種雞場雞毒支原體不同免疫程序抗體消長規(guī)律的研究

張鵬，丁愛君，王懷娜，來慶梅，王海蘭，郭龍宗，李玉燕

（山東益生種畜禽股份有限公司，山東 煙臺 265508）

雞毒支原體病（MG）又稱為雞慢性呼吸道病（CRD），是由雞毒支原體引起的一種傳染性疾病，主要表現(xiàn)為咳嗽、甩鼻、氣管炎和氣囊炎等呼吸道癥狀，雞群可終身帶菌，感染雞群可引起產(chǎn)蛋率下降、受精率和孵化率降低，且可經(jīng)蛋傳播給下一代，影響家禽的健康生長，危害家禽生產(chǎn)及生殖性能。《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定雞毒支原體病屬于二類動物疫病，目前雞場感染雞毒支原體比較普遍，廣泛存在于養(yǎng)雞場環(huán)境中，感染途徑多、凈化難度較大，可引起雞群反復(fù)發(fā)病，是養(yǎng)雞場重點防控的主要禽病之一。

大多數(shù)養(yǎng)雞場通過疫苗免疫防控MG。預(yù)防MG感染的疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗兩種，常用的弱毒疫苗有TS-11、F 株、6/85 株疫苗，滅活疫苗主要有F 株、R 株、S-6 株油乳劑滅活苗等。在種雞飼養(yǎng)過程中要根據(jù)不同的種雞日齡和當(dāng)?shù)亓餍卸局甑念愋瓦x擇合適的疫苗免疫，多數(shù)企業(yè)采用弱毒苗和滅活苗相結(jié)合的免疫程序。 一般雛雞在30～40 日齡滴鼻或點眼弱毒疫苗，在種雞開產(chǎn)前16～19 周齡再免疫一次滅活苗加強免疫，可以起到較好的預(yù)防效果。探索雞群在不同免疫程序產(chǎn)生的抗體高度、抗體維持時間以及疫苗的保護規(guī)律，能夠有效地指導(dǎo)科學(xué)免疫，降本增效、健康養(yǎng)殖。因此，制定合理的免疫程序、選擇適合的疫苗以及毒株種類、跟蹤免疫后抗體高度并建立抗體基線是種雞生產(chǎn)過程中的一項重要工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗對象和免疫程序 本試驗所選試驗雞來自膠東某養(yǎng)殖集團的一個父母代肉種雞場，存欄18 萬套，品種為哈伯德肉種雞，該場有20 個平養(yǎng)雞舍。對父母代肉種雞采用4 種不同的免疫程序進行免疫效果對比試驗，免疫程序見表1。33 日齡，點眼免疫MG 弱毒疫苗，1 羽份/只；118 日齡，頸部皮下注射MG 滅活疫苗，0.5 mL/只。

表1 父母代肉種雞不同試驗對象的免疫程序

1.1.2 試驗試劑 雞敗血支原體ELISA 抗體檢測試劑盒購自荷蘭BiocheK 公司，批號為FS9142，有效期至2024 年4 月3 日。RealPCR 敗血支原體/DNA 檢測混合液，購自IDEXX 公司，批號：44B1045，有效期至2024 年8 月8 日。

1.1.3 試驗儀器 MK3 酶標(biāo)儀（美國ThermoFisher公司）、 洗板機（TECAN 公司）、ABI Q5 熒光定量PCR 儀（QuantStudioTM5 Real-Time PCR Instrument）、移液器、2.5 mL 一次性無菌注射器、一次性無菌植絨棉簽、1.5 mL 無菌離心管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

1.2.1.1 血清樣本的采集 首先，制定詳細的采樣計劃，隨機抽樣，跟蹤檢測MG 抗體。分別在4、7、13、16、19、26、34、42、52 周齡等不同時間點翅靜脈采血，在每棟雞舍以對角線方式隨機挑選30 只雞，一棟雞舍9 個周齡共挑選270 只，一個組（5 棟雞舍）共采血1 350 份，4 個組共采血5 400 份。待自然析出血清后，轉(zhuǎn)移至離心管中-20 ℃凍存，血清樣本禁止反復(fù)凍融。

1.2.1.2 咽喉拭子樣本的采集 在免疫雞毒支原體弱毒疫苗前（33 日齡前）采集咽喉拭子，每棟雞舍內(nèi)以對角線方式隨機采集30 份，一個試驗組5 棟雞舍共采集150 份，檢測MG 病原。咽喉拭子采集使用一次性無菌植絨棉簽在雞只上顎裂旋轉(zhuǎn)3 圈，蘸取分泌物后放入1.5 mL 無菌離心管中，剪去多余的部分、蓋緊離心管的蓋子并做好標(biāo)記、冷藏轉(zhuǎn)運實驗室。

1.2.1.3 氣囊拭子樣本的采集 試驗雞所產(chǎn)的種蛋按照不同免疫程序分組上孵，按照上孵時的分組，在28、34、42、52 周隨機選取與種雞對應(yīng)周齡的啄殼毛蛋30 枚，共收集了480 枚，檢測MG病原。無菌剪開啄殼雛雞的胸腔，用一次性無菌植絨棉簽在肺部及胸氣囊旋轉(zhuǎn)3～5 圈，采集氣囊分泌物后放入1.5 mL 無菌離心管中，剪去棉簽多余的部分，并在離心管上做好標(biāo)記。

1.2.2 ELISA 檢測 支原體抗體檢測方法使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），檢測依據(jù)為禽支原體病檢測技術(shù)規(guī)范SN/T 1224-2012，具體實驗操作按照BiocheK 雞敗血支原體病試劑盒說明書進行。檢測所有試劑使用前需要恢復(fù)至室溫2 h，血清樣本解凍后要充分混勻，標(biāo)記好孔位和樣本信息進行500 倍稀釋。試驗終止后用酶標(biāo)儀讀取每一份樣品的OD405數(shù)值，通過公式S/P 值=（樣品OD 值-陰性對照平均OD 值）/（陽性對照平均OD 值-陰性對照平均OD 值）和Log10 滴度=1.1xLog10 S/P+3.156，計算樣本S/P 值和滴度值，或通過BiocheK 分析軟件進行計算。試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P值≥0.5為陽性或抗體滴度≥668為陽性。

1.2.3 熒光定量PCR 檢測 雞毒支原體病原采用熒光定量PCR (real-time PCR)檢測方法，檢測依據(jù)為禽支原體PCR 檢測技術(shù)NY/T553-2015。熒光定量PCR 具體實驗操作按照IDEXX 雞敗血支原體病試劑盒說明書進行。 根據(jù)試劑盒判定結(jié)果：陽性對照FAM Ct 值＜38，HEX（VIC）＜38；PCR 陰性對照FAM Ct 值無信號，HEX（VIC）≥36；實驗有效。樣本的FAM Ct 值＜38，HEX（VIC）＜38，判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 MG 病原檢測結(jié)果

四組不同免疫程序雞群在整個試驗過程中無MG 野毒感染。檢測結(jié)果見圖1。

圖1 不同免疫程序下的MG病原檢測結(jié)果（詳見附錄彩圖）

2.2 MG 抗體檢測結(jié)果

33 日齡免疫MG 弱毒疫苗，7～16 周監(jiān)測MG抗體監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示：免疫F-36 疫苗的平均抗體滴度在1 800 左右，免疫TS-11 疫苗的平均抗體滴度在1 200 左右，免疫6/85 疫苗的抗體為陰性。不同MG 弱毒苗免疫應(yīng)答的強弱順序為F-36 ＞TS-11 ＞6/85。不同免疫程序下各周齡抗體滴度平均值見表2。

表2 不同免疫程序下各周齡抗體滴度平均值

118 日齡加強免疫一次支原體油苗后，對抗體趨勢產(chǎn)生影響，平均抗體滴度在3 000～6 000 之間，整個飼養(yǎng)過程中場區(qū)環(huán)境野毒載量極低。不同免疫程序下的MG 抗體趨勢詳見圖2。根據(jù)結(jié)果顯示：在無野毒感染的情況下，首免MG 活疫苗F-36 在加強油苗免疫前（4～16 周）的ELISA抗體平均滴度范圍在115～1 817 之間，抗體陽性率可達7%～76%；首免MG 活疫苗6/85、二免油苗在免疫前4～16 周的ELISA 抗體平均滴度范圍在10～559 之間，抗體陽性率全陰；首免MG活疫苗TS-11 在加強油苗免疫前（4～16 周）的ELISA 抗體滴度范圍在7～1 202，抗體陽性率在20%～70%；全程只免疫1 次TS-11 活苗的雞群，全程MG 抗體滴度不高于2 000，抗體陽性率在20%～70%；3 個加強油苗免疫組19～52 周 MG 抗體滴度均低于6 000。

圖2 不同免疫程序下的MG抗體趨勢（詳見附錄彩圖）

3 討論

雞毒支原體弱毒疫苗毒株屬于溫度敏感型疫苗株，不能在高于39 ℃的條件下存活，而雞的體溫約為41.5 ℃，疫苗免疫后的增殖部位被局限在溫度較低的上呼吸道部位刺激粘膜免疫，疫苗株需要在野毒感染前占位，故免疫前2 周和免疫后4 周不可使用對支原體有影響的抗生素。雞毒支原體弱毒疫苗以細胞免疫為主，在評估弱毒疫苗免疫效果時，除了看抗體高度外還應(yīng)考慮抗體轉(zhuǎn)陽率。抗體滴度與保護率不呈正相關(guān)，但呈現(xiàn)降低致病性MG 感染的趨勢。雞毒支原體滅活疫苗以體液免疫為主，高滴度抗體對野毒垂直傳播有一定的抑制作用，因此保證產(chǎn)蛋期雞群的抗體高度和陽性率可以降低垂直傳播風(fēng)險。雞毒支原體的免疫程序多選擇弱毒苗與滅活苗相結(jié)合的方案，提高機體的免疫抗體高度和抗體陽性率，增加機體抵抗MG 水平傳播感染的能力，控制垂直傳播風(fēng)險，維持雞群健康。因此，制定科學(xué)的免疫程序、定期監(jiān)測雞群MG 抗體和MG 野毒病原是科學(xué)防控雞毒支原體病、保障雞群健康的重要環(huán)節(jié)。

有報道表明抗體高度與雞群抗感染不具有相關(guān)性，但對于評估雞群免疫效果、感染狀況、降低雞群垂直傳播仍具有參考價值。根據(jù)本次試驗數(shù)據(jù)可總結(jié)以下幾點：在無野毒感染的情況下，只免疫MG 活疫苗F-36，6～12 周內(nèi)ELISA 平均抗體滴度低于2 000，抗體陽性率可達100%；只免疫MG 活疫苗6/85 后，6～12 周內(nèi)ELISA 抗體陽性率為陰性，如果抗體超過1 000、陽性率在10%～100%則考慮野毒感染；全程只免疫MG 活疫苗TS-11 組，4～52 周ELISA 平均抗體滴度范圍在1 000～2 000，抗體陽性率在30%～70%，如果抗體超過5 000、陽性率高于90%則考慮野毒感染；3 個加強油苗免疫組，19～52 周 MG 抗體均低于6 000，若抗體滴度平均值在8 000 以上，則存在MG 野毒感染。因此，本試驗不同MG 活疫苗和油苗免疫組合建立的抗體基線模型可為MG 野毒感染的評估提供重要參考依據(jù)。