基于多指標綜合評價法優化通腦康方傳統制備工藝研究*

付 蓉 王萬林 董細姿 程金生 董歷華

補陽還五湯是清代名醫王清任《醫林改錯·癱痿論》中的經典名方,由黃芪、當歸、赤芍、地龍、紅花、川芎、桃仁7味藥物組成,具有補氣活血,祛瘀通絡之功效[1],臨床主治氣虛血瘀所致的中風,癥見半身不遂、口眼歪斜、言語謇澀等[2]。現代研究表明,其藥理學作用涉及促進血管神經再生,抑制血小板因子活性、抗纖維化及降低炎癥因子含量等[3],在治療腦卒中方面具有保護神經功能,改善腦損傷及抗自由基氧化的作用[4]。而樂平市中醫醫院王萬林主任中醫師經過多年大量的臨床運用發現,將補陽還五湯加減化裁成通腦康方在用于缺血性腦卒中的療效上優于補陽還五湯,且不良反應發生率低,更符合當今中風患者痰瘀夾雜的證型特點。全方共由黃芪、水蛭、法半夏、茯苓等10味中藥組成,具有益氣除濕、活血通絡的功效,用于中風之氣虛痰瘀互阻證。

通腦康原方往往入煎劑或以飲片全粉制備水泛丸應用,存在口服用量大、貯存攜帶不便且患者依從性低等缺點。考慮到中風患者自理能力和吞咽功能均有不同程度的下降,而顆粒劑具有液體制劑和固體制劑的雙重功效,既能保留中醫方劑配伍特點,又能克服湯劑及丸劑服用不便[5]。因此,將其改良制成顆粒劑是一種較好的選擇,符合臨床用藥需求。

中藥制劑作為中醫藥的重要組成部分,既能發揮中醫藥原創優勢,又能豐富治療疾病的醫學手段,還能為探索中藥新藥開發提高價值途徑[6]。自國家食品藥品監督管理局發布《關于對醫療機構應用傳統工藝配制中藥制劑實施備案管理的公告》[7]以來,傳統工藝制備中藥制劑是研究開發院內制劑的主要途徑[8]。因此,課題組在原有湯劑的基礎上以黃芪主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷[9],桃仁主要成分苦杏仁苷[10]及得膏率為主要考察指標進行綜合評價,以加水量、提取時間及提取次數作為主要影響因素,進行正交試驗對通腦康顆粒的傳統制備工藝篩選優化,以期為今后通腦康顆粒的注冊備案與其相關制劑的研究開發提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫),PWN225DZH電子天平(常州奧豪斯),電熱鼓風干燥箱(天津泰斯特),多功能粉碎機(武義海納電器),JP-030超聲波清洗器(深圳潔盟)。

1.2 材料

1.2.1 藥材通腦康方所用10味中藥飲片包括黃芪(批號210401)、當歸(批號210801)、川芎(批號200501)、桃仁(批號210901)、紅花(批號220601)、地龍(批號220701)、蘄蛇(批號210401)、水蛭(批號220701)、茯苓(批號221001)及法半夏(批號220702),均購自安徽亳州千草制藥股份有限公司,經樂平市中醫醫院程金生副主任中藥師鑒定均為正品,可做藥用,其中水蛭粉碎后過六號篩備用,其他藥材均入煎劑。

1.2.2 試劑毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號111920-201907,含量96.8%),苦杏仁苷對照品(批號110802-202109,含量93.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院,輔料糊精為藥用級,乙腈、甲醇為色譜純,其他試劑試藥均為分析純,分析用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 對照品溶液制備取毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷對照品適量,精密稱定,加入70%甲醇定容,制成質量濃度分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷20 μg/ml,苦杏仁苷 80 μg/ml的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備精密稱定水提干膏粉5 g置于50 ml具塞錐形瓶中,加入甲醇定容,超聲處理30 min(功率180 W,頻率40 kHz),放冷,再稱定重量,用甲醇補足減少的重量,搖勻后過濾,取濾液即得供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液制備按處方比例制備不含黃芪和苦杏仁的陰性樣品,再按“2.1.2”項下的溶液制備方法制備成缺少黃芪和苦杏仁的陰性對照品溶液。

2.1.4 色譜條件和專屬性色譜柱為Agilent 1260 ODS柱(4.6×250 mm,5 μm),以乙腈為流動相A,0.1%磷酸溶液為流動相B,按流動相A 0～10 min,0→15%;10～20 min,15%→20%;20～40 min,20%→40%的濃度梯度洗脫,檢測波長為230 nm,柱溫30 ℃,進樣量10 μl,理論塔板數均不低于4000,色譜圖見圖1～圖3。

注:a苦杏仁苷;b毛蕊異黃酮葡萄糖苷。圖1 混合對照品溶液

注:a苦杏仁苷;b毛蕊異黃酮葡萄糖苷。圖2 供試品溶液

圖3 缺黃芪 苦杏仁陰性供試品溶液

2.1.5 線性關系精密吸取6個不同濃度的混合對照品溶液,按照“2.1.3”項下色譜條件進行測定,結果以對照品進樣濃度為橫坐標X,以峰面積為縱坐標Y,繪制標準曲線,進行線性回歸,毛蕊異黃酮葡萄糖苷的回歸方程為Y=30.772X-1.538,r=0.9991,苦杏仁苷的回歸方程為Y=1394.279X-5542.700,r=0.9996,說明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在2.155～25.857 μg和苦杏仁苷在33.933～407.195 μg具備良好線性關系。

2.1.6 精密度實驗取“2.1.1”項下的對照品混合溶液,在“2.1.4”色譜條件下重復進樣6次,測定峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分別為0.34%和0.24%,表明儀器的精密度良好。

2.1.7 穩定性實驗取同一批供試品溶液,在“2.1.4”色譜條件下,分別在0、3、6、9、12、15、18、24 h進樣測定峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷的RSD分別1.99%和0.76%,表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.8 重復性實驗精密稱取同一批水提干膏粉6份,按照“2.1.2”制備供試品溶液,在“2.1.4”色譜條件下測定峰面積并計算各成分含量。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分別為1.76%和1.22%,表明該實驗重復性良好。

2.1.9 加樣回收率精密稱取水提干膏粉5 g,平行6份,分別加入一定量“2.1.1”下的混合對照品溶液,按照“2.1.2”制備供試品溶液,在“2.1.4”色譜條件下測定峰面積及加樣回收率。結果顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分別為3.41%和1.72%,平均加樣回收率分別為100.05%和104.42%,實驗方法準確度良好。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 吸水率課題組取通腦康方中入煎劑藥材五分之一的量,置于燒杯中加純化水分別記錄0.5、1、2、4、6 h的增重情況考察吸水率,結果該藥材在4 h后無明顯吸水,藥材的吸水率為161%。

2.2.2 正交試驗本方制劑是利用傳統工藝制備,因此只能選擇傳統水提工藝,以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的含量為評價指標,正交試驗考察加水量、提取時間及提取次數的影響,三因素三水平見表1。

表1 提取工藝因素水平

2.2.3 提取工藝稱取二分之一處方量藥材(除水蛭),按設定方案進行煎煮,過濾,濃縮至100 ml,得到9個水提液。精密量取水提液2 ml,按“2.1.2”方法制備供試品溶液,以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的含量和得膏率為綜合評價指標,優選出最佳提取工藝。見表2。根據R值可看出,各因素對含量影響大小為C>A>B,由K值大小,可判斷最佳工藝條件為A3B2C3,考慮到藥材的吸水率為161%,第2次和第3次加水量可適當減少。因此,優選提取工藝為:煎煮3次,第1次加12倍水煎煮1.5 h,第2次加10倍量水煎煮1.5 h,第3次加10倍量水煎煮1.5 h。

表2 正交試驗L9(34)結果 (例,%)

得膏率測定:精密量取水提液20 ml,置已干燥至恒重的蒸發皿中,水浴蒸干,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻0.5 h,迅速稱重,以干燥品計算供試品中浸出物的含量。浸膏得率(%)=浸膏重量/20 ml藥液相當于藥材重量×100%。

綜合評價法:根據處方中的君臣佐使所起的作用權衡分配不同的比例,綜合評分(%)=毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量/組內最高值×40%+苦杏仁苷含量/組內最高值×30%+得膏率/組內最高值×30%×100%。

2.2.4 工藝驗證按處方量稱取飲片3份(除水蛭),按上述正交優選工藝進行提取,濃縮至100 ml,得到3份水提液,分別取水提液測定主要成分含量及浸膏得率。見表3。經過3批工藝驗證,毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在0.2 mg/g左右,苦杏仁苷在1.6 mg/g左右,得膏率在28%～30%,綜合評分96.33%,表明該優選工藝穩定可行,可進一步擴大工業化生產。

表3 提取工藝驗證 (例,%)

2.3 成型工藝研究

2.3.1 樣品制備取20倍處方量稱取藥材,其中水蛭打粉過六號篩,其余藥材按上述最佳提取工藝制備至稠膏,減壓干燥后粉碎成細粉,最后將兩者混合備用。

2.3.2 流動性課題組采取固定漏斗法測量混合干膏粉休止角,平行測量3次,休止角的平均值為42.76°,流動性較差,不能直接制粒,因此還需要加入一定量的輔料。

2.3.3 潤濕劑濃度課題組前期通過以75%、85%、95%乙醇進行潤濕劑考察實驗,發現75%乙醇制軟材起團,容易黏附篩孔,而95%乙醇會使軟材粘性差,細粉較多,因此本實驗采用85%乙醇做潤濕劑。

2.3.4 輔料比例顆粒劑傳統輔料中常見的有糊精、蔗糖等,由于在臨床實踐中,蔗糖對合并糖尿病患者的血糖影響較大,而糊精的市場價格最為實惠,在顆粒制劑中應用非常安全廣泛[11]。因此,課題組選擇全部采用糊精作為顆粒劑輔料并進行藥輔比例考察。將干膏粉與一定量糊精混勻,制粒,以制粒難易程度、休止角、24 h吸濕率及成型率對糊精的用量進行優選,綜合評價法=(成型率/組內最高值×40%+組內最小值/休止角×30%+組內最小值/吸濕率×30%)×100%。見表4。根據實驗結果,最終確定最佳的藥輔比例為1∶1.2,考慮到生產批量不同,實際生產中可適當微調。

表4 輔料用量選擇 (例,%)

2.3.5 干燥條件為防止干燥過程對顆粒造成影響,因此選用真空干燥箱進行干燥,在70 ℃條件下干燥至水分6%,考慮到生產批量不同,可適當微調。

2.3.6 工藝驗證以上述優選成型工藝制備3批通腦康顆粒,進行工藝驗證實驗。結果顯示3次實驗綜合評分平均為97.85%,與考察實驗99.01%接近,證明該實驗方法穩定可行。見表5。

表5 成型工藝驗證 (例,%)

3 討論

通腦康方由經典方劑補陽還五湯裁化而來,方中黃芪補氣行血為君藥,當歸活血補血為臣藥,桃仁、紅花、川芎、水蛭、地龍、蘄蛇活血化瘀,通經活絡為佐藥,半夏、茯苓祛痰除濕亦為佐藥,全方中藥合用共奏補氣除濕、活血通絡之效,用于氣虛痰瘀互阻型中風。

該方以湯劑形式在東平市中醫醫院臨床應用多年,其中水蛭打粉以湯劑沖服,且有多項研究表明水蛭以散劑服用的抗凝血及抗血栓作用均優于煎劑[12-14],因此,課題組在制備工藝上仍然選擇采用水蛭單獨粉碎后再與其他藥材干膏粉混合制備顆粒劑,最大程度上保持與原方一致。

課題組前期參考2020版《中華人民共和國藥典》[15]及相關文獻[16-18],考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸及甲醇-0.1%磷酸4種流動相下毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的色譜峰分離情況,發現乙腈-0.1%磷酸雜峰較少,故最終定為實驗流動相。同時根據混合對照品全波長掃描結果,毛蕊異黃酮葡萄糖苷及苦杏仁苷在230 nm處均吸收較大且分離度好,定為實驗檢測波長。制備工藝優化過程中,雖然正交試驗及綜合評分顯示加水12倍,提取3次,每次提取1.5 h為最佳工藝,但是實際上考慮到藥材的吸水率,第2次和第3次加水量可以適當減少,另外成型工藝中包括潤濕劑的濃度以及輔料的用量,考慮到生產批次的不同也可以根據實際質量檢測情況進行微調。

本研究采用正交試驗結合多指標評價法,將兩類主要功效藥味中的有效成分與得膏率,休止角、成型率與制粒情況等綜合考察工藝參數,相比單一成分及其指標更能有效地進行制劑質量控制。通過以上論述,本實驗優選的制備工藝穩定可行,可以為后期通腦康顆粒注冊備案及其相關的中藥制劑研究開發提供依據。