Galectin-9、Cadherin-11在胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征及預后的關系

童小華,王菁菁

1.商洛職業技術學院附屬醫院/商洛國際醫學中心醫院病理科,陜西商洛 726000;2.陜西省安康市中心醫院感控科,陜西安康 725000

胰腺癌是起源于胰腺外分泌腺的消化系統惡性腫瘤,因其極高的惡性程度及病死率,被稱為“癌中之王”。近年來,胰腺癌發病率日益攀升,但隨著診療技術進展,該病生存率并未得到明顯改善[1]。胰腺癌起病隱匿且發展迅速,多數患者就診時已處于中晚期,錯過了根治性手術機會,多以姑息性化療為主[2]。近年來,新輔助治療,如新輔助放化療、分子靶向治療、免疫治療等在胰腺癌治療中應用越來越多,被認為在降低患者腫瘤分期、縮小病灶、減小血管侵犯等方面有積極意義,這也為胰腺癌預后改善帶來了希望[3]。與此同時,探討新的生物標志物以預測胰腺癌預后、指導臨床新輔助治療等也備受關注[4]。半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是一種具有趨化嗜酸性粒細胞功能的β-半乳糖苷結合蛋白,其廣泛表達于多種生物組織中,可參與免疫炎癥反應、細胞聚集和黏附、腫瘤細胞侵襲和轉移等多種生物學行為調節,被認為與惡性腫瘤的發生和發展有關[5]。鈣黏蛋白-11(Cadherin-11)是一種參與細胞與細胞黏附作用的Ⅱ型經典鈣黏蛋白,已有研究發現其可能與腫瘤細胞多種信號通路調節及腫瘤侵襲轉移有關[6]。不過目前關于胰腺癌組織中Galectin-9、Cadherin-11蛋白表達及其臨床意義尚不明確,為此本研究通過免疫組織化學法檢測胰腺癌組織中Galectin-9、Cadherin-11蛋白表達,并分析其與患者臨床病理特征及預后的關系,旨在為胰腺癌的發生和發展機制分析及預后評估等提供新思路,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2021年12月商洛職業技術學院附屬醫院107例胰腺癌患者癌組織及癌旁組織(距癌組織邊緣>2 cm)標本。納入標準:(1)患者均經術后病理檢查證實為胰腺導管腺癌;(2)術前無任何放化療或其他輔助治療;(3)臨床、病歷資料完善;(4)術后均取得預后隨訪。排除標準:(1)腫瘤復發患者;(2)合并其他部位原發性腫瘤患者;(3)患嚴重免疫系統疾病、內分泌疾病患者;(4)缺乏足夠可用于免疫組織化學分析的組織標本。107例患者中男59例,女48例;年齡36～73歲,平均(60.42±8.84)歲;腫瘤部位:胰頭64例,胰尾43例;腫瘤分期[7]:Ⅰ期24例,Ⅱ期38例,Ⅲ期34例,Ⅳ期11例;分化程度:高分化9例,中分化54例,低分化44例;伴淋巴結轉移58例,無淋巴結轉移49例。所有患者術前對腫瘤標本使用均簽署知情同意書。本研究經商洛職業技術學院附屬醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 主要儀器:免疫組織化學抗原修復盒、孵育盒均購自福州邁新生物科技開發公司,顯微鏡及成像系統購自日本奧林巴斯公司。主要試劑:兔抗人Galectin-9單克隆抗體、兔抗人Cadherin-11單克隆抗體均購自美國CST公司;即用型免疫組織化學檢測試劑盒、DAB顯色劑、EDTA抗原修復液均購自福州邁新生物科技開發公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.2免疫組織化學染色步驟 將準備好的石蠟切片常規脫蠟、水化,采用EDTA修復抗原,然后阻斷過氧化氫酶,先加封閉液,然后分別滴加一抗、辣根過氧化物酶標記物二抗孵育,采用DAB顯色后,切片行蘇木素復染5 min,再次梯度乙醇脫水,以中性樹膠封片,晾干,顯微鏡下觀察。以已知陽性標本作為陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3免疫組織化學染色評價標準 完成染色的切片先于低倍鏡下觀察整體染色,尋找合適的視野,再于400倍鏡下選取5個視野計數,各視野≥100個細胞,觀察切片染色強度及染色細胞數。本研究中Galectin-9蛋白以細胞質著色為主,Cadherin-11蛋白以細胞膜著色為主,陽性著色呈棕色或黃色顆粒。(1)染色程度:染色程度可分為無著色、淡黃色、棕黃色、黃褐色,分別計0、1、2、3分;(2)陽性細胞數:陽性細胞數≤5%、6%～25%、26%～50%、>50%分別計0、1、2、3分。染色程度計分×陽性細胞數計分在0～1分為陰性(-),2～3分為弱陽性(+),4或6分為中等陽性(++),9分為強陽性(+++),其中≥2分均視為陽性,否則視為陰性。染色結果由2名具有豐富經驗的病理科醫生通過雙盲閱片進行判斷,結果不一致時協商達成一致。

1.2.4隨訪 患者采用電話和門診隨訪形式,第1年內每個月隨訪1次,其后每2～3個月隨訪1次,隨訪時間截至2021年12月,統計患者總生存期。總生存期定義為自診斷日起至任何原因所致死亡或至隨訪截止時間的時間間隔。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析處理。計數資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗,等級資料比較采用秩和檢驗;采用Kaplan-Meier生存曲線進行生存質量分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1胰腺癌組織與癌旁組織中Galectin-9、Cadherin-11蛋白陽性表達比較 胰腺癌組織中Galectin-9、Cadherin-11蛋白陽性合計表達率均低于癌旁組織,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 胰腺癌組織與癌旁組織中Galectin-9、Cadherin-11蛋白陽性表達比較[n(%)]

2.2不同臨床病理特征癌組織中Galectin-9、Cadherin-11蛋白陽性表達比較 不同腫瘤最大徑、腫瘤分期、淋巴結轉移癌組織中Galectin-9蛋白陽性合計表達率比較,差異均有統計學意義(P<0.05);不同腫瘤最大徑、分化程度、腫瘤分期、淋巴結轉移、脈管浸潤、神經浸潤癌組織中Cadherin-11蛋白陽性合計表達率比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征癌組織中Galectin-9、Cadherin-11蛋白陽性表達比較[n(%)]

2.3Galectin-9、Cadherin-11蛋白表達與預后的關系 隨訪時間截至2021年12月,107例患者死亡71例,繼續生存36例,總生存期3～52個月,平均(20.46±10.60)個月。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示,Galectin-9陽性患者累積生存率為34.0%,與Galectin-9陰性患者的33.3%比較,差異無統計學意義(Log Rankχ2=0.418,P=0.518,見圖1;Cadherin-11陽性患者累積生存率為43.9%,明顯高于Cadherin-11陰性患者的15.6%,差異有統計學意義(Log Rankχ2=10.796,P<0.001),見圖2。

圖1 胰腺癌組織中Galectin-9蛋白表達的生存曲線

圖2 胰腺癌組織中Cadherin-11蛋白表達的生存曲線

3 討 論

胰腺癌病因至今尚未明確,一般認為可能與長期大量吸煙、飲酒、糖尿病、慢性胰腺炎、長期化學物質接觸及遺傳因素等有關[8]。有研究顯示,胰腺癌5年生存率僅為8%左右,早期診斷和治療是改善胰腺癌預后的關鍵,但是因為胰腺癌早期癥狀體征并不典型,并且胰腺位于人體較深的位置,胰腺癌早期很難被發現,臨床上近80%的患者就診時已處于晚期[9]。近年來,隨著胰腺癌基礎研究領域進展,“基礎-臨床”轉化有可能為突破胰腺癌的診療現狀帶來契機[10],其中探討與胰腺癌發生、發展及預后有關的生物標志物是臨床研究的熱點之一。

Galectin-9為重復串聯的半乳糖凝集素,對β-半乳糖苷親和力很高,正常情況下其在肝臟、腎臟、小腸、胸腺等多種組織器官中廣泛分布,可參與機體不同病理生理狀態下的免疫調節[11]。近年來有研究指出,Galectin-9在多種惡性腫瘤中呈低表達,并且與腫瘤分期、預后有關。如CHOI等[12]報道指出,胃癌患者Galectin-9陽性表達者總體病死率較陰性表達者降低,Galectin-9陽性表達可能抑制胃癌腫瘤進展;王輝等[13]報道指出,口腔鱗狀細胞癌組織Galectin-9陽性表達率明顯較口腔扁平苔蘚和正常口腔黏膜組織下降,且與口腔鱗狀細胞癌分化程度、淋巴結轉移有關。當前關于Galectin-9抗腫瘤機制也有一些研究,如Galectin-9可通過減少血管內皮生長因子受體3、胰島素樣生長因子-1受體磷酸化來調節內皮細胞活化,繼而影響腫瘤血管生成[14];Galectin-9可通過結合腫瘤細胞表面多糖,直接發揮凋亡效應,還能通過調節腫瘤免疫來抑制腫瘤發展[15]。有報道認為,Galectin-9可能促進腫瘤發展,如NAKAJIMA等[16]研究指出,腫瘤細胞Galectin-9表達可能通過降低抗腫瘤免疫參與皮膚T淋巴細胞瘤進展。Galectin-9目前在胰腺癌中的報道較少見,本研究發現,胰腺癌組織中Galectin-9蛋白陽性合計表達率較癌旁組織降低,且與腫瘤最大徑、腫瘤分期、淋巴結轉移有關,提示Galectin-9低表達可能與胰腺癌的發生和發展有關,與王武[17]報道相反,這一結果可能受免疫組織化學取材、操作等影響,后期可補充目的基因PCR和蛋白質免疫印跡試驗進一步驗證。本研究結果顯示,Galectin-9表達與胰腺癌患者累積生存率無明顯關系,提示其檢測對胰腺癌預后判斷價值有限。

Cadherin-11是與細胞-細胞黏附作用有關的膜蛋白,于成骨細胞中被發現,被認為與成骨細胞分化有關,可能參與骨發育和維持[18]。近年來有研究發現,Cadherin-11與惡性腫瘤有關,但其在不同類型癌癥中的抑癌或致癌功能報道不一。如YUAN等[19]研究發現,Cadherin-11在結直腸癌中表達下調,其可誘導細胞周期阻滯在G0/G1期和凋亡,并通過影響核因子κB信號通路來抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等過程,被認為是結直腸癌中的一種功能性腫瘤抑制基因;SATRIYO等[20]研究指出,Cadherin-11可通過下調β-連環蛋白,使經典Wnt信號通路失活,從而抑制三陰性乳腺癌干細胞樣表型和腫瘤生長;而WANG等[21]研究發現,胃癌腫瘤組織Cadherin-11呈高表達,且與胃癌進展和不良預后有關。本研究發現,胰腺癌組織中Cadherin-11蛋白陽性合計表達率較癌旁組織降低,且與腫瘤最大徑、分化程度、腫瘤分期、淋巴結轉移、脈管浸潤、神經浸潤有關,提示Cadherin-11低表達可能與胰腺癌的發生和發展有關。不過目前Cadherin-11表達下調與胰腺癌的發生和發展機制并不明確。E-鈣黏蛋白是維持細胞間連接作用的跨膜糖蛋白,其表達缺失可使細胞與細胞及細胞基質間連接能力下降,使細胞發生轉移。既往有研究發現,E-鈣黏蛋白在胰腺癌組織中表達下調,且與胰腺癌發生、轉移有關[22]。有文獻指出,下調Cadherin-11表達后,細胞E-鈣黏蛋白表達也下調,這可使細胞間黏附能力下降,侵襲能力增強[23]。結合之前研究結果,推測Cadherin-11表達降低可能通過下調E-鈣黏蛋白表達參與胰腺癌的發生和發展。本研究還發現,Cadherin-11陽性患者累積生存率高于陰性患者,提示Cadherin-11表達下降可能與胰腺癌不良預后有關。秦雯等[24]報道指出,E-鈣黏蛋白表達下降可能參與胰腺癌的發生和發展,在一定程度上支持本研究結果;但BIRTOLO等[25]研究發現,人類慢性胰腺炎和胰腺癌組織中Cadherin-11表達明顯升高,與胰腺星狀細胞激活和胰腺癌轉移有關,這與本研究結果恰好相反,但其原因未知,后期可補充目的基因PCR和蛋白質免疫印跡試驗進一步驗證。

鑒于Galectin-9、Cadherin-11在不同惡性腫瘤中致癌或抑癌作用報道不一,且本研究結果與同類研究結果并不完全一致,關于Galectin-9、Cadherin-11表達與胰腺癌的關系及其是否可作為胰腺癌預后預測指標仍有待后期多中心、大樣本研究進一步探討。

綜上所述,胰腺癌組織中Galectin-9、Cadherin-11呈低表達,且均與胰腺癌臨床病理特征表現出一定的相關性,尤其是Cadherin-11蛋白,其陽性表達者較陰性表達者累積生存率明顯升高,Cadherin-11檢測在胰腺癌預后預測中展現出潛在的應用價值。