基于肝臟蛋白質組學探討加味丹梔逍遙散的抗抑郁作用及機制

汪保英,李雅靜,田磊,劉輝,白明,栗俞程,許二平

(河南中醫藥大學 a.中醫藥科學院;b.藥學院,鄭州 450046)

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的精神性疾病,其發病機制復雜,涉及系統眾多.目前臨床上的三、四環類,選擇性五羥色胺再攝取抑制劑等抗抑郁藥物起效慢、不良反應多,且對約1/3病人無效[1-2].

抑郁癥屬于中醫“郁證”范疇,郁證的關鍵是肝郁.丹梔逍遙散出自清代薛己之《內科摘要》,具有疏肝解郁,健脾和營,兼清郁熱之功效.加味丹梔逍遙散源于本課題組長期臨床經驗,是在丹梔逍遙散組方基礎上添加石菖蒲、遠志2味中藥,具有疏肝健腦解郁之功效.課題組前期臨床研究表明,加味丹梔逍遙散治療抑郁癥臨床療效顯著[3-4],其抗抑郁作用機制與調節腦內5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺等神經遞質的含量[5-6],改善下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能亢進[7]、調節海馬內鹽皮質激素受體和糖皮質激素受體平衡相關[8].現有的研究較少從“肝郁”角度探討中醫藥的抗抑郁作用機制.基于此,本文采用定量蛋白組學技術系統分析抑郁癥小鼠肝臟蛋白組學水平的變化,揭示加味丹梔逍遙散從肝論治抑郁癥的生物學基礎,為闡釋傳統中醫理論的科學內涵提供理論依據,為研究中藥復方的藥理作用機制提供科學參考.

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

加味丹梔逍遙散由柴胡12 g、當歸10 g、白芍12 g、白術10 g、茯苓10 g、甘草3 g、薄荷6 g、丹皮12 g、梔子12 g、石菖蒲12 g、遠志12 g組成,購自河南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房,經中藥教研室陳隨清教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》(2020年版)規定.

1.2 實驗動物

30只SPF級雄性C57BL/6N小鼠,6～8周齡,體質量(20±2) g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2021-0006.單籠飼養,適應性喂養1周后開始實驗.所有動物實驗經河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準進行(DWLL201903018).

1.3 主要試劑與儀器

試劑SDS、BSA、Tris 購于上海生工,碘乙酰胺、NH3·H2O、二硫蘇糖醇(DTT)、HCOONH4、C18 EmporeTM固相萃取圓盤購于美國Sigma公司,BCA 定量試劑盒購于碧云天生物技術公司,TMT 6/10plex Isobaric mass tag labeling kit購于美國Thermo Fisher Scientific公司,C18 Cartridge購于Waters公司,總膽固醇及總膽汁酸檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所.

Easy nLC 色譜系統、Nano Drop 3000、 Q Exactive plus質譜儀及Multiskcan FC酶標儀購于美國Thermo Fisher公司,Agilent 1260 infinity II HPLC 系統購于美國Agilent公司,電泳儀購于美國BIO-RAD公司,小鼠自主活動儀購于四川泰盟公司.

1.4 實驗方法

1.4.1造模與分組

將小鼠隨機分為正常組10只和刺激組30只,根據WILLNER等[9]的方法稍作調整建立CUMS小鼠模型.刺激組接受CUMS刺激,8周后將其隨機分為模型組、氟西汀組、加味丹梔逍遙散組,每組10只小鼠,連續灌胃給藥4周,加味丹梔逍遙散組給藥劑量31.7 g/kg(等效臨床劑量),氟西汀組給藥劑量10 mg/kg,正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水.除正常組外,給藥期間同時給予CUMS.

1.4.2行為學測試和組織樣本的采集

末次給藥后進行糖水偏好試驗(SPT)和自主活動試驗(LAT).計算蔗糖水偏好率,糖水偏好率=(蔗糖水攝入量/蔗糖水和純水攝入總量),記錄5 min的活動總次數.行為學測試結束后摘眼球取血,分離血清,取小鼠肝臟樣本,液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存待測.

1.4.3蛋白組學測試

蛋白質樣品前處理及TMT標記.取肝組織樣本加入適量SDT裂解液(質量分數4%SDS,100 mmol/L Tris-HCl,pH7.6),采用MP Fastprep-24自動均漿器勻漿(轉子線速度6.0 m/s,30 s,2次),超聲后煮沸15 min,14 000 g離心40 min后,用0.22 μm的過濾器過濾,濾液用BCA法檢測蛋白含量.用過濾器輔助樣品制備方案(filter-aided sample preparation,FASP)酶切蛋白質[10-11].取樣品200 μg先后加入30 μL SDT緩沖液(質量分數4%SDS,100 mmol/L DTT,150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)、200 μL UA緩沖液 (8 mol/L Urea,150 mmol/L Tris-HCl pH 8.5)超濾離心后,加入100 μL碘乙酰胺(IAA)(100 mmol/L IAA in UA buffer),室溫避光反應30 min后洗滌, 4 μg胰蛋白酶消化,37℃放置過夜,收集肽段濾液后脫鹽、定量(OD280).每個樣品取100 μg肽段,按照TMT標記試劑盒(Thermo Fisher公司)說明書進行標記.

High PH RP分級及質譜分析.采用Agilent 1260 infinity II高效液相色譜法對TMT標記的多肽進行分餾、稀釋后,上樣到XBridge Peptide BEH C18柱進行分離,收集餾分、干燥.采用Easy nLC系統分離后用Q Exactive plus質譜儀(Thermo Fisher Scientific)進行質譜分析.

采用Mascot 2.6和Proteome Discoverer 2.1(Thermo Fisher Scientific)軟件對質譜原始數據raw文件進行查庫鑒定及定量分析.設定差異倍數(fold change)>1.2、P<0.05的蛋白質是差異表達蛋白.

1.4.4生信分析

利用Blast2GO[12]對差異蛋白進行GO注釋,利用 KOALA(KEGG orthology and links annotation)軟件[13]對差異蛋白進行KEGG通路注釋,然后進行GO及KEGG富集分析.采用Matplotlib軟件從2個維度對樣本和蛋白質表達量進行分類,并生成層次聚類熱圖.

1.4.5血清總膽固醇及總膽汁酸檢測

按試劑盒說明采用微板法檢測血清總膽固醇及總膽汁酸的含量.

1.4.6統計學方法

采用SPSS 22.0分析數據,使用t檢驗對2組之間的差異進行顯著性評估,使用單因素方差分析(ANOVA)對2組以上的差異進行評估,然后采用Fisher′s LSD進行事后分析.P<0.05被認為是有統計學意義的.

2 結 果

2.1 加味丹梔逍遙散對CUMS小鼠行為學的影響

與正常組比較,模型組糖水偏好率明顯降低(P<0.05),自主活動次數明顯減少(P<0.05).與模型組相比,加味丹梔逍遙散與氟西汀組顯著升高糖水偏好率(P<0.05),且明顯增加小鼠的自主活動次數(P<0.05),見圖1.

2.2 差異表達蛋白分析

使用Proteome Discoverer 2.1(Thermo Scientific)鑒定樣本中所有的蛋白質.模型組和加味丹梔逍遙散組2組中所有蛋白質的火山圖如圖2所示.將差異倍數(FC)≥1.2或≤0.8,且P≤0.05 作為篩選標準,模型組和加味丹梔逍遙散組之間有20個差異表達蛋白,其中11個上調,9個下調(見表1).在附錄圖S1中,模型組和加味丹梔逍遙散組被清楚地分開,且重復性良好.

表1 加味丹梔逍遙散與模型組之間差異表達蛋白列表Tab. 1 List of DEPs between the modified Danzhi Xiaoyao San group and the model group

2.3 差異表達蛋白的生物信息學分析

GO富集分析顯示,差異表達蛋白主要參與循環中免疫球蛋白復合物、多泡體、電壓門控型鉀離子通道復合物的細胞組成,分子功能主要是與免疫球蛋白受體、抗原結合,主要參與吞噬、抗體依賴性細胞毒性等生物過程(附錄圖S2).KEGG通路富集分析顯示,模型組和加味丹梔逍遙散組之間差異表達蛋白主要富集到膽固醇代謝、初級膽汁酸生物合成、糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白的生物合成等途徑(圖3).

2.4 加味丹梔逍遙散對CUMS小鼠總膽固醇及總膽汁酸含量的影響

KEGG富集分析揭示CUMS小鼠差異表達蛋白與膽固醇代謝相關,為驗證這一結果,檢測了血漿中總膽固醇及其代謝主要產物膽汁酸的含量.生化檢測結果顯示,與正常組相比,模型組血漿總膽固醇含量顯著降低(P<0.01),加味丹梔逍遙散給藥后能顯著升高其含量(P<0.05)(圖4(a)).與正常組相比,模型組血漿總膽汁酸含量顯著升高(P<0.05),與模型組相比,加味丹梔逍遙散組膽汁酸含量明顯降低(P<0.01)(圖4(b)).

3 討 論

在郁證發病過程中,肝為起病之源,腦為傳病之所;肝疏泄功能正常,則氣機調暢,氣血和調,心情開朗;肝失疏泄,氣機逆亂,則肝氣郁結,稍加刺激,即抑郁難解.因此,郁證的病變部位在腦,但關鍵病機在肝臟[14-15],故疏肝解郁為郁證的主要治則.

大量臨床研究證實,通過治療肝氣郁結可有效緩解抑郁癥[16-19],而疏肝解郁、肝腦同治抑郁癥的物質基礎目前尚知之甚少.本研究采用蛋白質組學方法觀察了抑郁癥模型小鼠及加味丹梔逍遙散給藥后其肝臟蛋白質譜的變化情況.KEGG通路富集分析發現模型組和加味丹梔逍遙散組小鼠之間差異表達蛋白主要富集到膽固醇代謝及初級膽汁酸形成這些生化代謝途徑.有研究顯示在一些有抑郁癥狀[20-21]和嚴重抑郁癥[22-23]患者中膽固醇含量較低,其代謝終產物膽汁酸可通過激活糖皮質激素受體(GR)來抑制下丘腦分泌促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH),抑制垂體分泌促腎上腺皮質激素(ACTH),從而維持HPA軸的穩態[24-27].另有研究表明抑郁狀態大鼠“腸-肝-腦軸”內存在膽汁酸代謝障礙,膽汁酸受體FXR的水平升高;開心解郁丸可有效促進抑郁癥大鼠的膽汁酸代謝,抑制膽汁酸FXR受體水平[28].靶向代謝組學研究發現抗抑郁藥安郁沛勃膠囊影響初級膽汁酸的生物合成[29],抑郁模型小鼠海馬中膽汁酸受體發生改變[30].本研究發現抑郁癥模型小鼠血液中膽固醇含量降低,而其主要代謝產物總膽汁酸,含量明顯增加.加味丹梔逍遙散給藥后可逆轉上述變化,具體為可上調總膽固醇含量而下調膽汁酸水平.

綜上,研究表明加味丹梔逍遙散的抗抑郁機制可能與肝臟膽固醇代謝、膽汁酸合成相關,也為“肝氣郁結”“肝腦同治”提供了一定的科學依據.至于抑郁癥是如何影響膽固醇及膽汁酸代謝,加味丹梔逍遙散又是從何種途徑調控而發揮抗抑郁作用的,有待進一步研究.

附錄見電子版(DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.03.03.0001).