姜黃素對熱應激條件下蛋雞性腺機能和Sirtuins 基因家族表達的影響

袁翠，林曉駿，陳俊宇，何寶儀，安立龍，吳江

（廣東海洋大學濱海農業學院，廣東 湛江 524088）

高溫環境是制約家禽生產的一個重要因素，高溫可引起家禽的熱應激，導致生長和代謝紊亂、免疫抑制及肉蛋品質下降、死淘率增加、飼料轉化率降低等，嚴重影響家禽的生產性能，給養禽業帶來嚴重的經濟損失[1,2]。而如今伴隨全球溫度升高和高密度集約化養殖而來的家禽熱應激問題日趨嚴峻，尤其是熱帶和亞熱帶地區，家禽熱應激事件愈加頻繁。熱應激（Heat stress，HS）是指機體對高溫環境做出的一系列非特異性生理反應的總和[3]。目前，關于熱應激對家禽生理功能的影響機理以及如何有效緩解熱應激等問題，己經引起國內外學者們的高度重視。

姜黃素（Curcumin，Cur）是一種天然的低分子量植物酸性多酚類化合物，具有廣泛生物活性以及醫用價值，同時可作為色素或食品添加劑用于食品加工，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調血脂、保護神經等多種功效[4]。Sirtuins 是一類功能多樣的去乙酰化酶，活躍程度與NAD＋的水平呈正相關，是代謝過程的重要調節因子。Sirtuins 基因家族在調控線粒體的生物生成和代謝調控過程中具有重要作用[5]。有關研究表明，在熱應激下，Sirtuins 基因家族出現氧化損傷。Sirt1 和Sirt2 位于細胞核和細胞質中，Sirt3、Sirt4 和Sirt5 位于線粒體中，而Sirt6 和Sirt7 只在細胞核中被發現，其成員的生物學功能不盡相同[6]。對其進一步深入研究，不僅提供更多有關細胞生命過程調控的信息，還可為臨床疾病的診斷及治療提供依據。前期研究表明，姜黃素能夠改變13 月齡羅曼粉蛋雞卵巢組織形態結構，并顯著上調Sirt1、Sirt2、Sirt3 基因的表達[7]。而當前姜黃素對熱應激條件下雞性腺中Sirtuins 家族其他成員的表達和調控鮮有研究。

因此，試驗以30 周齡羅曼粉雞為研究對象，研究了姜黃素對熱應激條件下雞卵巢和睪丸器官中Sirtuins 基因家族表達量的影響，為姜黃素和熱應激對Sirtuins 基因家族在性腺的表達和功能的影響提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑有：姜黃素（購自西安金綠生物工程有限公司，≥95%）； Trizol 試劑（購自北京索萊寶科技有限公司）；100 bp DNA Marker[購自生工生物工程（上海）股份有限公司]；PCR mix（康為世紀公司產品）；瓊脂糖（購自北京瑞達恒輝科技發展有限公司）；EB 替代品（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品）；Trizol 總RNA 提取試劑盒【天根生化科技（北京）有限公司產品】。

主要儀器有：PCR 儀（T100 型，伯樂生命醫學產品有限公司）、凝膠成像系統（Tanon1220 型，廣州譽維生物科技儀器有限公司）、三恒電泳儀（DYCP-31DN+DYY-6C 型，北京市六一儀器廠）、實驗室專用超純凈水機（LM-75G-D 型，重慶科迪實驗儀器有限公司）、光學顯微鏡（CX31 型，上海山漢光電科技有限公司）。

1.2 試驗設計及樣品采集

選擇42 只30 周齡、健康、體重相近的羅曼粉蛋雞（購自廣州喜迎珍禽養殖有限公司），公母各半，隨機分為常溫對照組（CK 組）、高溫對照組（HC 組）、高溫處理組（HT 組），每組公雞和母雞各7 只雞。常溫組和高溫組飼喂基礎飼糧，飼糧配方與實驗室前期發表文章相同[8]。高溫處理組參照實驗室前期的研究結果[9]，即在基礎飼糧中添加200 mg/kg 姜黃素。試驗基礎飼糧組成及營養成分見表1，營養標準參考羅曼粉蛋雞管理手冊（https://lohmann-breeders.com）。試驗在2019 年5～6 月進行。常溫組保持溫度在（25±3）℃，高溫組和高溫處理組在常溫的基礎上采用循環高溫，保持每天10:00～16:00 溫度在（32±3）℃，使用除濕機等嚴格控制各組濕度處于65%～80%。試驗第21 天屠宰42 只羅曼粉蛋雞，取出各組卵巢和睪丸組織，存放于-80 ℃冰箱。

表1 基礎飼糧的組成和營養成分 單位：%

1.3 卵巢和睪丸組織切片的制作及HE 染色

將每組的卵巢和睪丸修整為1 cm×1 cm×0.5 cm的組織塊，置于Bouin 氏固定液中固定24 h。組織塊固定后以流水沖洗12 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟，常規石蠟包埋，連續切片，片厚5μ m，展片及攤片，37 ℃溫箱烤干，制得切片；切片脫蠟至蒸餾水浸泡2min；蘇木精染核10 min，1% 鹽酸酒精分化20 s，流動自來水藍化15 min；1%伊紅染細胞質2 min；梯度乙醇脫、切片透明；中性樹膠封固。

1.4 產蛋率及采精量的測定

試驗期間以每組重復為單位，統計3 周各重復的平均產蛋率和采精量。

1.5 總RNA 提取及cDNA 合成

使用Trizol 法提總RNA， 反轉錄合成cDNA，PCR 擴增目的條帶。PCR 體系：PCRMix 1μ L、ddH2O 8.4 μL、引物F 0.3 μL、引物R 0.3 μL、模板1.0 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、52 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸30 s、72 ℃延伸10 min、4 ℃保存。引物信息見表2，由生工生物工程有限公司合成。

表2 PCR引物序列

1.6 基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為100 V。電泳完畢后，取出凝膠在紫外燈下觀察，目的基因存在處顯示出肉眼可辨的熒光條帶。使用凝膠呈像系統拍下凝膠圖片并觀察電泳結果。

1.7 數據分析

使用ImageJ 軟件對各DNA 熒光條帶進行灰度分析，數據整合至Excel2019 軟件，SPSS 26.0軟件采用Duncan 方法進行多重比較顯著性差異，結果以（平均數±標準差）表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 姜黃素對熱應激蛋雞繁殖性能的影響

結果見圖1。由圖1 可知，與常溫對照組（CK組）相比，高溫組（HC 組）雞的產蛋率和采精量明顯下降，差異顯著（P＜0.05），說明高溫環境會導致蛋雞產生熱應激，進而對雞的卵巢和睪丸產生不良影響；從高溫組（HC 組）和高溫處理組（HT 組）對比可知，添加姜黃素后，雞的產蛋率和采精量均顯著增加（P＜0.05），說明姜黃素能在一定程度上緩解高溫熱應激對雞卵巢和睪丸產生的不良影響。

圖1 姜黃素對33周齡熱應激蛋雞繁殖性能的影響

2.2 姜黃素對熱應激蛋雞卵巢和睪丸組織形態的影響

結果見圖2。由圖2 可知，在光學顯微鏡下觀察卵巢和睪丸切片，高溫組（HC 組）和常溫組（CK組）相比，高溫組中（HC 組）卵巢組織結構松散，卵泡細胞明顯減少，形成大量的空白，睪丸組織中曲細精管出現空泡化，細胞的數量明顯減少，且分布紊亂，但高溫處理組（HT 組）與高溫組（HC組）相比，可看出卵泡內容物明顯增多和著色點也有增加。睪丸組織中曲細精管未出現空泡化，且細胞數量明顯增多，但仍少于常溫組中的細胞。

圖2 蛋雞卵巢和睪丸組織切片HE染色圖。標尺=50μm（詳見附錄彩圖）

2.3 姜黃素對熱應激蛋雞卵巢中Sirtuins 基因家族表達

姜黃素對熱應激蛋雞卵巢中Sirtuins 基因家族表達的影響見圖3。由圖3 可知，與常溫對照組（CK組）相比，高溫條件下Sirtuins 基因家族各基因在雞卵巢器官中表達量明顯都比常溫的表達量少，差異顯著（P＜0.05)，說明在高溫條件下，雞發生熱應激會產生不良影響。從高溫對照組（HC 組）和高溫處理組（HT 組）對比可知，Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt5 基因在熱應激條件下使用姜黃素后，在雞卵巢器官中表達量明顯上升，且差異顯著（P＜0.05）；Sirt4、Sirt6、Sirt7 基因在熱應激下使用姜黃素后，在30 周齡雞卵巢器官中表達量與HC 組相比差別不大。說明姜黃素能在一定程度上緩解高溫熱應激對雞卵巢產生的不良影響。

圖3 姜黃素對Sirtuins基因家族在33周齡熱應激蛋雞卵巢部表達量的影響

2.4 姜黃素對熱應激蛋雞睪丸中Sirtuins 基因家族表達的影響

姜黃素對熱應激蛋雞睪丸中Sirtuins 基因家族條件下表達的影響見圖4。由圖4 可知，高溫組（HC組）中的Sirtuins 基因家族表達水平相對于常溫組（CK 組）來說都有所下降，其中以Sirt4、Sirt5和Sirt7 下降幅度較大，與CK 組相比差異顯著（P＜0.05）。說明熱應激會影響雞睪丸中Sirtuin基因家族的表達量，但對于Sirt1 基因表達影響是最小的。從高溫處理組（HT）和高溫組（HC）對比可知，添加了姜黃素的高溫處理組（HT 組），Sirtuins 基因表達量均有上調，且Sirt1、Sirt2、Sirt3 基因的表達量比常溫組（CK）的表達量還要高。與高溫組（HC 組）相比，高溫處理組（HT 組）的Sirt4和Sirt5差異顯著（P＜0.05）。由此可以表明，姜黃素能有效地緩解熱應激對睪丸中Sirtuins 基因家族表達量的影響，尤其是對Sirt4 和Sirt5 的影響更大。

圖4 姜黃素對Sirtuins基因家族在33周齡熱應激蛋雞睪丸部表達量的影響

3 討論

3.1 姜黃素對熱應激蛋雞卵巢及卵巢中Sirtuins基因家族的調節作用

卵巢是雌性動物生產的重要器官，卵巢的重量及卵泡數量反映卵巢發育的情況。熱應激條件下蛋雞卵巢組織卵泡的內容物增多,著色加深,卵泡壁增厚[8]。高文[10]研究發現在高溫環境中蛋雞的產蛋率、采食量和破損蛋率顯著降低，姜黃素能有效緩解蛋雞產蛋率和促進卵泡的發育。趙壯志等[11]的研究表明，飼糧中添加姜黃素可以改善羅曼粉殼蛋雞的卵泡發育。相關研究也表明了姜黃素顯著上調卵巢組織細胞骨架調節和黏著連接、Nod 樣受體信號通路、ErbB 和FoxO 信號通路的相關circRNA 表達譜[12]。Sirtuins 在維持卵巢儲備、調控卵母細胞減數分裂、改善胚胎發育等方面具有重要功能[13]。相關研究表明，Sirt1 基因可緩解卵巢組織中細胞的衰老和凋亡，且抑制氧化凋亡情況下卵巢細胞自噬[14,15]。Sirt2 作為一種高度保守的組蛋白去乙酰化酶，可調控細胞增殖、細胞凋亡及氧化應激等多種生物學過程[16]；Sirt2 的表達可增強顆粒細胞糖酵解速率以改善大鼠卵泡發育[17,18]。Sirt3 在線粒體的適應性反應中起調節作用，包括對代謝程序的重排、提高抗氧化劑的保護作用等[19]。Sirt5 可通過調控Nrf2/HO-1 通路抑制ROS 依賴的DNA 損傷導致卵巢癌順鉑耐藥[20]。

在試驗中，Sirtuins 基因家族各基因在高溫條件下在30 周齡雞卵巢器官中表達水平顯著低于常溫組（CK 組）。添加姜黃素高溫處理組的Sirtuins 基因家族表達水平均高于高溫組，且Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt5 基因表達差異顯著。可見高溫條件能夠抑制蛋雞機體抗氧化和凋亡相關基因表達，對雞機體產生不良反應。而姜黃素能在蛋雞熱應激條件下顯著上調部分基因的表達水平來達到抑制細胞凋亡的效果，從而減少高溫對卵巢產生的不良影響。

3.2 姜黃素對熱應激蛋雞睪丸及睪丸中Sirtuins基因家族的調節作用

精液量和睪丸的組織形態學是反映雄性動物繁殖力的重要指標。大量研究表明熱應激會引起小鼠精子密度和質量損傷[21]。秦芹等[22]人研究發現高溫使雄性大鼠睪丸的生殖腺組織萎縮，生精環境發生改變，阻礙了精子的發生和發育。姜志洋[23]發現添加姜黃素，高溫下睪丸組織曲細精管的空腔狀有所緩解，生精細胞增多，排列地更加密集有序，曲細精管間的間質細胞也明顯增多。李佳濱[24]研究發現姜黃素對甲醛誘導的小鼠睪丸組織損傷具有保護作用。楊金鳳[25]研究表明姜黃素可改善環磷酰胺所致生殖損傷，保護小鼠生殖功能。王志和牛艷峰[26]研究發現，飼糧中添加200 mg/kg 姜黃素能夠顯著提高熱應激蛋雞的抗氧化性能，提高生產性能。相關研究表明，Sirtuins家族在睪丸組織中有高表達，在調控精子發生過程中起重要作用[27]。其中，Sirt4 具有ADP 核糖基轉移酶活性，是一種高度保守的蛋白，且被認為與脂代謝密切相關[28]。Sirt5 被認為能夠有效去除賴氨酸羧基修飾[29]，王利紅等[30]的試驗結果也表明Sirt5 在同為哺乳動物的蘇姜豬各部位廣泛表達。Sirt7 基因的功能主要與各臟器功能細胞的物質能量代謝和分泌功能有關，表達也呈現廣泛性[30-31]。

在試驗中，高溫組的Sirt4、Sirt5、Sirt7 表達水平顯著低于常溫組。添加姜黃素高溫處理組的Sirtuins 基因家族表達水平均高于高溫組，其中處理組的Sirt4 和Sirt5 表達水平與高溫組差異顯著。本試驗結果表明，熱應激條件下睪丸條件損傷可能與代謝及去除賴氨酸羧基修飾相關，結合相關研究成果，姜黃素通過上調Sirt4、Sirt5 的表達水平提高動物在熱應激條件下的代謝效率來降低熱應激對睪丸的損傷。

4 結論

高溫下產生的熱應激反應會不同程度地影響到雞卵巢和睪丸及Sirtuins 基因家族的表達，姜黃素能在一定程度上緩解在熱應激條件下30 周齡雞性腺器官中Sirtuins 基因家族表達量的影響。