(jiān)測(cè)方式［1］。同時(shí)，汗液檢測(cè)也在推動(dòng)醫(yī)學(xué)和科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展方面取得了顯著進(jìn)步，為疾病診斷、預(yù)防以及人體生理機(jī)制的深入研究提供了有力支持。其中對(duì)于汗液pH值的檢測(cè)有助于評(píng)估身體的酸堿平衡，反映代謝健康和運(yùn)動(dòng)效果，同時(shí)可早期發(fā)現(xiàn)代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)，為個(gè)體化健康管理提供重要參考。因此，對(duì)汗液pH值無創(chuàng)檢測(cè)的研究越來越多，如采用電化學(xué)［2-3］、比色法［4］等對(duì)汗液進(jìn)行檢測(cè)。但由于汗液的pH值變化較小，以上方法很難精準(zhǔn)反應(yīng)汗液pH值的變化趨勢(shì)或檢測(cè)成本較高。

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)可通過表面增強(qiáng)效應(yīng)顯著提升拉曼光譜的信號(hào)強(qiáng)度［5］，其高靈敏度和單分子級(jí)別的檢測(cè)能力，在汗液pH 值檢測(cè)方面具有巨大潛力［6］，通過結(jié)合納米材料和高靈敏度的光譜分析，能夠?qū)崿F(xiàn)微小樣本中pH 值的準(zhǔn)確測(cè)量［7］。SERS 的高度靈敏性使其能夠捕捉pH 值的微小變化，對(duì)于生物體內(nèi)的生理過程和疾病狀態(tài)監(jiān)測(cè)具有重要意義。此外，SERS 還具備快速［8］、非侵入性［9-10］和無標(biāo)記［11］的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)時(shí)汗液pH 值監(jiān)測(cè)中有很大應(yīng)用空間。Chung 等［6］采用熱塑性聚氨酯（TPU）靜電紡絲與金濺射涂層相結(jié)合的方法，制備出具有機(jī)械柔性的納米纖維SERS活性襯底，所研發(fā)的SERS 汗液pH 傳感器經(jīng)pH 敏感分子活化后，展現(xiàn)出良好的分辨率，但該活性基底對(duì)汗液pH 檢測(cè)的線性情況欠佳，需要開發(fā)更加穩(wěn)定可靠的參考峰來校正信號(hào)波動(dòng)。Lu 等［12］用含有內(nèi)標(biāo)分子信號(hào)的SERS基底檢測(cè)汗液中的尿酸，得到了良好的線性響應(yīng)曲線。

Zhang 等［13］報(bào)道了一種具有強(qiáng)“熱點(diǎn)”的花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)拉曼標(biāo)簽（PGERT），這種花瓣?duì)顨拥拈g隙結(jié)構(gòu)在638 nm 激光激發(fā)下的SERS增強(qiáng)因子可達(dá)5×109。除此之外，該粒子內(nèi)部間隙與表面可以修飾具有不同作用的分子，有著極其廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)于汗液pH值檢測(cè)而言，良好的增強(qiáng)與穩(wěn)定的信號(hào)校正均可提高信號(hào)的靈敏度與穩(wěn)定性。

本文在文獻(xiàn)［13］的基礎(chǔ)上，以4-巰基苯甲氰（4-MBN）為內(nèi)標(biāo)，制備了一種內(nèi)標(biāo)型的PGERT。這種形貌的粒子，能夠吸附更多的pH 敏感分子4-巰基苯甲酸（4-MBA），獲得更強(qiáng)更穩(wěn)定的拉曼信號(hào)，且內(nèi)標(biāo)分子提供了穩(wěn)定可靠的參考峰來校正信號(hào)波動(dòng)。首先，采用原位分析池建立pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后使用人工汗液作為樣本驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。接著以4-MBN 為標(biāo)定特征峰，得到更為優(yōu)越的校準(zhǔn)曲線，以及更高的線性關(guān)系和測(cè)量精確度，這對(duì)于其在汗液pH傳感器標(biāo)定、拉曼光譜儀校準(zhǔn)等方面的應(yīng)用非常有利，基于內(nèi)標(biāo)型PGERT 的拉曼分析方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)汗液中的pH 值，其實(shí)際應(yīng)用也得到了驗(yàn)證［14-15］。此外，它還具有與其它技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

KQ5200DA 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），UVmini-1280 紫外可見光譜儀（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司），GeminiSEM 500 掃描電子顯微鏡（SEM），JEM-1400 透射電子顯微鏡（TEM），XploRA PLUS 高性能全自動(dòng)拉曼光譜儀（HORIBA），LSP-02-2A 注射泵（LongerPump），PHS-3C pH計(jì)（上海雷磁）。

人工汗液、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）（上海源葉生物科技有限公司），抗壞血酸（AA）、硼氫化鈉（NaBH4）（上海滬試環(huán)保試劑科技有限公司），氯金酸（HAuCl4·4H2O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），4-巰基苯甲氰、4-巰基苯甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），十二水合磷酸氫二鈉、四水合磷酸二氫鈉（西隴科學(xué)股份有限公司），超純水（18.2 MΩ，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）。

1.2 納米粒子的合成

1.2.1 合成金種子首先合成金種子溶液［13］：在10 mL 0.1 mol/L 的CTAC 溶液中加入515 μL 4.86 mmol/L 的氯金酸溶液，并劇烈超聲。在30 ℃條件下加入450 μL 0.02 mol/L 的NaBH4，超聲混勻后靜置1 h。

1.2.2 合成金納米球在15 mL 0.1 mol/L 的CTAC 溶液中加入515 μL 7 mmol/L 的氯金酸溶液和75 μL 0.04 mol/L的AA溶液，隨后添加100 μL稀釋10倍的金種子溶液，并在40 ℃條件下持續(xù)攪拌1 h，得到約40 nm大小的金納米球。

1.2.3 金納米球改性在得到的10 mL金納米球溶膠中加入500 μL 10 mmol/L的4-MBN 溶液，常溫下超聲處理20 min。之后使用0.05 mol/L CTAC 溶液進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次。最后，將經(jīng)4-MBN 改性的金核重懸于5 mL 0.05 mol/L的CTAC溶液中。

1.2.4 生長(zhǎng)花瓣?duì)顨訉? mL 4-MBN 改性后的金核溶膠加入到16 mL 0.05 mol/L CTAC 溶液、480μL 0.04 mol/L 抗壞血酸和960 μL 5 mmol/L HAuCl4的混合生長(zhǎng)液中，加入0.5 μL 10 mmol/L 的4-MBN溶液之后，劇烈超聲7 min，得到內(nèi)部修飾了4-MBN 的花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)納米粒子溶液，用0.025 mol/L CTAC 溶液洗滌得到的溶液。取4 mL 按照上述方法合成的花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)納米粒子，加入500 μL 10 mmol/L 的4-MBA，超聲反應(yīng)10 min。用超純水清洗兩次，并將溶液定容至原體積的1/5，得到外部修飾了4-MBA的花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)拉曼標(biāo)簽。具體制備過程如圖1所示。

圖1 PGERT的制備過程Fig.1 The procedure of PGERT

最后取20 μL PGERT 溶膠滴加在5 mm×5 mm 的金片（單晶硅片上蒸鍍80 nm 厚度的金層）上烘干，制備成pH分析基底。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 SEM與TEM分析修飾有4-MBA的PGERT的SEM與TEM表征結(jié)果如圖2A所示。從圖中可以看到PGERT的外層形貌呈現(xiàn)出完整的花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)，其粒徑約110 nm，且分散性較好。花瓣?duì)顨咏Y(jié)構(gòu)的PGERT具有豐富的孔隙結(jié)構(gòu)、更多的熱點(diǎn)和更大的比表面積，有助于待測(cè)物的牢固吸附和富集，從而提升檢測(cè)靈敏度。

圖2 PGERT的SEM和TEM圖（A），金球修飾4-MBN前后的吸收光譜（B），PGERT修飾4-MBA前后的吸收光譜（C），分別修飾有4-MBA的PGERT與45 nm金球在相同濃度（1 nmol/L）下于1 710 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度（D）Fig.2 The SEM & TEM image of PGERT（A），absorption spectra of gold nanoparticles before and after 4-MBN modification（B），absorption spectra of PGERT before and after 4-MBA modification（C），SERS signal intensity at 1 710 cm-1 of PGERT and 45 nm gold spheres modified with 4-MBA at 1 nmol/L（D）

2.1.2 PGERT 合成過程中的紫外-可見吸收光譜對(duì)粒子的吸收光譜進(jìn)行了測(cè)試。修飾4-MBN 前金核的吸收光譜位于529 nm，將4-MBN 修飾到金球表面后，吸收光譜移至531 nm（圖2B）。4-MBN 作為內(nèi)標(biāo)的花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)納米粒子在約672 nm 處出現(xiàn)紫外吸收峰，經(jīng)pH 敏感分子4-MBA 活化后，紫外吸收峰紅移至約675 nm（圖2C）［5］。同樣在1 nmol/L的濃度下，修飾有4-MBA的PGERT的SERS信號(hào)強(qiáng)度是修飾有4-MBA 的45 nm金球的122倍（圖2D），即使用修飾有4-MBA 的PGERT作為基底可以獲得更強(qiáng)的拉曼信號(hào)，有利于觀察4-MBA拉曼峰相對(duì)強(qiáng)度的變化，在一定程度上提高分析的靈敏度與準(zhǔn)確性。

2.2 pH標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定與人工汗液的實(shí)際檢測(cè)

2.2.1 原位測(cè)定pH 標(biāo)準(zhǔn)曲線為減少4-MBA 信號(hào)波動(dòng)帶來的影響，采用原位分析池測(cè)定pH 標(biāo)準(zhǔn)曲線以提高穩(wěn)定性，即使拉曼聚焦點(diǎn)在基底同一個(gè)位置保持不變，用注射泵注入不同pH值（pH 5.0~8.0）的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液（PB），使用波長(zhǎng)638 nm的激發(fā)光源采集信號(hào)，采集條件為10 s，2.6 mW，測(cè)試裝置如圖3A 所示。根據(jù)拉曼信號(hào)標(biāo)定pH 值時(shí)，以受pH 值影響較小的拉曼峰為參考峰，通過pH 活性峰與參考峰積分之后的強(qiáng)度比（I積分（pH活性峰）/I積分（參考峰））的變化趨勢(shì)反應(yīng)pH值的變化。

圖3 原位測(cè)試示意圖（A），修飾有4-MBA 的普通金球分析基底在不同pH 條件下的拉曼譜圖（B）及不同pH 值條件下，其在1 710 cm-1處拉曼信號(hào)的變化譜圖（C）以及I（1 710 cm-1）與I（1 080 cm-1）（D）和I（1 710 cm-1）/ I（1 590 cm-1）（E）對(duì)pH值的擬合曲線Fig.3 Schematic of in-situ testing（A），Raman spectra of 4-MBA modified gold nanoparticles on a common gold substrate under different pH conditions（B），intensity of the 1 710 cm-1 Raman signal under different pH conditions（C），fitting curves of I（1 710 cm-1）/I （1 080 cm-1）（D） and I（1 710 cm-1）/ I（1 590 cm-1）（E） to pH

實(shí)驗(yàn)所涉及的拉曼峰歸屬如表 1 所示。在不同pH 值環(huán)境下，4-MBA 的羧基接受質(zhì)子或釋放質(zhì)子，主要反應(yīng)在1 710 cm-1（羧酸鹽振動(dòng)?（COO-）［16］）處的拉曼峰上。而來自于苯環(huán)呼吸的1 080 cm-1和1 590 cm-1處的拉曼峰受pH值的影響較小，以其為參考峰考察pH活性峰相對(duì)強(qiáng)度的變化［17］。

修飾有4-MBA的普通金球（45 nm）制備的pH分析基底在不同pH條件下的拉曼光譜圖如圖3B所示。其在1 710 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度隨著pH 值的升高而降低（圖3C）。將得到的數(shù)據(jù)代入I積分（pH 活性峰）/I積分（參考峰）中（參考峰分別為1 080 cm-1和1 590 cm-1處的峰），通過計(jì)算得到I（1 710 cm-1）與I（1 080 cm-1）積分的比值以及該比值與pH 值的擬合曲線，其相關(guān)系數(shù)r2=0.97（圖3D）。該結(jié)果的誤差棒較大，說明準(zhǔn)確度較低。而以I（1 710 cm-1）/I（1 590 cm-1）積分的比值擬合分析曲線時(shí)，r2=0.95（圖3E）且誤差棒較大。因此，用普通金球作為分析基底時(shí)不能精準(zhǔn)體現(xiàn)pH值的變化趨勢(shì)。

表1 含有內(nèi)標(biāo)分子的PGERT所涉及的拉曼峰歸屬Table 1 Assignment of Raman peaks associated with internal standard molecules in PGERT

對(duì)內(nèi)標(biāo)型花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)拉曼粒子構(gòu)建的pH 分析基底進(jìn)行考察。在含有內(nèi)標(biāo)分子的PGERT 中，以內(nèi)標(biāo)分子4-MBN 在2 234 cm-1處的拉曼峰（氰基的伸縮振動(dòng)?（C≡N））作為參考峰。4-MBN 在環(huán)境中比4-MBA 更穩(wěn)定，此外，4-MBN 在拉曼靜默區(qū)的拉曼峰減少了雜質(zhì)影響的可能性。修飾有4-MBA 的PGERT 在不同pH 值條件下的拉曼光譜如圖4A 所示，隨著pH 值的升高，4-MBA 在1 710 cm-1處的拉曼活性峰相對(duì)2 234 cm-1處的參考峰強(qiáng)度明顯下降。隨著pH值的變化，1 710、2 234 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度如圖4B 所示，圖4C 為I（1 710 cm-1）/I（2 234 cm-1）積分的比值與pH 值的擬合曲線。結(jié)果顯示，含有內(nèi)標(biāo)的PGERT 得到了線性系數(shù)r2=0.99 的擬合曲線和誤差棒較小的擬合結(jié)果，說明含有內(nèi)標(biāo)的PGERT 在標(biāo)準(zhǔn)PB緩沖液中可以更準(zhǔn)確地反應(yīng)所處環(huán)境的pH值。

圖4 修飾有4-MBA的PGERT作為分析基底時(shí)在不同pH值條件下的拉曼譜圖（A），1 710、2 234 cm-1處的拉曼信號(hào)強(qiáng)度隨pH值的變化圖（B），I（1 710 cm-1）/ I（2 234 cm-1）對(duì)pH值的擬合曲線（C）Fig.4 Raman spectra of PGERT modified with 4-MBA under different pH conditions（A），intensity of the 1 710，2 234 cm-1 Raman signals under different pH conditions（B），fitting curve of I（1 710 cm-1）/ I（2 234 cm-1） to pH value（C）

含有內(nèi)標(biāo)的PGERT 的pH 標(biāo)準(zhǔn)曲線有更好的線性關(guān)系，歸因于其內(nèi)部疏松多孔的“花瓣”間隙可以提供豐富的熱點(diǎn)［18］，并使更多的4-MBA 修飾其上，提供了更強(qiáng)且穩(wěn)定的4-MBA 信號(hào)，從而可獲得更高的靈敏度。而以4-MBN 為內(nèi)標(biāo)分子，可提供相對(duì)穩(wěn)定可靠的參考峰信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，在外界條件變化時(shí)更具穩(wěn)定性［19-20］。

2.2.2 汗液pH 值檢測(cè)人體汗液含有多種成分，包括電解質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)、乳酸等，這些成分可能對(duì)實(shí)際pH 值測(cè)定產(chǎn)生影響。人工汗液的成分與正常人體汗液相似度高達(dá)99.99%，本文以人工汗液為實(shí)際樣品考察所建基底的實(shí)用性。采用pH 計(jì)對(duì)4 份人工汗液進(jìn)行測(cè)量，得到人工汗液的實(shí)際pH 值分別為5.06、5.63、6.58、7.06。

取1 μL 不同pH 值的人工汗液樣品滴在附著有內(nèi)標(biāo)型PGERT 的pH 分析基底上，使用638 nm 波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行信號(hào)采集，將得到的數(shù)據(jù)代入到公式I積分（pH 活性峰）/I積分（參考峰）中，并代入擬合方程，得到的pH 值分別為4.95±0.26、5.37±0.06、6.20±0.02、6.80±0.07，與pH 計(jì)的測(cè)得值基本一致，結(jié)果如表2 所示。基于內(nèi)標(biāo)型花瓣?duì)铋g隙納米拉曼標(biāo)簽的傳感器僅需1 μL 即可實(shí)現(xiàn)人體汗液的高靈敏、可靠檢測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表2 pH計(jì)與內(nèi)標(biāo)型PGERT基底汗液測(cè)得值的比較Table 2 Comparison of sweat pH values measured by pH meter and internal standard PGERT substrate

3 結(jié) 論

本文以4-MBA 為pH 探針分子，引入4-MBN 分子作為內(nèi)標(biāo)，制備了一種含有內(nèi)標(biāo)的花瓣?duì)铋g隙拉曼納米標(biāo)簽，并用于構(gòu)建pH 分析基底，對(duì)其在汗液pH 傳感中的適用性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，含有內(nèi)標(biāo)的PGERT 可以穩(wěn)定地測(cè)試汗液的pH 值，能在pH 5.0~8.0 之內(nèi)提供精確傳感（與實(shí)際pH 值的誤差最大僅為7.17%），僅需1 μL 汗液即可實(shí)現(xiàn)測(cè)量。該標(biāo)簽在pH 值檢測(cè)方面表現(xiàn)優(yōu)異，其快的響應(yīng)速度和高的靈敏度使之在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物體液pH值變化中具備出色的能力，在醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)生理學(xué)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

含有內(nèi)標(biāo)的PGERT可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、連續(xù)的汗液分析，有助于個(gè)體的健康管理、運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和疾病監(jiān)測(cè)，應(yīng)用前景廣闊［21-22］。將此類花瓣?duì)铋g隙增強(qiáng)拉曼標(biāo)簽與可穿戴式汗液檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合（如水凝膠［2］、微流體芯片［23］、便攜式設(shè)備［24］和皮膚貼片［25］等），將為健康監(jiān)測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域帶來新的可能性，在汗液檢測(cè)和生物傳感器領(lǐng)域具有新的應(yīng)用前景。