SIRT3 通過調控脂質代謝重編程參與哈薩克族食管鱗癌的發生發展

劉瑞雪，孫清超，張力為*

（新疆維吾爾自治區新疆醫科大學第一附屬醫院胸外科，烏魯木齊 830054）

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是世界范圍內最常見的人類惡性腫瘤之一，具有較高的發病率和死亡率，70%以上的ESCC 患者被診斷時已經是中晚期。放化療是晚期ESCC 患者的標準治療方案，然而ESCC 患者的5 年生存率仍較低[1]。新疆地區哈薩克族食管癌發病率高，中晚期患者較多，死亡率高，淋巴結轉移是導致患者預后差和死亡的重要原因，被列為新疆特高發腫瘤之一[2]。惡性腫瘤的轉移機制非常復雜，包括維持增殖信號、誘導血管生成、逃避免疫監視、能量代謝的重新編程、腫瘤微環境創建等[3]。因此，闡明哈薩克族食管癌侵襲及轉移的機制，并通過調控抑制食管癌的侵襲和轉移，是新疆地區腫瘤基礎研究和臨床工作中亟待解決的科學難題。

沉默信息調節因子2 相關酶3（sirtuin3, SIRT3）主要存在與線粒體基質中，通過乙酰化線粒體代謝關鍵酶而影響線粒體代謝和功能，調節脂肪酸、氨基酸和酮體進入TCA 循環，協調線粒體內復雜的代謝，維持能量代謝穩定，是線粒體內主要的能量感受器，線粒體代謝在癌細胞增殖、生存和轉移中起著至關重要的作用[4]。SIRT3 在不同癌癥中表現出促進和抑制作用，其通過調控線粒體和細胞內信號通路的相互作用發揮獨特的功能，即使同一種腫瘤也表現出相反的作用，具有細胞和腫瘤類型的特異性[5]。但是，關于目前SIRT3 在ESCC 當中的研究均不太深入，同時，針對新疆哈薩克族ESCC 患者這一高發人群，SIRT3 在其中扮演什么角色，我們不得而知。

本研究評估SIRT3 在新疆哈薩克族ESCC 中的表達及與臨床病理特征和預后的關系，同時通過超高效液相色譜質譜聯動技術，確定SIRT3 可能通過介導脂質代謝重編程調控哈薩克族ESCC 進展。本研究納入的哈薩克族ESCC 患者術后定期到我院隨訪，并記錄患者詳細資料。

材料和方法

1 食管鱗癌臨床組織標本及細胞

收集2010 年1 月至2018 年12 月期間在本院進行手術的65 例哈薩克族ESCC 組織及配對的癌旁正常組織標本。本研究獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（K202304-10），并得到每位患者手簽的知情同意書。食管鱗癌細胞（KYSE150、TE-1）和正常食管上皮細胞(SHEE、HEEC)均購自中國武漢普諾賽生物科技有限公司。細胞均培育在加有雙抗（青霉素、鏈霉素）含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中，細胞孵育在37℃、5%CO2、濕度在90% 的培養箱中。

2 主要試劑與儀器

胎牛血清為上海睿鉑賽生物科技公司產品；RPMI-1640 培養液購自美國海克隆公司；青霉素和鏈霉素、0.25%EDTA 胰酶消化液均從上海碧云天生物技術公司購買；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液購自北京索萊寶公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、miScript SYBR Green PCR Kit 均購自中國北京Takara 公司；RNA 提取試劑Trizol 購自Invitrogen 公司；兔抗 SIRT3、CPT1 單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗ACC1 單克隆抗體購自德國CST 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物公司；SIRT3 和GAPDH 引物在上海生工生物科技有限公司合成。

3 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測ESCC 組織中SIRT3 的表達水平

采用 Trizol 裂解ESCC 及配對癌旁正常組織，用氯仿和異丙醇提取總RNA，分光光度計測定其純度。以提取的 RNA 為模板，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，得到的 cDNA 為模板，在實時定量 PCR 儀（Thermo, 7500 ）上進行 PCR 擴增。PCR 擴增反應體積為 20μl，反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃34 s，40 個循環；所有步驟均是按照試劑盒說明書進行的。以GAPDH 為內參，用2-ΔΔCt 方法計算mRNA 水平的相對變化。所有的測量均重復3 次。

4 免疫組織化學法檢測ESCC組織中的SIRT3的表達水平

石蠟組織切片常規60 ℃烤片45 min，依次梯度二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。檸檬酸鹽修復緩沖液中高火修復組織15 min，冷卻，PBS 洗3 變，每次5 分鐘。含3% H2O2內源性過氧化物酶阻斷劑去除酶活性，孵育10～15 min。一抗SIRT3（1 ∶200）4℃孵育避光過夜；PBS 沖洗，山羊抗兔 IgG 室溫孵育1 h；PBS 沖洗3 次。DAB 呈色、脫水、透明、封片。

5 免疫組織化學結果分析

經過兩位病理科副主任醫師評分染色情況。根據染色強度和分布評估染色程度。每一張圖取5個視野，組織染色強度分為4 個等級，0 分是未著色，1分淺棕色，2 分，棕色，3 分深棕色。染色分布也分3 各等級，0 分：≤25 %；1 分：≤50 %，＞25 %；2分：≤75 %，＞50 %；3 分＞75 %。結果按照陽性細胞百分比評分×染色強度評分，3 ～8 的分被認為高表達，0 ～2 分被認為低表達。

6 細胞培養和慢病毒感染

食管癌細胞（KYSE150、TE-1）和正常食管上皮細胞（SHEE、HEEC）均在Roswell Park Memorial Institute （RPMI）1640 培養基中培養，在37 °C 充滿5 % CO2的培養箱中保持，以80 %的密度常規傳代。培養基中添加10%胎牛血清(FBS)和100 U/mL的青霉素和鏈霉素(BI, Cromwell, CT, USA)。選擇生長狀態良好和匯合度80%～90%細胞進行后續實驗。將KYSE150 細胞以 1×106個/孔的密度接種到6 孔培養板中，觀察到細胞融合達到 30% ～ 50 % 時，進行慢病毒感染。SIRT3慢病毒包裝的干擾載體的合成由上海漢恒科技有限公司完成。shRNA 靶序列如下：

shRNA-SIRT3-1，GTGGGTGCTTCAAGTGTTGTT；shRNA-SIRT3-2，CCCAACGTCACTCACTACTTT;shRNA-SIRT3-3，GCGGCTCTACACGCAGAACAT。shRNA-NC 序列：TTCTCCGAACGTGTCACGTAA。根據制造商的指南，在37 °C 下用6 μg/mL Polybrene混合物進行感染并增強72 h。 然后取出培養液，換上含10%胎牛血清的培養基。連續培養6 ～8 d，2 mg/mL 嘌呤霉素篩選。

7 Western Bolt 檢測食管鱗癌及正常食管上皮細胞中SIRT3 蛋白表達水平

收集細胞并用中國上海碧云天公司的Western蛋白裂解液冰上裂解并提取蛋白。接著用索萊寶的BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，再將蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），將凝膠在電轉夜中轉到0.45 μm 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。TBST 洗膜3 次，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，SIRT3 抗體（1 ∶1000）、兔抗β-action（1 ∶2000）4 ℃孵育過夜。用 ECL 化學發光試劑可視化蛋白條帶。通過ImageJ 軟件分析蛋白條帶。以目的蛋白條帶的灰度值和內參蛋白條帶灰度值的比值大小計算相對蛋白質表達水平, 所有測試均重復3 次。

8 基于UPLC-MS/MS 方法分析SIRT3 敲低對ESCC 細胞脂質代謝的影響

收集shRNA-SIRT3-1 和shRNA-NC 組細胞，除去細胞培養基，迅速用預冷的 PBS 溶液清洗細胞，清洗兩次。除去 PBS 溶液，加入胰酶，消化至部分細胞呈球狀；然后加入培養基，輕輕晃動，使培養基浸潤細胞終止消化，吸出剩余培養基；加入 PBS吹打，懸浮細胞；快速計數，取 1×107的細胞。轉子-20 ℃預冷,在 4 ℃，2500 g 條件下離心 5 min。去除上清，迅速放入液氮速凍30 s，-80 ℃攝氏度保存。冷凍于干冰中寄送到上海阿趣生物科技有限公司，用超高速液相色譜質譜技術（UPLC-MS/MS）分析。用VIP ＞1 和P＜0.05 的代謝物被認為是變化顯著的代謝物。

9 統計分析

采用SPSS22.0 軟件、GraphPad prism9.3.1 軟件進行統計分析。本研究中計數資料組間比較采用 χ2檢驗，計量資料組間比較采用方差分析，SIRT3 表達與臨床資料的相關性分析采用 Pearson 或Fisher 精確概率法分析。采用Cox 比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。采用 Kaplan-Meier 法進行生存率分析并繪制生存曲線。采用 LC-MS 軟件進行峰對齊、保留時間校正及峰面積校正，采用 LipidSearch軟件鑒定脂質代謝產物。對于所有的分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 哈薩克族食管鱗狀細胞癌組織高表達SIRT3

qRT-PCR 與Western blot 檢測顯示： SIRT3 在ESCC 中的mRNA 表達水平（圖1A）和蛋白表達水平（圖1B、C）明顯高于癌旁正常組織。免疫組織化學方法染色顯示，SIRT3 主要在細胞質中表達，部分細胞核也呈現出棕黃色顆粒樣表達（圖1D）；卡方檢驗表明，SIRT3 在ESCC 中的高表達（51/65，79%）明顯高于癌旁正常組織（20/65，31%）（表1）。

表1 SIRT3 在食管鱗癌中的表達與臨床病理參數之間的關系Tab. 1 Relationship between SIRT3 expression and clinicopathological parameters in ESCC

圖1 哈薩克族食管鱗狀細胞癌組織中SIRT3 表達水平的qRT-PCR、Western blot 和免疫組織化學檢測；A，SIRT3 mRNA 水平的qRT-PCR 檢測結果（n=65）；B，SIRT3 蛋白水平的Western blot 檢測結果與統計學分析（n=8）；B，SIRT3 蛋白水平的免疫組織化學檢測（比例尺，200 μm）；T，癌組織；PT，癌旁組織；*P＜0.01Fig. 2 Detection of SIRT3 expression levels in Kazakh esophageal squamous cell carcinoma tissues by qRT-PCR, Western blot, and immunohistochemistry; A, qRT-PCR results for SIRT3 mRNA levels (n=65); B, Western blot results and statistical analysis for SIRT3 protein levels (n=8); C, immunohistochemical detection of SIRT3 protein levels (scale bar, 200 μm); T, tumor tissue; PT, peritumoral tissue. *P＜0.01

2 SIRT3 的表達與哈薩克族ESCC 的分化程度、淋巴結轉移相關

相較癌旁正常組織，SIRT3 在腫瘤組織中高表達。SIRT3 表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移顯著相關，而與患者年齡、性別、腫瘤 T 分期及TNM 分期之間無關（表1）。

3 影響哈薩克族ESCC 預后的單因素和多因素COX 回歸分析

單因素COX 回歸分析顯示分化程度、淋巴結轉移和SIRT3 高表達是影響哈薩克族ESCC 患者預后的危險因素，多因素COX 回歸分析顯示SIRT3 高表達是哈薩克族食管鱗癌獨立危險因素（表2）。綜合考慮，SIRT3 的表達與哈薩克族食管鱗癌的發生和進展相關。

表2 生存期預后因素的單因素分析和多因素分析Tab. 2 Univariate analysis and multivariate analysis of prognostic factors for survival

4 哈薩克族ESCC 組織中SIRT3 表達水平與預后的關系

SIRT3 在哈薩克族ESCC 組織中的表達與ESCC患者預后之間的相關性采用Kaplan-Meier 生存分析了解。ESCC 組織中SIRT3 的表達與總體預后相關（圖2）。

圖2 SIRT3 在哈薩克族食管鱗癌患者的預后K-M 生存曲線Fig. 2 Prognosis K-M survival curve of SIRT3 in Kazakh patients with ESCC

5 SIRT3 對ESCC 細胞脂質代謝的影響

Western blot 評估了ESCC 細胞系KYSE150、TE-1 和食管正常細胞系SHEE、HEEC 中SIRT3 蛋白表達水平。相較正常食管上皮細胞，SIRT3 在ESCC細胞中高表達，且SIRT3 在KYSE150 中的表達高于TE-1（圖3）。隨后，我們使用慢病毒感染方式穩定敲低KYSE150 細胞中SIRT3 基因，shRNA-SIRT3-1 組（sh1）明顯敲低（圖4）。為了識別SIRT3 在ESCC細胞脂質代謝中的角色，我們收集shRNA-SIRT3-1和shRNA-NC 組細胞，通過UPLC-MS/MS 進行脂質代謝組學分析。篩選出VIP 值＞1 及P＜0.05 的脂質類差異性代謝物13 個（表3）。

表3 兩組差異性脂質生物標志物結果Tab. 3 The results of differential lipid biomarkers in two groups

圖3 食管癌細胞和食管正常細胞中SIRT3 表達水平檢測。A，SIRT3表達水平的代表性Western blot 檢測結果；B，SIRT3 表達水平的統計學分析（*P＜0.01）Fig.3 Detection of SIRT3 expression levels in esophageal cancer cells and normal esophageal cells. A, representative Western blot results for SIRT3 expression levels; B, statistical analysis of SIRT3 expression levels(*P＜0.01)

圖4 RNA 干擾慢病毒感染KYSE150 細胞后72 h 轉染效率檢測。A，SIRT3 表達水平的代表性Western blot 檢測結果；B，SIRT3 表達水平的統計學分析（*P＜0.01）Fig.4 Detection of transfection efficiency of KYSE150 cells infected with RNA interference lentivirus at 72 h. A, representative Western blot results for SIRT3 expression levels; B, statistical analysis of SIRT3 expression levels (*P＜0.01)

討 論

SIRT3在人體內以兩種形式存在，一種是全長約44 kDa 的蛋白質，存在于細胞核中，無活性，另一種是細胞遭受應激時，SIRT3 會轉移到線粒體基質中，被線粒體基質肽酶（MPP）激活，變成28 kDa的活性形式[6]。目前，大部分研究支持，SIRT3 存在于線粒體中，但也有部分研究報道，SIRT3 仍存在與細胞核中[7]。本研究免疫組織化學結果提示，SIRT3在食管鱗癌組織細胞核中有少量表達，說明SIRT3可能在細胞質與核之間可以自我調節。

目前研究表明，線粒體中的SIRT3 主要發揮去乙酰化功能，涉及細胞的氧化磷酸化、糖代謝、脂代謝、ROS、UPRmt、TCA 循環、電子傳遞鏈（ETC）、自噬等[8]。SIRT3 參與多種疾病的發病機制，包括癌癥、糖尿病、神經退行性變、心臟肥厚和肝臟脂肪變性[9]。在腫瘤的研究中發現，SIRT3 扮演著抑癌和促癌雙重角色。例如，在乳腺癌的研究中指出，SIRT3 高表達與淋巴結轉移、TNM 分級和腫瘤大小正相關，SIRT3 表達越高，乳腺癌患者預后越差[10]。相反，也有報道指出SIRT3 在乳腺癌中低表達發揮抑癌作用、主要表現在增殖和轉移方面[11]。在肺癌的研究中，SIRT3 可以通過去乙酰化一種調控NAD（NADP）生物合成的關鍵酶：煙酰胺腺苷轉移酶，使線粒體功能增強，促進細胞增殖[12]。同樣，2020 年有研究指出，SIRT3 去乙酰化p53 Mt，降低p53 表達，誘導小細胞肺癌的凋亡，表明SIRT3在肺癌中發揮抑癌作用[13]。在宮頸癌、頭頸癌、前列腺癌、胃癌和結腸癌中均報道有雙重作用，而在肝癌、卵巢癌中僅發揮抑癌作用，在黑色素瘤、膀胱癌中發揮促癌作用[14]。在本研究中指出，SIRT3在食管鱗癌中高表達，且與較短五年生存率有關。同時，SIRT3 的高表達與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移相關。

隨著腫瘤脂質代謝組學研究的不斷深入，有報道SIRT3 也參與腫瘤脂代謝而發揮促癌作用。比如，在宮頸癌的研究中，SIRT3 在線粒體中高表達，通過ACC1 的去乙酰化，促進調控脂肪酸的合成途徑，起到促癌作用[15]。也有研究指出，SIRT3 高表達，上調長鏈脂酰輔酶脫氫酶（LCAD）的活性，調控脂肪酸氧化，促進腫瘤進展[16]。而SIRT3 在食管癌脂代謝中的作用尚不清楚。所以本研究將SIRT3基因敲低后通過UPLC-MS/MS 方法進行脂質組學分析，發現SIRT3敲低后引起13 種脂質代謝物的下調，分別是神經酰胺、二酰基甘油、三酰基甘油、己糖神經酰胺、磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺；Cer 作為第二信使分子，是神經鞘磷脂酶催化反應的產物，神經酰胺膜水平的增加可誘導線粒體釋放細胞色素C，從而激活細胞凋亡通路[17]。一些新的癌癥治療策略旨在過表達神經酰胺生物合成途徑關鍵酶，導致程序化癌細胞死亡[18]。先前的一項ESCC 研究中發現，兩種二氫神經酰胺Cer(d18∶0/24∶0)和Cer(d18∶0/24∶1)在轉移性ESCC 中增加，Cer(d18∶0/24∶0)和Cer(d18∶0/24∶1)在小鼠實驗轉移模型中抑制轉移灶的形成[19]。因此，神經酰胺可能是一種有希望干預ESCC轉移的藥物。有研究指出，磷脂是細胞膜結構的重要組成部分，磷脂酰膽堿（PC）和磷脂酰乙醇胺(PE)是構成細胞膜大部分的兩種磷脂，雙層磷脂的形成可以作為癌癥治療靶點[20]。比如在結腸癌的研究中，PC 在結直腸癌中普遍升高，但PC(16∶0/16∶1)在更晚期的結腸癌中升高[21]。在乳腺癌的研究中指出，磷酸乙醇胺轉移酶2 可以介導到PE 的上調，從而促進腫瘤進展[22]。

目前，SIRT3 在食管癌中的研究較少，2013 年，有研究報道，SIRT3 在食管癌中高表達，其表達水平和患者較短生存期有關[23]，這和本研究結果一致。鑒于SIRT3 在食管癌中的作用機制尚不十分清楚，同時新疆哈薩克族又是食管鱗癌的高發民族。其具體作用機制值得我們進一步深究。