生存素與細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白5在胃癌及胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

包潔, 高小姣, 韓瑋, 王慶華

(江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院1. 消化內(nèi)科, 2. 病理科, 3. 普外科, 江蘇 昆山 215300)

近年來(lái),由于生活方式與飲食方式的改變,消化道腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢(shì),其中,胃癌與胃間質(zhì)瘤是最常見的兩種胃腫瘤[1-2］。胃癌是來(lái)源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,胃間質(zhì)瘤則是來(lái)源于間葉組織的腫瘤,故兩者腫瘤性質(zhì)、惡性程度及預(yù)后截然不同[3-4］。雖然將胃間質(zhì)瘤定義為交界性腫瘤,但其仍有惡性特征,危險(xiǎn)程度與核分裂象較高者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加,嚴(yán)重影響患者預(yù)后[5］。研究表明,參與胃癌發(fā)生發(fā)展的部分重要癌基因,同樣也參與胃間質(zhì)瘤的發(fā)生且致患者預(yù)后不佳[6-7］。生存素是凋亡抑制蛋白家族重要成員之一,同時(shí)在胃癌與胃間質(zhì)瘤的發(fā)生中起重要作用[8-9］。然而,單獨(dú)檢測(cè)生存素表達(dá)并不能充分評(píng)估胃癌與胃間質(zhì)瘤的臨床病理[10-11］。因此,本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘出與生存素表達(dá)密切相關(guān)的細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白5(cell division cycle associated protein 5,CDCA5),并擬用免疫組化進(jìn)一步確認(rèn)兩者在評(píng)估胃癌與胃間質(zhì)瘤的臨床病理中的價(jià)值,并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)兩者共表達(dá)可能的機(jī)制以及相互作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

首先,利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)檢索生存素的編碼基因BIRC5(baculoviral IAP repeat containing 5)與CDCA5在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異,并應(yīng)用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析兩者相關(guān)性;然后,在該數(shù)據(jù)庫(kù)中,分析與BIRC5mRNA表達(dá)相關(guān)度最強(qiáng)的前十個(gè)基因。其次,采用PROMO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://alggen.lsi.upc.es/recerca/frame-recerca.html)預(yù)測(cè)人組織中可能作用于CDCA5與BIRC5啟動(dòng)子(-2 000 bp)的轉(zhuǎn)錄因子,查詢是否有共同的轉(zhuǎn)錄因子,探尋可能的共表達(dá)機(jī)制。接著,利用HDOCK預(yù)測(cè)生存素蛋白與CDCA5蛋白之間的相互作用,根據(jù)分子直徑,將生存素設(shè)定為受體,CDCA5為配體,根據(jù)兩者相互作用評(píng)分,選取前三模擬構(gòu)建結(jié)合區(qū)域示意圖,并分析相互作用位點(diǎn)數(shù)。

1.2 組織樣本

收集從2015年1月至2021年1月于江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院普外科行胃癌根治術(shù)或胃腫瘤切除術(shù)獲取的胃癌組織(76例)、胃間質(zhì)瘤組織(63例)及距腫瘤邊緣5 cm對(duì)應(yīng)的癌旁/瘤旁組織。其中,胃癌患者男34例,女42例,平均年齡(64.55±12.88)歲;胃間質(zhì)瘤患者男31例,女32例,平均年齡(62.59±11.26)歲。所有胃癌與胃間質(zhì)瘤患者臨床及病理資料完整,包括性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、淋巴管侵犯、TNM分期、核分裂象、NIH危險(xiǎn)度分級(jí)及病理類型等。本研究獲得江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并獲得患者知情同意。

1.3 主要試劑和儀器

SP Rabbit &Mouse HRP試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;生存素兔多克隆抗體和CDCA5兔多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;蘇木素染色液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

醫(yī)用天平購(gòu)自上海第二天平儀器廠;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司;醫(yī)用切片機(jī)購(gòu)自上海阿兵食品機(jī)械有限公司;醫(yī)用烤片機(jī)、電熱恒溫烘烤箱購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠。

1.4 免疫組化檢測(cè)生存素與CDCA5表達(dá)

取“1.2”中收集的胃癌、胃間質(zhì)瘤及對(duì)應(yīng)的癌旁/瘤旁組織石蠟切片,行免疫組化染色。① 脫蠟水化:二甲苯透明3次(分別10 min、5 min和3 min),無(wú)水乙醇5 min,90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各3 min,水洗1 min;② 抗原修復(fù):枸櫞酸鈉高壓鍋煮沸20 min;③ 封閉:PBS沖洗3次,加過(guò)氧化物酶孵育10 min;④ 一抗孵育:PBS沖洗3次,滴加一抗工作液4 ℃孵育過(guò)夜;⑤ 二抗孵育:PBS沖洗3次;滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素孵育30 min;⑥ DAB顯色:PBS沖洗3次,滴加DAB孵育8 min,PBS沖洗后用蒸餾水終止染色;⑦ 復(fù)染、脫水、封片:蘇木素復(fù)染1 min,經(jīng)70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無(wú)水乙醇浸泡各3 min,二甲苯浸泡5 min,封片。生存素兔多克隆抗體和CDCA5兔多克隆抗體為一抗,用PBS將一抗稀釋為1∶250混合液,并用PBS作為陰性對(duì)照。

采用免疫反應(yīng)積分(immunoreactive score,IRS)法分析染色結(jié)果,包括染色強(qiáng)度評(píng)分(intensity score,IS)與染色細(xì)胞比例評(píng)分(proportion score,PS)。其中,IS為0分,無(wú)染色;1分,輕微染色;2分,適度染色;3分,深度染色。PS為0分,0%;1分,1%～25%;2分,26%～50%;3分,51%～75%;4分,76%～100%。IRS=IS×PS,并設(shè)IRS≥4分為陽(yáng)性表達(dá),即至少有26%適度染色或76%輕微染色才能列入陽(yáng)性表達(dá),反之為陰性表達(dá)[12］。每個(gè)IRS均由兩名病理專業(yè)醫(yī)師評(píng)估,任何分歧通過(guò)討論來(lái)解決。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 BIRC5與CDCA5在胃癌中的表達(dá)

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,BIRC5mRNA和CDCA5mRNA在胃癌組織中的表達(dá)均明顯高于正常胃組織(P<0.01,圖1A),且兩者在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.79,P<0.01,圖1B)。此外,與BIRC5mRNA表達(dá)密切相關(guān)的前十個(gè)分子分別為CDCA5(r=0.79)、KIFC1(r=0.79)、KPNA2(r=0.77)、TK1(r=0.77)、ALYREF(r=0.75)、CENPA(r=0.74)、MRPL38(r=0.73)、TACC3(r=0.72)、CDCA4(r=0.72)和CENPM(r=0.71);其中,CDCA5與其相關(guān)性最強(qiáng)。

TPM:每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本;A:胃癌組織和正常組織中BIRC5 mRNA與CDCA5 mRNA表達(dá)水平比較;B:胃癌組織中BIRC5 mRNA與CDCA5 mRNA表達(dá)相關(guān)性

2.2 生存素與CDCA5在胃癌及胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,在胃癌和胃間質(zhì)瘤中,生存素與CDCA5均在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖2A),兩者表達(dá)量均明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁/瘤旁組織(P均<0.001,圖2B和2C)。在胃癌及胃間質(zhì)瘤中,生存素與CDCA5表達(dá)均呈一定的正相關(guān)(r胃癌=0.410,P<0.001;r胃間質(zhì)瘤=0.347,P<0.05;圖2D)。

#:P<0.001,與對(duì)應(yīng)的癌旁/瘤旁組織相比;A. 光學(xué)顯微鏡下觀察(×100);B. 胃癌與癌旁組織中生存素與CDCA5表達(dá)差異;C. 胃間質(zhì)瘤與瘤旁組織中生存素與CDCA5表達(dá)差異;D. 胃癌與胃間質(zhì)瘤中生存素與CDCA5蛋白表達(dá)相關(guān)性

2.3 生存素和CDCA5表達(dá)與胃癌、胃間質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

在76例胃癌患者中,生存素陽(yáng)性43例,CDCA5陽(yáng)性40例。由表1可見,生存素表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴管侵犯及TNM分期相關(guān)(P均<0.05),而與年齡、性別及分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05);CDCA5表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期相關(guān)(P均<0.05),而與年齡、性別、腫瘤直徑及淋巴管侵犯無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

表1 生存素與CDCA5在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

在63例胃間質(zhì)瘤患者中,生存素陽(yáng)性40例,CDCA5陽(yáng)性39例。由表2可見,生存素表達(dá)與核分裂象及NIH危險(xiǎn)度分級(jí)相關(guān)(P均<0.05),而與年齡、性別、腫瘤直徑及病理學(xué)分類無(wú)關(guān);CDCA5表達(dá)與腫瘤直徑及NIH危險(xiǎn)度分級(jí)相關(guān)(P均<0.05),而與年齡、性別、核分裂象及病理學(xué)分類無(wú)關(guān)。

表2 生存素與CDCA5在胃間質(zhì)瘤中的陽(yáng)性表達(dá)及其臨床病理參數(shù)的相性分析

2.4 生存素和CDCA5共陽(yáng)性表達(dá)及其與胃癌、胃間質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在76例胃癌患者中,生存素與CDCA5均為陽(yáng)性者26例。由表3可見,生存素與CDCA5共陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P均<0.05),而與年齡及性別無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

表3 生存素與CDCA5在胃癌中共陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

在63例胃間質(zhì)瘤患者中,生存素與CDCA5均為陽(yáng)性者27例。由表4可見,生存素與CDCA5共陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、核分裂象及NIH危險(xiǎn)度分級(jí)相關(guān)(P均<0.05),而與年齡、性別及組織學(xué)類型無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

表4 生存素與CDCA5在胃間質(zhì)瘤中共陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)作用CDCA5與BIRC5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子

PROMO數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),有20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可作用于CDCA5啟動(dòng)子序列,有19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可作用于BIRC5啟動(dòng)子;其中,13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可同時(shí)作用于CDCA5與BIRC5啟動(dòng)子,分別為AP-2αA、C/EBPβ、ER-α、FOXP3、GR-α、GR-β、IRF-2、p53、Pax-5、RXR-α、TFⅡD、TFⅡ-I和YY1。見圖3。

AP-2αA:轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白2α;C/EBPβ:CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β;ER-α:雌激素受體-α;FOXP3:頭叉狀轉(zhuǎn)錄因子3;GR-α:糖皮質(zhì)激素受體-α:GR-β:糖皮質(zhì)激素受體-β;IRF-2:干擾素調(diào)節(jié)因子2;p53:腫瘤蛋白p53;Pax-5:配對(duì)盒基因5;RXR-α:維甲酸受體α;TFⅡD:轉(zhuǎn)錄因子ⅡD;TFⅡ-I:通用轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ-I;YY1:陰陽(yáng)因子1

2.6 生存素與CDCA5相互作用預(yù)測(cè)

HDOCK Server分析發(fā)現(xiàn),生存素蛋白與CDCA5蛋白之間存在多對(duì)相互作用,評(píng)分前三的結(jié)合區(qū)域見圖4。其中,預(yù)測(cè)評(píng)分最高的結(jié)合區(qū)域中,生存素蛋白與CDCA5蛋白之間存在67對(duì)相互作用位點(diǎn)。由此可見,生存素與CDCA5在胃癌組織中共表達(dá)的同時(shí),還可能通過(guò)相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能。

咖啡色示生存素蛋白,黃色、綠色和紅色示結(jié)合生存素蛋白不同區(qū)域的CDCA5蛋白

3 討論

胃癌與胃間質(zhì)瘤是常見的胃腫瘤,尤其是中晚期胃癌患者預(yù)后往往更差;盡管胃間質(zhì)瘤是交界性腫瘤,且有伊馬替尼等靶向藥物的應(yīng)用,但高危、高核分裂象的胃間質(zhì)瘤同樣具有較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率及病死率[2,13］。在胃癌與胃間質(zhì)瘤的發(fā)生過(guò)程中,部分癌基因的過(guò)表達(dá)可能是其發(fā)生發(fā)展的共同始動(dòng)因素。生存素的主要功能是通過(guò)抑制凋亡終末效應(yīng)酶和作用周期蛋白激酶發(fā)揮抗凋亡作用,以及通過(guò)作用染色體著絲點(diǎn)參與細(xì)胞有絲分裂[14］。由于參與調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡,生存素可誘導(dǎo)癌變,促進(jìn)胃癌生長(zhǎng),并抑制細(xì)胞凋亡,致其與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥、血管生成及患者預(yù)后密切關(guān)[14-15］。研究表明,在胃間質(zhì)瘤中,生存素與危險(xiǎn)程度分級(jí)有關(guān),且為疾病進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志,但其與年齡、性別、部位和組織學(xué)類型無(wú)關(guān)[16-17］。此外,生存素表達(dá)還受miR-494的負(fù)向調(diào)控,當(dāng)miR-494表達(dá)異常下調(diào)時(shí),生存素表達(dá)持續(xù)上調(diào),從而導(dǎo)致胃間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[9］。本研究結(jié)果顯示,BIRC5mRNA及生存素在胃癌組織及胃間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁/瘤旁組織,且生存素在胃癌中的表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)與TNM分期、腫瘤直徑、核分裂象及NIH危險(xiǎn)度分級(jí)等臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)。由此可見,盡管胃癌與胃間質(zhì)瘤起源不同,但均與生存素等癌基因的過(guò)表達(dá)相關(guān)。

CDCA5是細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白家族的重要成員之一,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、促進(jìn)增殖和抑制凋亡,并與其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白一同參與細(xì)胞的有絲分裂,從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生與進(jìn)展[18-20］。本研究發(fā)現(xiàn),相比于癌旁組織,CDCA5不僅在胃癌組織中表達(dá)明顯升高,在胃間質(zhì)瘤組織中同樣呈異常高表達(dá);其不僅與胃癌的腫瘤分化程度及TNM分期相關(guān),也與胃間質(zhì)瘤的腫瘤直徑及NIH危險(xiǎn)度分級(jí)相關(guān)。由此表明,CDCA5異常高表達(dá)可能也參與胃間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

此外,本研究發(fā)現(xiàn),在胃癌組織與胃間質(zhì)瘤組織中CDCA5與生存素表達(dá)均呈正相關(guān),由此認(rèn)為兩者異常高表達(dá)參與胃癌和胃間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。但兩者呈低度相關(guān),可能與樣本量、患者年齡、性別等不可控的一些潛在干擾因素有關(guān),后續(xù)有待進(jìn)一步研究。此外,兩者共陽(yáng)性表達(dá)與胃癌、胃間質(zhì)瘤的多個(gè)臨床病理參數(shù)相關(guān)。研究表明,生存素與CDCA5在腫瘤細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞增殖中起重要的促進(jìn)作用[14,20］。由此推測(cè),兩者高表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂異常活躍,進(jìn)而促進(jìn)胃癌、胃間質(zhì)瘤的發(fā)生與進(jìn)展。然而,兩者正相關(guān)的具體調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。另外,生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)通常能夠彌補(bǔ)單個(gè)標(biāo)志物在診斷上的不足[21］。值得注意的是,聯(lián)合檢測(cè)生存素與CDCA5表達(dá),在胃癌與胃間質(zhì)瘤的臨床病理學(xué)參數(shù)評(píng)估中彌補(bǔ)了檢測(cè)單個(gè)分子的缺陷,具有一定的臨床價(jià)值。

另外,通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),CDCA5與BIRC5啟動(dòng)子同時(shí)能被多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[22］。Jung等[23］研究表明,生存素受到Y(jié)Y1等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,但國(guó)內(nèi)外關(guān)于調(diào)控CDCA5表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)報(bào)道較少。因此,這或許是兩者表達(dá)呈正相關(guān)的重要因素之一,但需要進(jìn)一步確認(rèn)。不僅如此,HDOCK預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)生存素與CDCA5兩種蛋白之間存在相互作用。由此推測(cè),在多種轉(zhuǎn)錄因子的共同作用下,生存素與CDCA5在胃癌與胃間質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)且共陽(yáng)性表達(dá),兩者經(jīng)復(fù)雜的相互作用在胃腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

綜上所述,生存素與CDCA5在胃癌與胃間質(zhì)瘤中均呈高表達(dá),且呈一定的正相關(guān);兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期以及胃間質(zhì)瘤腫瘤直徑、核分裂象和NIH危險(xiǎn)度分級(jí)具有一定的評(píng)估作用。生存素與CDCA5表達(dá)異常可能是胃癌與胃間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的共性,兩者表達(dá)異常在胃腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在重要的內(nèi)在聯(lián)系,后續(xù)還需要深入研究?jī)烧呦嗷プ饔谩⑾嗷フ{(diào)控的可能機(jī)制。