魚腥藻響應溫度脅迫的形態及生理策略

肖湘玥,韓雯睿,于曉涵,肖艷

(1.中國科學院大學,北京 100049;2.中國科學院 重慶綠色智能技術研究院,重慶 400714)

藍藻水華事件在世界范圍內呈現出大范圍、高頻次、高生物量等特征,引起水生生態系統結構和功能的失衡進而對人類健康產生直接或間接的影響[1].全球氣候變化將進一步加劇淡水系統中有害藍藻水華暴發的頻率和危害性[2].溫度升高是氣候變化最顯著的特征,是影響藍藻生理、形態和生長的關鍵因素之一,可直接影響藻細胞內代謝活動的正常進行[3].已有研究表明,溫度對藍藻的光合活性、呼吸速率以及生長速率產生影響[4],同時與參與藍藻生理活動的重要酶活性、膜流動性密切相關[5];溫度對藍藻的影響還包括藻細胞形態、胞內生物大分子的合成、胞外有機物釋放以及信號傳導系統等[6].

全球持續升溫,導致水生系統中藍藻優勢的增強[7].藻類內部功能特性的調節是藍藻得以維持優勢的重要機制[8].這些功能特性包括形態策略、光合作用、營養吸收、運動性、休眠體等[9].藍藻應對溫度的脅迫并擁有廣泛的溫度耐受范圍,與其獨特的生理和形態特性有關[10].魚腥藻在水生態系統中分布廣泛[11-12].有研究報道,魚腥藻和微囊藻可通過調節自身生理、形態特性以適應溫度的變化[4].CHALIFOUR等[6]研究亦發現,隨著溫度的升高,絲狀藍藻形態對溫度變化敏感.目前研究認為,藍藻改變形態策略的機制主要包括兩個方面,一個是細胞分裂生長聚集變大[13],另一個是細胞通過外部多糖包裹而黏附在一起[14].膠被是包裹于藍藻細胞或藻絲或群體外的黏稠狀外層,可作為屏障抵御外界脅迫,是藍藻適應性策略的重要功能性結構.膠被含有多糖或蛋白質,其含量隨溫度升高而增加[15].MORENO等[16]研究發現隨溫度升高,魚腥藻膠被多糖含量顯著升高.AARONSON[17]認為低溫能夠增加碳水化合物細胞配額,可能導致膠被的多糖含量增加.然而,魚腥藻如何調節自身的形態及生理特性以支撐其適應溫度變化的機制仍未明晰,有待深入探索.基于此背景,本研究選取水華藍藻常見優勢屬魚腥藻為研究對象,探討不同溫度對魚腥藻的形態、群體大小及其生理特性的影響,為深入了解在全球氣候變化背景下,藍藻在淡水水體中長期占據優勢的機理提供依據.

1 材料與方法

1.1 藻種及培養條件

魚腥藻FACHB-82 (Anabaenasp. FACHB-82)購于中國科學院淡水藻種庫(1957年7月18日武昌寶積庵華農場水稻田分離得到).中國主要湖庫如太湖、巢湖、滇池和三峽水庫,大部分時間水溫在35 ℃以下,但部分年份盛夏可超過35 ℃[18-21].本課題組前期研究也發現,魚腥藻FACHB-82在35 ℃培養時并未有明顯的脅迫抑制[22],因此本研究設計了10、25、35、40 ℃的溫度梯度進行實驗.藻種常規培養以BG11為基礎培養基,培養溫度(25±1) ℃,光照強度2 000 lx,光暗周期12L∶12D.當魚腥藻培養至對數期,離心后加入新鮮的培養液轉移至250 mL三角瓶中,放在實驗設置的溫度梯度10、25、35、40 ℃下繼續培養,溫度25 ℃為對照組.每天將樣品手動搖勻4次,分別在0、1、2、3、5、7、9 d的同一時間取樣進行后續指標測定.

1.2 葉綠素a和比生長速率測定

取4 mL藻液4 ℃離心(8 000 r/min,5 min),去上清液后加入等體積的體積分數95%乙醇充分重懸,用鋁箔紙包裹后在4 ℃避光提取36 h,后離心(8 000 r/min,4 ℃,5 min)取上清液,以體積分數95%乙醇作參比,分別讀取649 nm、665 nm波長處的吸光度,根據公式:C葉綠素a=13.7A665-5.76A649計算[23].

比生長速率μ根據指數生長期的葉綠素含量得到,計算公式為[24]:

式中,Nn為對數生長期末期第n天藻液的葉綠素a的質量濃度,μg/mL;N1為對數生長期初始葉綠素a的質量濃度,μg/mL;tn、t1為對數生長期培養時間,d-1.

1.3 藻液干重測定

取對數生長期的藻液10 mL,將藻液用GF/F濾膜(Whatman,UK)抽濾,濾膜提前烘干至恒質量并記錄W0(mg),后將濾有藻樣的濾膜置于通過冷凍干燥器(Biocool Lab-1A-50E,China)進行冷凍干燥,直至藻粉冷凍干燥至恒質量,記錄Wt(mg).生物量為X(g/L)按下面公式進行計算:

1.4 光合活性測定

本實驗通過浮游植物熒光分析儀PHYTO-PAM(Walz GmbH,Germany)調制葉綠素熒光測量該參數,將每個平行藻樣2 mL置于黑暗條件下暗適應5 min后測定熒光.葉綠素熒光參數Fv/Fm用于表征PS Ⅱ反應中心光能的最大光化學效率,可反映藻細胞光合活性強弱[25].葉綠素熒光參數按下面公式進行計算:

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm,

式中,Fm和F0表示PS Ⅱ適應黑暗階段的最大和最小熒光值,Fv表示兩者之差.

1.5 形態測量和計算

1.6 膠被和溶解態、胞內多糖的測定

取藻液20 mL,10 000 r/min 離心10 min,經0.22 μm醋酸纖維膜過濾,上清液進行胞外溶解態多糖(soluble exopolysaccharide,SL-EPS)的測定.藻細胞沉淀重懸于等體積0.01 mol/L NaOH溶液中,50 ℃水浴加熱并不斷攪拌10 min,加熱結束后放置于室溫中冷卻,以5 000 r/min在4 ℃下離心10 min,上清液經0.22 μm醋酸纖維膜過濾后進行膠被多糖含量的測定[27],取沉淀物進行胞內多糖含量的測定.采用苯酚-硫酸法測定多糖含量.多糖含量與藻液干質量含量的比值可定義為單位生物量內多糖的含量.

1.7 統計方法

所有實驗設置3個平行,數據用平均值±標準偏差表示.采用Origin 2023方差分析(TukeyHSD)和多重比較進行統計分析,P≤0.05為顯著性差異,P≤0.01為極顯著差異.不同字母表示有顯著差異(P≤0.05),相同字母或無上標英文字母表示無顯著差異,全文圖表同.

2 結 果

2.1 溫度對魚腥藻比生長速率的影響

比生長速率μ值計算的時間t均處在藻的對數生長期(圖1).結果表明,10～35 ℃時,隨著溫度的升高,魚腥藻的比生長速率增加.與對照組25 ℃相比,魚腥藻FACHB-82在10 ℃培養時的比生長速率為0.026 d-1,生長受到了顯著抑制(P<0.05);而在35 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82的比生長速率最高,為0.149 d-1;40 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82的比生長速率次之,為0.133 d-1.

2.2 不同溫度下魚腥藻的光合活性

在低溫10 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82的光合活性在第1天顯著降低,隨后呈現平穩趨勢,Fv/Fm在培養結束時和初始值相比降低了77.98%(圖2).與對照組25 ℃相比,魚腥藻FACHB-82在高溫35 ℃和40 ℃培養時,光合活性都顯著增加,其Fv/Fm值在培養前后分別增加了21.74%和4.36%.總的來說,隨著培養溫度的升高,魚腥藻FACHB-82的光合活性先升高后降低,最佳光合活性溫度為35 ℃.

2.3 不同溫度下魚腥藻形態變化

在9 d的不同溫度培養后,通過比較魚腥藻的群體大小近似球型直徑(equivalent spherical diameter,ESD)表明:魚腥藻FACHB-82群體直徑中位數初始值為321.48 μm.在10 ℃培養后,魚腥藻FACHB-82群體直徑中位數在培養結束時和初始值相比減少52.97%(圖3(a)).在25 ℃條件下處理后,魚腥藻FACHB-82群體直徑中位數在培養前后增加3.33%.在35 ℃條件下處理后,魚腥藻FACHB-82群體直徑中位數在培養前后減少14.85%.在40 ℃條件下處理后,魚腥藻FACHB-82群體直徑中位數在培養前后減少15.05%.如圖3(b),不同溫度培養9 d后,10 ℃魚腥藻群體比表面積顯著大于25 ℃組(P<0.05),35、40 ℃培養組魚腥藻比表面積略大于25 ℃組.

從圖3(c)可以看出,魚腥藻藻絲長度在不同溫度組之間不存在顯著差異(P>0.05).在培養第9天,25 ℃藻絲長度最長,中位數為282.7 μm.10 ℃藻絲長度最短,中位數為221.88 μm.35 ℃培養時絲狀體中位數為251.16 μm.40 ℃培養時絲狀體中位數為247.7 μm.在培養第9天,10、25、35和40 ℃的中位數SV-fialments為1.24 μm-1、1.29 μm-1、1.29 μm-1、1.33 μm-1(圖3(d)).綜上所述,高溫(35 ℃、40 ℃)或低溫(10 ℃),藻絲長度變短.溫度越高,藻絲比表面積傾向于更大.

單細胞長/寬(L/W)是評價溫度對單細胞影響的重要形態指標(圖3(e)).在培養周期中,發現在35 ℃、40 ℃培養時,L/W顯著增加(P<0.05),這表明溫度升高在一定程度上縮小單個藻細胞寬度并延長其長度.10 ℃和25 ℃培養時魚腥藻FACHB-82藻細胞L/W無顯著差異(P>0.05).從圖3(f)可知,在不同溫度下,SV-fialments和SV-cell變化規律相同,在培養第9天,10、25、35和40 ℃的中位數SV-cell為1.29 μm-1、1.47 μm-1、1.43 μm-1、1.48 μm-1.

2.4 不同溫度下魚腥藻溶解態多糖、膠被多糖及胞內多糖變化

培養0～7 d時,各溫度培養的魚腥藻FACHB-82胞內多糖無明顯區別(P>0.05);在培養第9天,40 ℃培養時魚腥藻FACHB-82胞內多糖明顯高于其他各培養溫度組(P<0.05)(圖4(a)).培養0～7 d時,相對于25 ℃處理組,魚腥藻FACHB-82在10 ℃培養時,分泌更多的胞外多糖(溶解態多糖與膠被多糖之和,extracelluar polysaccharide,EPS)(圖4(b)),而在其他高溫條件下,魚腥藻FACHB-82分泌胞外多糖無顯著差異.對于SL-EPS,各溫度培養下的魚腥藻FACHB-82在前7 d分泌的SL-EPS無顯著性差異(P>0.05),而在實驗末期,魚腥藻FACHB-82在40 ℃培養下的SL-EPS顯著高于其他溫度組(P<0.05).對于膠被多糖,10 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82膠被多糖含量顯著增加,且高于25 ℃組(P<0.05);在實驗末期,魚腥藻FACHB-82在25 ℃培養條件下產生最多的膠被多糖,其次是10 ℃組,而隨著溫度進一步升高,魚腥藻FACHB-82產生的膠被多糖含量減少.

對各組分多糖比值分析發現,40 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82的溶解態多糖/膠被多糖的比值顯著大于25 ℃組(P<0.05)(表1).35 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82的溶解態多糖/膠被多糖的比值略大于25 ℃組.表明高溫培養時,魚腥藻FACHB-82合成胞外多糖過程中,傾向于合成更多的SL-EPS以及更少的膠被.在10 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82的SL-EPS/膠被多糖的比值在3～7 d略小于25 ℃組.表明在低溫培養時,魚腥藻FACHB-82在合成胞外多糖過程中,傾向于合成更多的膠被以及更少的SL-EPS.

表1 不同溫度對魚腥藻溶解態多糖與膠被多糖比值,胞外多糖與胞內多糖比值的影響Tab. 1 Effect of the temperature on the ratio of SL-EPS and external layers,the ratio of EPS and total intracellular carbohydrate of Anabaena sp. (Mean±SE, n=3)

在培養2～9 d時,在各培養溫度下,魚腥藻FACHB-82胞外多糖與胞內多糖的比值無顯著變化(P>0.05)(表1).10 ℃培養時,魚腥藻FACHB-82胞外多糖與胞內多糖的比值略高于25 ℃組.在35 ℃、40 ℃培養時,在培養1～5 d,魚腥藻FACHB-82胞外多糖與胞內多糖的比值略高于25 ℃組.在7～9 d,魚腥藻FACHB-82胞外多糖與胞內多糖的比值略低于25 ℃組.

2.5 魚腥藻群體形態和胞外多糖之間的關系

將試驗周期內不同溫度下的魚腥藻的群體大小和膠被多糖以及溶解態多糖進行線性擬合,可以看出魚腥藻在不同培養溫度下其群體大小,膠被多糖含量差異較為明顯.在10 ℃(k=21.15)、25 ℃(k=75.62)、40 ℃(k=36.41)培養時,魚腥藻分泌的膠被多糖含量越高,群體尺寸越大(圖 5a);在10 ℃(k=-4.06)、25 ℃(k=-115.38)、40 ℃(k=-61.94)時,魚腥藻溶解態多糖含量越高,群體尺寸傾向于減小(圖5(b)).而在35 ℃培養條件下,形態和胞外多糖的關系具有與其他溫度條件下相反的趨勢.

3 討 論

溫度是影響浮游植物生理生化過程的重要環境因子.許多研究發現,春季藍藻水華的出現及冬季藍藻水華的消失與藍藻對溫度的響應有關,而夏季和初秋藍藻水華暴發與藍藻在高溫下具有相對較高的生長速率有關[28].通常認為,在一個物種的熱耐受范圍內,生理過程和其他參數(如生長)的速率隨著溫度的升高而增加,直到它們達到最適生長溫度,然后迅速下降[29].比生長速率是直觀反映藻類生長狀況的重要指標.本研究中的魚腥藻FACHB-82在35 ℃時比生長速率達到最大值,在較低溫度(10 ℃)下生長受到明顯抑制.(圖 1).這也與溫度對太湖藍藻生物量影響的研究結果一致[30].付小麗等[31]的研究也獲得了類似的結果.Fv/Fm是PSII的最大光化學量子產率,反映了藻類潛在的最大光合能力,也可以間接反映其生長狀態和生存環境[32].本研究發現,魚腥藻在40 ℃的光合活性并未受到抑制,而在10 ℃下,魚腥藻光合活性受到顯著抑制,這也反映了魚腥藻在高溫下生長速率高,而在低溫下生長速率顯著降低的原因之一.

魚腥藻FACHB-82在高溫40 ℃時細胞的比表面積較大和藻細胞傾向于更長,低溫10 ℃魚腥藻FACHB-82細胞的比表面積較小和藻細胞傾向于更短(圖3(e-f)).雖然魚腥藻在單細胞形態上沒有明顯變化,仍然是橢球形,但細胞長度和寬度的調整引起細胞比表面積的變化.Sv-cell增加有利于獲取營養[33],形態對養分吸收速率的影響主要體現在Sv-cell上.較高的溫度有利于營養物質向藻細胞表面的擴散,促進其生長[34].小細胞的優點之一是促進細胞內運輸,可以更有效地進行擴散作用.因此,吸收外部養分能力的提高可能是高溫40 ℃促進魚腥藻FACHB-82的生長的原因之一.在代謝率降低的條件下,例如在低溫10 ℃下,較大的細胞將更具有優勢,因為它們的光系統不依賴于高代謝率來修復[35].一個藻絲的結構是由單個細胞聯結形成的,通過這種方式,整個藻絲被視為一個單元,共同受環境影響.在藻絲水平上,高溫和低溫,藻絲的平均長度減小,使藻絲分布相對集中(圖 3d).本研究發現,高溫下魚腥藻藻絲較短,細胞較小,魚腥藻保持較高的生長速率.管樂等[4]也發現魚腥藻可能通過調節藻絲的長度和藻細胞大小來維持高溫下較高的生長速率.細胞分裂(主要發生在對數生長期)被報道為藍藻形態的主要驅動因素[13].高溫下魚腥藻較高的生長速率有利于形成較大的群體形態(圖3(b)).

藻細胞連結處主要復合物是肽聚糖和蛋白質[36].因此,魚腥藻絲狀體和細胞的變化可能是營養吸收和生化化合物改變策略的結果.改變生化化合物的分配可能是魚腥藻適應外界環境變化的一種策略[37].在微生物中,代謝調節網絡經常參與對非生物刺激的響應[38].中高溫(25 ℃、35 ℃、40 ℃)組光合作用較強,多糖產量提高(圖2).隨著溫度的增加,魚腥藻的細胞內碳水化合物積累(圖4(a)).碳水化合物的增加主要與光合作用有關[39].在野外調查中發現藻類生物量的碳水化合物最高的時期恰好是藻類生長中最旺盛的時期(夏季),這與溫度呈正相關.積累的多糖在冬季被消耗,以維持正常的生長發育、脂質和蛋白質積累[40].細胞分裂的速度取決于蛋白質和核酸的可用性,25 ℃、35 ℃下,由于藻類具有更快的生長速率,多糖被分解產生高生長速率所需的蛋白質和核酸.當應激水平過高時,藻類體內相應的能量短缺會導致固有的碳水化合物途徑增強,并誘導糖酵解等替代途徑為關鍵代謝過程提供能量和相關的碳骨架[38].低溫10 ℃培養時,溶解態多糖與膠被多糖的比值減小,表明魚腥藻FACHB-82在較低的光合作用提供能量時,優先合成對自身生存有利的膠被(圖4(b)).本課題組前期研究發現藍藻膠被的緩沖作用在溫度波動時可穩定細胞活性,從而改善光合作用和呼吸效率[41].葛紅梅等[37]的研究同樣發現在能量受限時,優先合成膠被.藍藻合成膠被有利于保護藻細胞,隨著溫度的增加,魚腥藻FACHB-82溶解態多糖與膠被多糖的比值增加(表1),魚腥藻EPS結構更松散.SL-EPS與膠被的比值在一定程度上可以反映藍藻群體大小和緊密程度[43].高溫40 ℃培養時,過量的SL-EPS會削弱細胞附著結構,導致細胞松散.本課題組前期研究也發現膠被越松散,包裹范圍大,可能會影響水體與藻細胞間的熱量交換,減緩溫度對藻細胞的沖擊過程[22].此外,魚腥藻分泌膠被多糖越多,群體尺寸越大(圖5).LI等[43]人發現在野外群體大小與膠被水平有關.SATO等[44]也發現在實驗室培養中添加膠被成分會誘導群體形成,而添加SL-EPS不會誘導群體形成.ALLEN等[45]發現Thauerasp.聚集與EPS中的多糖密切相關.這些結果進一步表明藍藻細胞糖分配模式對抵御溫度沖擊有重要作用,且膠被是調節魚腥藻形態策略的關鍵結構.

本研究從藻類生理和形態角度探討了溫度變化與魚腥藻生長的關系,對了解魚腥藻在不同溫度下的適應性策略提供新的視角.當面對溫度脅迫時,魚腥藻減小藻絲和藻細胞的比表面積,以及分泌更多的膠被多糖來抵抗低溫;而在高溫脅迫下,魚腥藻傾向積累更多的胞內多糖和分泌溶解態多糖來抵抗高溫.

4 結 論

(1)溫度升高顯著增加魚腥藻(FACHB-82)的光合活性,促進其生長.

(2)高溫促進魚腥藻(FACHB-82)群體尺寸變大,藻絲變短,具有更大的藻絲和細胞比表面積,低溫條件下變化趨勢相反,且魚腥藻形態調節更多的是依賴膠被物質而不是胞外溶解性多糖.

(3)魚腥藻(FACHB-82)傾向于累積膠被多糖以抵抗低溫脅迫,而在高溫條件下魚腥藻主要以加快生長的方式使群體尺寸變大,且膠被結構變得松散進而可能影響熱傳導以適應高溫環境.