胚胎停育患者絨毛組織染色體檢測分析

李肖華，石子佳，王俊霞，程青青，鄭宗朋，高健

1 河北省人民醫(yī)院生殖遺傳科，石家莊 050051；2 邯鄲市第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)科

胚胎停育是指胚胎或胎兒在沒有外界干預(yù)的情況下死亡后滯留宮腔，在自然流產(chǎn)中的發(fā)生率為2.6%～9.4%，但仍有高達50%的病例未發(fā)現(xiàn)病因［1］。多種因素導(dǎo)致胚胎停育，但最為常見的原因為染色體異常［2］。研究［3］顯示，針對胚胎停育的病因進行分析可為醫(yī)療管理、生殖咨詢和促進患者康復(fù)提供重要信息?；蚪M拷貝數(shù)變異測序（CNV-seq）是一種低深度的全基因組測序，可一次性分析23對染色體非整倍體以及大于100 kb的染色體拷貝數(shù)變異，目的是用來篩選符合患者臨床的染色體變異，具有準(zhǔn)確性及全覆蓋性特點，正在越來越多地應(yīng)用于胎兒篩查、自然流產(chǎn)和臨床未確診的疾病中。本研究采用CNV-seq檢測胚胎停育患者的流產(chǎn)絨毛組織中的染色體，并分析其染色體異常情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年9月—2020年12月河北省人民醫(yī)院收治的胚胎停育患者240 例，年齡26～49 歲，停經(jīng)時間42～84 d；育齡者（預(yù)產(chǎn)期年齡≤35 歲）208 例，高齡者（預(yù)產(chǎn)期年齡>35 歲）32 例；胚胎停育1 次136 例、2 次51 例、3 次33 例、4 次15 例、≥5 次5 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①超過6 周仍無妊娠囊；②妊娠囊≥4 cm，卻無胎芽；③出現(xiàn)胎芽，但未見胎心搏動；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①夫婦雙方中有任意一方有家族遺傳病史；②患者有免疫系統(tǒng)疾?。喝缪ㄐ约膊?、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等；③患者有慢性內(nèi)科病史：如高血壓、心臟病、糖尿病、甲狀腺疾病等；④患者子宮發(fā)育畸形；⑤患者吸煙史。本研究程序符合河北省人民醫(yī)院倫理準(zhǔn)則。所有患者在知情同意的原則下，自愿選擇流產(chǎn)組織基因組拷貝數(shù)變異測序檢測并同意參與本研究，且均已簽署知情同意書。

1.2 流產(chǎn)絨毛組織染色體檢測方法 采用CNV-seq檢測。所有患者均行清宮術(shù)，術(shù)后選取新鮮、顏色透亮的絨毛組織5～10 g，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，冷凍保存，送至北京博奧醫(yī)學(xué)研究所進行檢驗，采用北京博奧醫(yī)學(xué)研究所配套檢測試劑盒及優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)操作，具體過程：使用18個高度多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（STR），包括21號染色體的5個標(biāo)記（D21S1435、D21S11、D21S1437、D21S1411、D21S2039），18 號染色體的4 個標(biāo)記（D18S978、D18S391、D18S535 和D18S386），13 號染色體的4 個標(biāo)記（D13S628、D13S742、D13S634 和 D13S305），以及性染色體的5個標(biāo)記（DXS7423、DXYS267、TAF9、AMEL、SRY）。利用熒光標(biāo)記多重PCR 技術(shù)針對以上STR 位點進行多重PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)ABI 3500 xL 測序儀毛細管電泳檢測出各基因座的等位基因電泳數(shù)據(jù)，將電泳數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件ABI Gene Marker V2.2.0，進行數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判斷。同時取孕婦外周血2～3 mL，行短串聯(lián)重復(fù)序列檢測，以排除母源性污染因素對絨毛染色體的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

240 例份胚胎停育患者流產(chǎn)絨毛組織中，染色體異常181 例份（75.42%）、染色體正常59 例份（24.58%）。181 例份染色體異常絨毛組織中，染色體數(shù)目異常97 例份，其中常染色體三體76 例份、性染色體單體18例份、三倍體3 例份；結(jié)構(gòu)異常120例份；部分標(biāo)本同時出現(xiàn)染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。76 例份常染色體三體中，2-三體6 例份、4-三體3例份、7-三體2例份、8-三體4例份、12-三體1例份、13-三體3 例份、14-三體5 例份、15-三體4 例份、16-三體24 例份、17-三體2 例份、18-三體1 例份、20-三體3 例份、21-三體7 例份、22-三體11 例份；18 例份性染色體單體中，均為X單體。

育齡胚胎停育患者和高齡胚胎停育患者流產(chǎn)絨毛組織中染色體異常分別為157 例份（75.48%）、24例份（75.00%）。育齡者常染色體三體61 例份、性染色體單體16 例份、三倍體3 例份，高齡者分別為15、2、0 例份，兩者常染色體三體例份數(shù)比較，P<0.05。

胚胎停育1次、2次、3次、4次、≥5次患者流產(chǎn)絨毛組織染色體異常例份數(shù)分別為100、46、22、9、4 例份，胚胎停育2 次者分別與胚胎停育3 次、4 次者比較，P均<0.05。胚胎停育1 次、2 次、3 次、4 次、≥5 次患者流產(chǎn)絨毛組織染色體數(shù)目異常例份數(shù)分別為58、26、11、2、0 例份，胚胎停育1 次者、2 次者分別與胚胎停育4 次者比較，P均<0.05。CNV 一共檢測出120 例份，7 號染色體發(fā)生頻次較高，大小在104.17～133.84 Mb；其中18 例份為致病性，發(fā)生頻次較高的染色體依次為7、4、8號染色體；2例份為可能致病，發(fā)生在6、7號染色體；87例份為臨床意義未明，發(fā)生頻次較高的為7、16、17 號染色體；13 例份（13/240，5.42%）為可能良性，發(fā)生頻次較高的為1、4、10、7 號染色體。其中69 例份同時出現(xiàn)兩個或兩個以上位點的CNV。120例份中有32例份具有兩個或更多致病性不同的CNV，此時以致病性最強的作為評價。按片段長度來分析，18 例份致病性變異中，CNV 大小為0.135～133.7 Mb；2 例份可能致病變異的病例中CNV分別為0.207、0.616 Mb；87例份臨床意義未明病例中，CNV大小為104.17 kb～5.8 Mb；13 例份可能良性病例中，CNV 大小在105.82～659.30 kb。

3 討論

胚胎停育是臨床流產(chǎn)常見的一種，妊娠結(jié)局通常為自然流產(chǎn)或稽留流產(chǎn)，導(dǎo)致胚胎停育的原因包括遺傳因素、內(nèi)分泌異常、免疫因素、宮內(nèi)感染等原因，染色體異常是最常見原因［1］。對流產(chǎn)組織進行細胞遺傳學(xué)研究，不僅能夠為生育困難患者提供遺傳指導(dǎo)，還有助于推動流產(chǎn)病理學(xué)的臨床研究［2］。本研究240 例樣本中染色體異?？倷z出率為75.42%，而其他相關(guān)文獻報道的胚胎停育染色體異常率在38.6%～60%［2，4-7］，說明約大半的胚胎停育病例可以在遺傳方面找到病因，根據(jù)具體的染色體異常將得到有效的生育指導(dǎo)。

染色體異常中數(shù)目異常最常見的是常染色體三體［2，8］，本研究與之一致。文獻［2］報道，所有染色體中僅1 號染色體未發(fā)現(xiàn)三體，常染色體中發(fā)生率最高的是16-三體，其次為22-三體、21-三體、15-三體［2，7-10］，本研究中的發(fā)生率與之一致。染色體結(jié)構(gòu)異常包括染色體的易位、倒位及片段的缺失、重復(fù)等，絨毛組織檢測發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常約為44.44%［11］，明確致病性的結(jié)構(gòu)異常檢出率為3.95%～7.14%［3，12-13］，而本研究的檢出率分別為50%、7.5%。相對來說，7 號染色體發(fā)生微重復(fù)微缺失的頻率較高，可能是由于7 號染色體進化不穩(wěn)定性相對較高，在發(fā)育過程中造成了更多的微重復(fù)微缺失，但其致病性還需進一步求證［14］。人類基因組的變異存在多種形式，正是這些變異使人類不斷進化，在物種進化和遺傳多樣性方面具有生物學(xué)重要性［15］，所以出現(xiàn)CNV 并不一定致病。因此CNV-seq對報告的解讀分為致病、可能致病、臨床意義不明、可能良性和良性［16］。這種結(jié)果及其影響的不確定性使臨床醫(yī)生和患者陷入了兩難境地，相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展能夠證實這些CNV 的臨床意義［17-18］。在臨床工作中可對其父母雙方進行CNV 檢測，以確定變異來源于父母遺傳還是新發(fā)變異，對指導(dǎo)再次妊娠及產(chǎn)前診斷具有重要的意義。自然流產(chǎn)中最常見的三體類型與孕婦年齡密切相關(guān)［19］。卵裂期胚胎中非整倍性隨母體年齡增加而增加的發(fā)現(xiàn)已廣為人知［3］。SOLER 等［20］分析了染色體異常和年齡之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)由低齡組到高齡組，染色體異常率由61.3%升高到76.8%。ZHANG 等［21］發(fā)現(xiàn)，與致病相關(guān)的染色體異常的發(fā)生率呈年齡依賴性增加。研究［22］發(fā)現(xiàn)，Turner 綜合征的發(fā)病率隨著年齡的增長而降低，在本研究中同樣如此，同時發(fā)現(xiàn)高齡者常染色體三體率明顯高于育齡者，而染色體結(jié)構(gòu)異常在兩組未見有統(tǒng)計學(xué)差異，即未發(fā)現(xiàn)隨著孕婦年齡增加染色體結(jié)構(gòu)異常有增高的趨勢，這對染色體病發(fā)生機制研究和臨床咨詢都有深遠意義。有研究表明，單次胚胎停育的染色染異常率高于多次出現(xiàn)的胚胎停育［2，23］，因為染色體出現(xiàn)異常為偶然因素，連續(xù)多次出現(xiàn)的可能性不大。但也有文獻報道，單次和多次胚胎停育者染色體異常差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義［24-25］。

總之，胚胎停育患者流產(chǎn)絨毛組織染色體異常率較高，異常類型為染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常，常染色體多數(shù)以三體發(fā)生常見，其中16-三體發(fā)生率最高，其次為22-三體、15-三體、21-三體等；性染色體異常以X單體為常見。育齡和高齡胚胎停育患者流產(chǎn)絨毛組織染色體異常無差異，但不同胚胎停育次數(shù)患者流產(chǎn)絨毛組織染色體異常存在差異。