H2O2 誘導的氧化應激通過線粒體途徑引起RLE-6TN 細胞凋亡

程越峰，李璟，段嵐天，焦宗憲*，陳嘉萌

（蘭州大學基礎醫學院病理學研究所，蘭州 730000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一種由于氣道和/或肺泡異常引起的常見的、可預防的、可治療的疾病，其特征是持續的呼吸道癥狀和氣流受限[1]。COPD 目前是全球三大死亡原因之一，是世界各地慢性發病率和死亡率升高的主要原因；許多人患有這種疾病多年，過早地因其或并發癥死亡[2]。全球范圍內，由于COPD 危險因素和人口老齡化的增加，以及新型冠狀病毒的影響，預計未來數十年COPD 負擔將持續增加。此外，COPD 患者的生活質量將嚴重下降，對患者和社會醫療造成嚴重的負擔[3]。COPD 的發病機制復雜，氧化/抗氧化失衡[4]、細胞凋亡[5]等在COPD 的發生發展中有著重要作用。

氧化應激反應和COPD 的發生發展有著顯著的聯系[6]。香煙煙霧等有害氣體能夠刺激肺實質細胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產生，ROS通過血紅素催化的 Fenton 反應生成活性高、毒性強的羥基自由基（·OH）,引起細胞氧化損傷。H2O2通常在研究氧化損傷相關問題時用于建立細胞氧化損傷模型[7]。肺泡II 型上皮細胞系RLE-6TN 細胞是研究COPD 中氧化應激的合適模型，RLE-6TN 細胞中含有板層小體，可以分泌肺泡表面活性物質，降低肺泡表面張力，維持肺泡結構，同時可以增殖分化為Ⅰ型肺泡上皮細胞，在呼吸系統中起著至關重要的作用。

抗氧化劑在機體處于氧化應激時，可以減輕細胞損傷程度。蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）是一種廣泛存在于西蘭花、芥末等十字花科蔬菜中異硫氰酸酯類化合物，又稱萊菔硫烷，是硫代葡萄糖苷在內源芥子酶作用下水解產生[8]。SFN 具有抗氧化、抑菌、抗炎癥和抗衰老等作用[9]。其具有較高的抗氧化活性和抑制超氧陰離子能力，但對·OH 和O2-的直接清除率并不高[10]，說明蘿卜硫素并不是一種直接的抗氧化劑，其與細胞質中Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）的Cys 殘基反應形成硫酰基加合物，使核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）易位到細胞核從而進一步激活多種抗氧化基因，間接起到抗氧化作用[11]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）是一種硫醇化合物，它能夠通過分解粘蛋白二硫鍵從而降低粘液粘度。在COPD 發生過程中谷胱甘肽的濃度會降低，而NAC 能夠維持谷胱甘肽的濃度使其保持一個較高水平從而發揮抗氧化作用，減少COPD 的加重[12]。

線粒體作為ROS 的主要來源[13]，通過線粒體途徑引起的細胞凋亡在COPD 的發生發展中可能特別重要[14]。線粒體功能一旦損傷，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential, MMP）將快速下降，線粒體電子傳遞解偶聯，ROS 生成增加，導致細胞進一步加劇氧化/抗氧化失衡，迅速誘導細胞凋亡。本實驗采取H2O2對RLE-6TN 細胞進行刺激構建氧化損傷細胞模型，探究氧化應激下的RLE-6TN細胞的凋亡途徑，以及SFN 和NAC 對其氧化損傷的保護作用。

材料與方法

1 材料與試劑

RLR-6TN 細胞（湘雅實驗中心），胎牛血清（美國Hyclone 公司），DMEM 培養基、MTT 試劑、DCFH-DA 探針、Fluo-3AM 探針（Sigma-aldrich 上海貿易有限公司），Hoechst 33258（碧云天生物技術研究所），JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），抗p53、Bcl-2、Bax、β-actin、Caspase-3 抗體（Abcam 公司），蘿卜硫素（美國APExBIO 公司），N-乙酰半胱氨酸（美國Sigma公司）

2 MTT 比色法檢測細胞活力

96 孔板接種細胞，按照藥物刺激時間、藥物濃度分組，每個組最少設置3 個復孔，并設置無藥物的Control 組和無細胞的調零組。按照所設置的藥物刺激時間和刺激濃度作用細胞后，每孔加入10 μL 5 mg/L MTT 溶液，繼續置于培養箱中培養3.5 h 后，每孔加入100 μL 酸化10%SDS，培養箱中過夜后使用BIO-RAD680 型全自動酶標儀檢測每孔OD 值（波長490 nm）。計算細胞生長抑制率，公式為：（Control 組OD 值-加藥組OD 值）/（Control 組OD 值-調零組OD 值）×100%。

3 Hoechst 33258 染色檢測細胞凋亡

6 孔板底平鋪蓋玻片后，接種適宜濃度的細胞懸液。待細胞貼壁且處于狀態良好的生長對數期后，按照乙醇∶冰乙酸為3∶1 的比例配制固定液，每孔加入1 mL 室溫固定10 min。以預冷的PBS 洗滌3 次，每孔加入200 μL Hoechst 33258 試劑，避光放置10～15 min。染料孵育完成后棄掉，再以預冷的PBS洗滌3 次。在載玻片上滴加適量90%甘油（PBS 配制），取出6 孔板中的蓋玻片細胞面朝下蓋于載玻片甘油處后封片。避光，熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍照記錄。

4 線粒體膜電位測定

將各組的細胞懸液0.5 mL 置于流式管后加入0.5 mL 1×JC-1 工作液，輕輕搖晃混勻，37 ℃恒溫孵育20 min。孵育后離心棄上清，1×JC-1 染色緩沖液洗滌細胞3 次，1×JC-1 染色緩沖液重懸后用流式細胞儀進行檢測。

5 細胞內Ca2+水平測定

將各組的細胞懸液置于流式管中，離心去上清，每管細胞沉淀加入1 mL Fluo-3AM 探針（以PBS 稀釋為1 μmol/L）重懸細胞，37 ℃恒溫孵育1h。孵育后離心去上清PBS 洗滌2次，除去多余探針。PBS重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測（激發波長488 nm，發射波長525-530 nm）。

6 細胞內活性氧（ROS）水平測定

將各組的細胞懸液置于流式管中，離心后棄上清，每管加入1 mL DCFH-DA 探針（DMEM 高糖培養基稀釋為10 μmol/L）重懸細胞，置于37 ℃恒溫孵育20 min。孵育結束后，離心后棄上清，DMEM高糖培養基洗滌細胞1 次，再次離心棄上清。以DMEM 高糖培養基重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測（激發波長488 nm，發射波長525 nm）。

7 凋亡相關蛋白水平Western blot 檢測

提取各組細胞蛋白樣本BCA 法定量后變性，進行上樣、電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉后，分別加入對應一抗孵育過夜，用IRDye 800CW 標記的抗兔或抗小鼠IgG 抗體室溫避光孵育1.5 h，經Odyssey雙色紅外激光成像系統成像后，以β-actin 為內參，用ImageJ 軟件對條帶進行灰度值分析。

8 統計學分析

IBM SPSS Statistics 19.0軟件對實驗數據進行統計分析。Probit回歸分析計算IC50值。計量資料采用均數±標準差表示，采用單因素ANOVA分析進行比較，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

結 果

1 H2O2 劑量與時間依賴性抑制RLE-6TN 細胞生長

在96 孔板中培養細胞貼壁后按時間分組（1 h、2 h、4 h、6 h、12 h），每個時間組再按照不同H2O2濃度分組（62.5 μmol/L、125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L）。各組細胞生長抑制率如表1 所示，選擇變化較為穩定的4 h 組。不同濃度H2O2處理細胞4h 后，抑制率變化趨勢如圖1A所示，說明隨著H2O2濃度的增加，細胞生長抑制率明顯增加，即H2O2對細胞的生長抑制呈劑量依賴關系。使用Probit 回歸分析計算IC50 值，選定250 μmol/L H2O2處理4 h 進行后續實驗。

圖1 H2O2 處理4 h 對RLE-6TN 細胞生長抑制的濃度效應關系。與對照組相比，*P ＜0.05，n=6Fig. 1 The concentration-response relationship of H2O2 treatment for 4 h on the growth inhibition of RLE-6TN cells. *P＜0.05, compared with control group; n=6,

表1 H2O2 對RLE-6TN 細胞生長的影響與H2O2 濃度和作用時間的關系Tab. 1 The effect of H2O2 on the growth of RLE-6TN cells and its relationship with concentration and incubation time of H2O2

2 SFN 和NAC 抑制H2O2 誘導的RLE-6TN 細胞凋亡

Hoechst 33258 染色顯示，250 μmol/L H2O2處理4 h 后，RLE-6TN 細胞的細胞核呈現濃染、皺縮、碎裂等凋亡形態，而經SFN 或NAC 處理后，H2O2處理產生的凋亡細胞明顯減少（圖2）。

圖2 SFN 和NAC 對H2O2 誘導的RLE-6TN 細胞凋亡的Hoechst 33258 染色檢測。A, 對照組；B, 過氧化氫損傷組；C, SNF 保護組；D, NAC保護組。比例尺，50 μmFig. 2 Hoechst 33258 staining detection of the effects of SFN and NAC on H2O2-induced apoptosis of RLE-6TN cells. A, control; B, hydrogen peroxide stimulation group; C, co-treatment with SFN; D, co-treatment with NAC. Scale bar, 50 μm

3 SFN 和NAC 抑制H2O2 誘導的RLE-6TN 細胞線粒體膜電位下降

使用JC-1 熒光探針孵育后進行流式細胞檢測分析發現，H2O2能夠增加JC-1 聚合物的解聚，形成單體，產生較多的綠色熒光，綠色熒光細胞占比為19.59%；SFN 或NAC 處理能夠減少JC-1 的解聚，從而產生較多的紅色熒光，綠色熒光細胞占比分別跌落至10.27%和14.58%（圖3），表明SFN 和NAC均能減輕H2O2誘導的RLE-6TN 細胞線粒體膜電位降低。

圖3 SFN 和NAC 對H2O2 誘導的RLE-6TN 細胞線粒體膜電位下降影響的JC-1 流式細胞術分析。紅色，多聚體；綠色，單體Fig. 3 JC-1flow cytometry analysis of the effect of SFN and NAC on decrease in mitochondria membrane potential induced by H2O2. red, polymer; green, monomer

4 SFN 和NAC 抑制H2O2 誘導的RLE-6TN 細胞Ca2+和ROS 水平升高

分別以Fluo-3AM 探針和DCFH-DA 探針孵育RLE-6TN 細胞，然后用流式細胞儀檢測熒光標記細胞比例及熒光強度，反映細胞內Ca2+和ROS 水平。結果顯示，與對照組相比，H2O2處理后熒光細胞所占比例顯著上升；SFN 或者NAC 處理顯著抑制H2O2處理所致的熒光細胞比例增加（圖4A）。對熒光強度分析顯示，H2O2處理和SFN 或NAC 處理后細胞平均熒光強度的變化趨勢與熒光標記細胞比例基本一致，但差異不具有統計學意義（圖4B）。由此表明，H2O2氧化刺激后細胞的Ca2+水平和ROS 水平有顯著提高，具有抗氧化作用的SFN 和NAC 能抑制H2O2氧化刺激所致的Ca2+和ROS 水平升高。

圖4 SFN 和NAC 對H2O2 誘導的RLE-6TN 細胞內Ca2+和ROS 水平增加影響的Fluo-3AM/DCFH-DA 探針-流式細胞術分析。A，熒光標記細胞比例分析；B，細胞平均熒光強度分析；與對照組相比，*P ＜0.05；與H2O2 組相比，#P ＜0.05；n=3Fig. 4 Fluo-3AM/DCFH-DA probe-flow cytometry analysis of the effect of SFN and NAC on increase in levels of Ca2+ and ROS in RLE-6TN cells.A, analysis of the proportion of fluorescent labeled cells; B, analysis of average fluorescence intensity of cells; *P＜0.05, compared with control group;#P＜0.05, compared with H2O2 group; n=3

5 SFN 和NAC 抑制H2O2 誘導的RLE-6TN 細胞內凋亡相關蛋白水平變化

Western blot檢測顯示： H2O2刺激顯著上調p53、BAX 和Caspase-3 水平，降低抗凋亡相關蛋白BCL2水平。SFN 和NAC 抗氧化處理則顯著抑制H2O2刺激所致的p53、BCL2 和Caspase-3 水平上調和BCL2水平下調（圖5）。

討 論

COPD 發病機制的主要驅動機制之一為氧化應激，空氣污染和香煙煙霧中的外源性氧化劑、肺部炎癥和結構細胞產生的內源性ROS，使COPD 患者的肺部氧化應激增加，因此減少氧化應激是一種重要的治療策略[13]。本實驗通過H2O2處理RLE-6TN 細胞建立細胞氧化損傷模型，探究氧化應激下的RLE-6TN 細胞的凋亡途徑，并探究SFN 和NAC 對氧化損傷的保護作用。MTT 試驗表明，H2O2對細胞的生長抑制作用呈劑量依賴關系，且用250 μmol/L H2O2處理4 h 時對細胞生長抑制效果最明顯，且結果最穩定。

Nrf2 是調節抗氧化防御系統的一個重要的因子[15]。Nrf2 直接或間接調控著一些酶的表達，包括谷胱甘肽還原酶、苯醌還原酶-1、超氧化物歧化酶、血紅素加氧酶-1 等。蘿卜硫素作為一種Nrf2 激活劑，在氧化應激時，其可能通過激活Nrf2/ARE 信號通路對細胞起到保護作用[13]。NAC 作為一種硫醇抗氧化劑，可能減輕COPD 的急性加重。其能夠增加谷胱甘肽的濃度，從而起到抗氧化作用。一項大型研究（超過1000 例中國COPD 患者）使用較高劑量NAC（600 mg，每日兩次）可使COPD 急性加重患者數量減少約52%[16]。Hoechst 33258 染色結果表明，經過H2O2刺激后，細胞核呈現濃染、皺縮、碎裂等凋亡形態，而經SFN 或NAC 抗氧化保護作用后，細胞凋亡改變明顯減少。說明NAC 和SFN 能夠有效保護氧化應激狀態下的細胞使其免于凋亡。

細胞凋亡早期的一個標志性事件是線粒體膜電位的下降[17]。在本研究中，H2O2刺激后增加JC-1聚合物的解聚，形成了較多的單體，產生了較多的綠色熒光，說明在氧化應激過程中，線粒體功能受損；而SFN 或NAC 的抗氧化保護作用后，減少JC-1 的解聚，使得大部分JC-1 以復合物的形式存在于細胞線粒體基質中，產生了較多的紅色熒光，說明了SFN 和NAC 能夠改善線粒體功能。

研究發現細胞氧化應激時會產生大量的 ROS，細胞功能遭到破壞，多種抗氧化酶的活性降低，DNA、脂質和蛋白質等發生功能障礙，誘導細胞凋亡[18]。而Ca2+能夠通過促進線粒體ROS 的生成，加速細胞凋亡[19]。在本研究中，H2O2刺激后的細胞，Ca2+水平和ROS 水平有顯著提高，經SFN 或者NAC抗氧化保護后，細胞的Ca2+水平和ROS 水平有顯著回落。

p53 是一種多功能蛋白，在決定細胞命運以及響應細胞應激方面發揮著許多作用[20]。研究證明，在應激狀態下，p53 蛋白能夠激活促凋亡基因（Bax，Apaf-1，Noxa）的表達，以及抑制抗凋亡基因（BCL2家族）的表達[21]。BCL2 可阻止細胞色素C 等凋亡形成因子從線粒體中釋放出來，具有抗凋亡作用，而BAX 與p53 蛋白一起被轉運到線粒體中，線粒體上的電壓依賴性離子通道可與其相互作用，介導細胞色素C 的釋放[21]。Caspase-3 是介導細胞凋亡的關鍵蛋白酶。在本研究中，在蛋白水平上，H2O2的刺激增加p53、BAX 和Caspase-3 的表達，而在SFN和NAC 抗氧化保護后，p53、BAX 和Caspase-3 蛋白表達水平降低；H2O2的刺激降低抗凋亡相關蛋白BCL2 的表達，而在SFN 和NAC 抗氧化保護后，BCL2 的表達有所上升。以上結果提示RLE-6TN 細胞在氧化應激下存在線粒體途徑引起的細胞凋亡，而SFN 和NAC 可使細胞抗氧化基因表達增加，從而緩解氧化應激，減少細胞凋亡。

綜上，H2O2對RLE-6TN 細胞的生存抑制呈現劑量依賴關系，它能夠引起MMP 降低、細胞內Ca2+和ROS 水平升高，這說明氧化應激造成了線粒體的功能受損，而SFN 和NAC 能夠緩解上述改變，說明其具有抗氧化保護作用。H2O2氧化刺激后p53、BAX、Caspase-3 蛋白表達升高且BCL2 蛋白表達降低表明其通過線粒體途徑介導RLE-6TN 細胞發生凋亡性損傷。