跨膜蛋白Lgr5作為胃腸道惡性腫瘤干細胞分子表面標記物的研究進展

陳志達，陳 凜，郗洪慶

解放軍總醫院第一醫學中心普通外科醫學部，北京 100853

腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)具有干細胞特性，同時也具有腫瘤細胞的不死性、去接觸抑制、遷徙性等固有本質，是導致腫瘤復發和耐藥的主要原因[1]。Lgr5蛋白是G蛋白偶聯受體家族成員，是由Lgr5基因編碼表達的跨膜蛋白，廣泛表達于消化道組織，具有極強的干細胞活性，能夠持續自我更新，可以分化多譜系子代細胞[2]。近10年來，大量分子生物學、基于免疫抗體反應的基因譜系追蹤、類器官培養和小鼠動物實驗等研究結果不斷證實Lgr5陽性標記細胞具有促進腫瘤發生、發展、轉移以及上皮-間充質轉化的潛能[3-5]。基于Lgr5蛋白在胃腸腫瘤干細胞中高表達屬性，Lgr5蛋白被推薦為胃腸惡性腫瘤干細胞的標記物[6]。為更好地認識跨膜蛋白Lgr5的干細胞標記物屬性和特點，本文薈萃追蹤近年來Lgr5蛋白作為干細胞標記物在胃腸道腫瘤基礎領域的最新進展，并結合信號轉導通路和不同胃腸道腫瘤生物學活性特點，梳理分析Lgr5蛋白的標記識別作用、調控誘導機制以及作為靶標臨床靶向治療的潛在可能性，為下一步研究提供理論儲備。

1 Lgr5蛋白的結構基礎

Lgr5基因大小144 kb，位于12q22 ~ 23染色體區域，內有907個堿基序列的開放式閱讀框架編碼區域，由此轉錄翻譯產生Lgr5蛋白。Lgr5蛋白的結構與促甲狀腺激素、促卵泡激素、促黃體激素受體等其他糖蛋白激素受體相似，都屬于G蛋白偶聯受體家族(G protein-coupled receptor，GPCR)，但其N末端胞外配體結合區域卻顯著不同[7]。Lgr5蛋白的N末端細胞外結構由富含亮氨酸的17個重復序列、1個信號肽和7次α-螺旋跨膜的高度保守區域組成，是Lgr5蛋白與糖蛋白配體相互接觸的重要結構[2]。

Lgr蛋白家族同屬于胞膜蛋白，其中激素受體Lgr1、Lgr2和Lgr3蛋白很早就已經通過分離實驗獲知其相應的配體。因苦于沒有找到相應的配體，Lgr蛋白家族的Lgr4、Lgr5和Lgr6蛋白一直被認為是“孤兒”受體，直到2011年荷蘭學者De Lau等[8]在體外培養細胞時發現R-spondin生長因子(R-spondin growth factor)作為配體可以與Lgr4、Lgr5和Lgr6蛋白結合，繼而激活相應信號通路發揮作用。

Lgr5蛋白是跨膜蛋白，主要定位在細胞膜表面，通過與配體因子相互作用激活信號通路發揮調控作用。近年來多項研究表明，Lgr5蛋白具有空間動態分布特點，在細胞質和細胞核中也可以檢測到Lgr5蛋白的表達[9]。因此，Lgr5蛋白的多次跨膜結構和細胞內分布屬性是其介導細胞內外信號傳遞的重要基礎，為Lgr5蛋白標記調控細胞通路影響腫瘤細胞功能提供了可能。

2 Lgr5蛋白標記與信號通路的關系

2.1 Wnt信號通路 Wnt信號通路是目前胃腸道腫瘤Lgr5蛋白相關性研究較為集中的通路。在Lgr5蛋白參與腫瘤發生、進展和轉移過程中，受到強化的Wnt信號通路是最核心的通路途徑，刺激腫瘤干細胞增殖和自我更新[10]。當它被異常激活后，將會促進胃癌細胞的增殖、遷移和EMT轉化，進而影響胃癌細胞的耐藥能力，而且Wnt/βcatenin 信號通路也被認為是驅動組織修復和干細胞自我更新的關鍵途徑。

由成纖維細胞分泌的頂部盤狀底板反應蛋白(roof plate-specific spondins，RSPOs)是Lgr5蛋白的特異性配體，兩者相結合后以二聚體的形式存在[11]。兩者結合可以抑制β-連環蛋白(β-catenin)的泛素化降解復合體功能，導致β-catenin累積增多[12]，激活TCF轉錄因子，競爭性結合TCF4蛋白，形成中介復合物，驅動Wnt通路信號下游的靶基因轉錄過程，對胃腸道腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、EMT轉化和耐藥等過程發揮作用[13-14]。

2.2 Hedgehog信號通路 在正常成年人體內該通路表達靜默，但在胃腸道腫瘤組織中十分活躍，并與腫瘤的增殖分化、細胞凋亡、血管新生、侵襲及轉移有關[15-16]。該通路被激活時，釋放配體蛋白SHH與Ptch蛋白結合，解除Ptch蛋白對Smoothed (Smo)的抑制，而Smo蛋白可以進入細胞核內轉導引發級聯反應，刺激轉錄因子膠質細胞瘤轉錄因子1轉錄表達，進而改變細胞生物學特性，促進腫瘤增殖和上皮間質轉化[17-19]。

2.3 Hippo信號通路 Hippo信號通路高度保守。不同于其他信號通路，Hippo沒有特異性受體和配體，通路的核心是接收上游G蛋白偶聯受體信號或活化的酪氨酸激酶調控引起激酶級聯反應，通過降解或積累下游效應因子YAP來完成CSC穩態調節[20]。正常狀態下，YAP可以參與和誘導EGFR、Notch信號通路啟動腸道干細胞暫時性再生功能，修復腸道黏膜損傷[21]。而在胃腸道腫瘤發展過程中，細胞核中的YAP又可聯合β-catenin蛋白、TCF4形成結構復合體，以Lgr5作為靶基因，驅動胃腸道腫瘤細胞侵襲和遷移[22]。

3 Lgr5蛋白標記與胃腸道惡性腫瘤生物學活性的關系

3.1 胃癌 在正常胃部組織中，Lgr5蛋白主要局限表達于成熟幽門腺體的底部，并且具有自我更新能力，承擔著胃上皮細胞組織的長期更新工作。但當胃黏膜上皮細胞發生腸上皮化生，Lgr5蛋白又轉變角色，成為促癌蛋白，促進胃癌的發生發展[23]。Barker等[24]首次通過體外實驗驗證了Lgr5+干細胞驅動胃上皮組織的自我更新的能力，并提出Lgr5蛋白可以作為干細胞研究穩定標記物的論斷。隨后，Yamanoi等[25]通過逆轉錄PCR擴增技術也發現了Lgr5蛋白雙重身份屬性，在蛋白質合成的第一步，即基因轉錄的mRNA水平，Lgr5在胃癌組織中表達即顯著高于正常胃黏膜組織。

胃癌組織中Lgr5蛋白異常升高的程度與患者生存預后密切相關，人們開始將Lgr5蛋白視為胃癌預后的獨立預測因子。Liu等[26]發現，Lgr5+患者中位生存期較Lgr5-患者減少26個月，提示我們Lgr5蛋白高表達狀態預示較低生存率。分析其原因，除了Lgr5蛋白能夠維持胃癌CSC的“干”性導致腫瘤難治難控的特點以外，Lgr5蛋白表達與胃癌的TNM臨床分期密切相關。一項納入257例Ⅰ、Ⅱ期胃癌術后患者的研究中發現，N0~1亞群中Lgr5+患者5年總生存率顯著低于Lgr5-患者(89.4%vs54.4%)，T1~2亞群中，Lgr5+患者5年無病生存率顯著高于Lgr5-患者(94.1%vs0)[27]。

相較于CD133、CD44、上皮細胞黏附分子、ABCG2等其他跨膜蛋白類胃癌相關標記物，Lgr5蛋白具有維持胃癌CSC持續更新的能力，因此Lgr5蛋白被視為突破CSC耐藥困境的新策略靶點[28]。

3.2 結直腸癌 眾多研究發現，通過干擾或敲除等方式調低Lgr5蛋白的表達，可以抑制結直腸腫瘤的干細胞自我更新能力。Gzil等[29]的病理學分析發現，Lgr5蛋白表達程度與結直腸腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期高度相關，即低分化、深度浸潤和晚期分期的結直腸腫瘤中存在Lgr5蛋白高表達。且Lgr5蛋白高表達患者更容易出現淋巴結轉移和遠處器官轉移，其機制主要通過兩種方式實現：(1) Lgr5+腫瘤干細胞可能承擔轉移性腫瘤干細胞的作用，促進腫瘤細胞的播散和轉移；(2) Lgr5蛋白通過誘導上皮細胞 - 間充質轉換過程，促進腫瘤細胞的轉移發生。因此，依據以上兩種作用方式，Lgr5蛋白可以作為判斷結直腸腫瘤預后的重要參考因素。

Liu等[30]研究發現，在直腸腫瘤患者中，Lgr5蛋白高表達組放療有效率低于對照組，而且更容易出現化療藥物的耐藥性，導致腫瘤復發或進展。近年來，Lgr5蛋白高表達導致腫瘤細胞耐藥性成為探究腫瘤細胞耐藥性原因的重要方向。

對分選Lgr5標記后的結腸癌腫瘤細胞系使用10 μg/mL伊立替康藥物3 d，發現腫瘤細胞停止增殖，只有約50%的細胞存活，暫時失去Lgr5標記，且Lgr5 mRNA水平顯著下降。然而，把抗腫瘤藥物處理因素去除后，又可以通過免疫反應檢測到19% ~ 43%的細胞有Lgr5表面標記。用5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑藥物處理，也獲得了相同的結果[31]。以上結果也提示我們Lgr5+CSC在化療治療時可暫時性轉為Lgr5-狀態，以逃脫化療藥物的捕殺；當化療藥物濃度下降或消失時，再由Lgr5-轉為Lgr5+狀態并恢復腫瘤細胞大量快速增殖。因此，如何能夠緊緊錨定Lgr5+CSC，避免脫靶現象，成為藥理學家關注的重點。

4 結語和展望

Lgr5蛋白的廣泛消化道實體腫瘤高表達特點以及與腫瘤生物學活性的高度相關性，顯示出其作為抗癌治療靶點的潛力。通過深入研究基因組編輯技術或源于抗體特異性免疫反應靶向投送藥物的傳遞送系統，達到調控實體腫瘤中Lgr5表達，將成為抗耐藥治療的突圍點[32]。

此外，調控Lgr5在穩態干細胞和CSC中表達的分子機制尚不清楚，如果我們能夠進一步掌握多面的Lgr5復雜調節機制，將可以極大地推動Lgr5靶向治療的進步。雖然該領域已經在干細胞和體外器官培養疾病建模方面取得了巨大的進步，但距離臨床應用仍然很遠。通過將基因組編輯技術與類器官培養相結合，有可能更加真實地模擬疾病發展過程，并跟蹤Lgr5+干細胞在正常生理和癌癥環境中的生物學行為特點。以Lgr5為干細胞標記物和在多信號通路背景下研究Lgr5+干細胞特點，應用于腫瘤疾病建模、耐藥性機制研究、藥物靶向投送系統、動物模型移植等方向，將是未來腫瘤干細胞生物學研究的前景領域和必經途徑。

作者貢獻陳志達：論文書寫，文獻檢索及整理；陳凜：選題指導；郗洪慶：論文校審；課題基金支持。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。