川貝母生物堿的化學組成分析與IL-6結合活性成分的虛擬篩選*

王 恬,談娜娜,陸 佳,李狀洪,董丹妮,肖 健,王 樂

(寶雞文理學院 化學化工學院,陜西省植物化學重點實驗室,陜西 寶雞 721013)

川貝母(FritillariescirrhosisD. Don)又名卷葉貝母、松貝等,為百合科貝母屬植物的干燥鱗莖,主要產自四川、西藏、云南和甘肅等地,具有極高的藥用價值[1]。明代的《本草匯言》始有“貝母,開郁、下氣、化痰之藥也。潤肺消痰,止咳定喘,必也川者為妙[2]”。抗炎作用是川貝母藥材傳統的藥理活性之一,該活性也被多項相關的藥理研究所證實[3-4]。

近年來,使用LC-MS分析川貝母生物堿類成分的報道較多,如戢爽[5]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術,在正離子模式下對青海不同地域野生川貝母的化學成分進行快速分析和結構鑒定,共鑒定出貝母辛、貝母素甲、去氫鄂貝啶堿等異甾體類生物堿23個,垂茄次堿、茄啶等甾體類生物堿9個。徐連順[6]采用UPLC-MS/MS從川貝母中鑒定出4種生物堿成分,包括貝母素乙、貝母素甲、西貝母堿、貝母辛,分析表明其抗炎活性與PI3-At等信號通路密切相關。

白細胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)是由單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞及其他細胞類型產生的多效性細胞因子,在感染和炎癥過程中顯著上調[7],是宿主抵御環境壓力(如損傷和感染)的核心細胞因子[8]。IL-6是炎癥反應的主要標志之一,參與慢性炎癥的病理生理過程,能夠促進炎癥損傷和纖維化[9],能與靶細胞表面IL-6受體識別并結合成復合物,調控炎性細胞因子的表達[10]。

本研究旨在對川貝母生物堿類成分進行化學組成分析,并篩選出其中具有IL-6結合活性的化學成分。首先,通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析川貝母粗提物中的生物堿類成分,并對其ESI-MS/MS裂解途徑進行分析;再進行分子對接,篩選出其中有IL-6結合活性成分。本研究初步明確了川貝母生物堿類成分的化學組成,并從中獲取潛在的抗炎活性成分,可為川貝母的現代化開發提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 原料、儀器及試劑

川貝母購自寶雞醫藥大廈;濃氨水(Aladdin);氯仿(Aladdin);甲醇(Fisher, America);超純水(Millipore, America);LC-20ADXR液相色譜儀(日本島津);AB 4600質譜儀(AB SCIEX, America);ZNHW-1000電熱套(北京永光明醫療儀器廠);CP225D分析天平(Sartorius, Germany);固相萃取儀(Supelco Visiprep DL);固相萃取小柱(Agilent Technologies)。

1.2 川貝母生物堿粗提物的制備

稱取2.0 g的川貝母粉末,置于密閉圓底燒瓶中,加入4 mL濃氨水浸泡1 h后,加入40 mL氯仿-甲醇(v/v, 4∶1)混合溶液,回流1 h后,進行減壓抽濾,濾液使用固相萃取小柱(Bond Elut-SCX, 500 mg, 3 mL)凈化,凈化的步驟為:先依次用5 mL超純水、5 mL甲醇活化SCX小柱;然后取2 mL上述濾液過固相萃取小柱;再用5 mL超純水淋洗;最后用5 mL甲醇洗脫,過0.22 μm濾膜后于-20 ℃保存待測。

1.3 LC-MS分析

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Shim-pack XR-ODS(100 mm×2.0 mm, 2.2 μm);流動相:A:水-0.05%濃氨水、B:甲醇;梯度洗脫:0.5 min,20%甲醇;3 min,65%甲醇;8 min,85%甲醇;10 min,85%甲醇;11 min,100%甲醇;流速:0.3 mL/min;柱溫:35 ℃。

1.3.2 質譜條件

ESI正離子模式,去簇電壓60 V,噴霧電壓5 500 V,離子化溫度550 ℃,霧化氣55 psi,輔助氣55 psi,氣簾氣35 psi,全掃描模式,掃描范圍m/z100～800,碰撞能量:MS110 eV,MS240 eV。

1.3.3 數據分析

原始數據采集使用Analyst 1.7(AB SCIEX, USA),數據處理使用Peak View 2.2(AB SCIEX, Canada),化合物鑒定使用Formula Finder功能以及Natural Products HR-MSMS Spectral Library 1.0.1(AB SCIEX, USA),精確分子量誤差為±5×10-6。

1.4 分子對接

從RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)數據庫中獲取IL-6晶體結構(PDB ID: 1P9M),另準備梭砂貝母酮堿、貝母辛、原阿片堿、靛玉紅、東莨菪堿的分子結構文件,使用AutoDockTools(Version. 1.5.6)進行對接,使用Pymol(version. 2.5.2)將對接結果可視化。

2 結果與討論

2.1 川貝母提取物的LC-MS/MS分析

利用UPLC-TOF-MS/MS分析了川貝母提取物,樣品總離子流圖見圖1,各色譜峰基本分離良好。

圖1 川貝母提取物的UPLC-TripleTOF MS檢測總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the extract from Fritillaria cirrhosa UPLC-TripleTOF MS

川貝母生物堿類化學成分在正離子模式下具有較好的響應,因此采用正離子模式進行質譜分析,通過Peak View軟件的Formula Finder功能檢索,準分子離子在±5×10-6的質量誤差范圍內共鑒定出5種生物堿類化合物,包括貝母辛、原阿片堿、靛玉紅、東莨菪堿、梭砂貝母酮堿,相關成分具體信息見表1。

表1 川貝母中生物堿成分的LC-MS鑒定結果Tab.1 LC-MS identification result of alkaloids from Fritillaria cirrhosa

2.2 川貝母生物堿的ESI裂解規律分析

梭砂貝母酮堿屬于異甾體類生物堿,分子式為C27H43NO2,[M+H]精確分子量為414.336 66,在保留時間為9.08 min處出峰m/z414.335 2離子(圖2),與梭砂貝母酮堿準分子離子相差-3.52×10-6,因此,該化合物初步鑒定為梭砂貝母酮堿。

圖2 川貝母中梭砂貝母酮堿質譜圖Fig. 2 Mass spectrum of delavinone in Fritillaria cirrhosa

為了進一步確認鑒定結果,對梭砂貝母酮堿的ESI質譜碎片裂解規律進行了分析和歸屬。對離子m/z414.335 2進行二級質譜掃描,掃描結果如圖3所示。

圖3 梭砂貝母酮堿的ESI-MS/MS譜圖Fig. 3 ESI-MS/MS spectrum of delavinone base

梭砂貝母酮堿準分子離子峰(m/z414.335 2)可明顯觀察到,該化合物失去1個H2O分子產生碎片離子m/z396.322 9,失去2個H2O分子產生碎片離子m/z378.318 6,碎片離子m/z286.271 5來源于離子m/z396.322 9失去2個甲基再脫去1個C6H10基團得到,其裂解路徑分析如圖4,與文獻[13]報道一致。相關結果為化合物結構的鑒定提供了理論依據,進一步確認了鑒定結果,同時加深了對川貝母生物堿化學成分結構的理解。

圖4 梭砂貝母酮堿的ESI-MS/MS裂解途徑分析Fig. 4 Analysis of the primary fragmentation pathways of delavinone in ESI-MS/MS

2.3 川貝母生物堿與IL-6分子對接結果

川貝母生物堿與IL-6的分子對接結果如表2所示,其中結合能表示小分子與受體的結合力,對接結合能越低,化合物與靶點結合能力越強。結果表明,5種生物堿類成分中有4種與IL-6結合能力強,包括梭砂貝母酮堿、貝母辛、靛玉紅、東莨菪堿。

表2 IL-6分子對接結果Tab. 2 Molecular docking results of IL-6

圖5為化合物(梭砂貝母酮堿、貝母辛、靛玉紅、東莨菪堿)與IL-6的對接結果。梭砂貝母酮堿上的羥基氫與IL-6中的Gln 75氨基酸形成氫鍵作用(圖5(a)),結合能為-2.903 kJ/mol。貝母辛與IL-6中的氨基酸殘基Gln 75、Ser 228和Phe 229通過氫鍵作用力結合(圖5(b)),結合能為-4.757 kJ/mol,其中Ser 228之間的結合力最強。靛玉紅與IL-6中的氨基酸殘基Asp 221通過氫鍵作用力結合(圖5(c)),結合能為-5.044 kJ/mol。東莨菪堿與IL-6中的氨基酸殘基His 223通過氫鍵作用力結合(圖5(d)),結合能為-4.837 kJ/mol。

圖5 梭砂貝母酮堿(a)、貝母辛(b)、靛玉紅(c)、東莨菪堿(d)與IL-6的分子對接結果Fig. 5 Molecular docking results of IL-6 with delavinone(a), peimisine(b), indirubin(c), scopolamine(d)

分子對接結果表明,Gln 75,Ser 228,Phe 229,Asp 221和His 223為重要作用殘基。貝母辛與氨基酸殘基Gln 75,Ser 228,Phe 229,梭砂貝母酮堿與氨基酸殘基Gln 75,靛玉紅與氨基酸殘基Asp 221,東莨菪堿與氨基酸殘基His 223分別形成氫鍵。鍵長越短,鍵能越小,結合力越強,其中靛玉紅與IL-6結合作用最強。

3 結論

本研究從中藥川貝母中鑒定出5種生物堿類成分,其中4種(梭砂貝母酮堿、貝母辛、靛玉紅、東莨菪堿)與IL-6結合能力強。其主要結合方式為氫鍵作用力,其中梭砂貝母酮堿與IL-6中的氨基酸殘基Gln 75具有較強的氫鍵相互作用。這4種成分具有良好的潛在抗炎活性,可作為潛在的抗炎藥物先導化合物。研究結果可為川貝母資源的深入開發與相關抗炎藥物研發提供理論基礎。