缺氧生物膜轉型厭氧氨氧化生物膜培養(yǎng)與富集特性

蔣 睿 ,李 韌 ,于莉芳 ,2*,劉 然 ,劉 甜 ,張日霞 (.西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院,陜西 西安70055；2.西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室,陜西 西安 70055；.西安市政設計研究院有限公司,陜西 西安 70068)

以往污水處理廠脫氮除磷升級改造項目常通過在原有傳統(tǒng)活性污泥生物脫氮系統(tǒng)中加入懸浮填料掛膜以增加生物量來提高反應池的容積效率,即固定生物膜-活性污泥(IFAS)工藝[1-2].而目前在雙碳背景及污廢水排放標準進一步提升的要求下,現(xiàn)有城市污水處理廠的高能耗換水質模式難以持續(xù),亟需推廣應用高效低耗的新型生物脫氮工藝[3].

厭氧氨氧化(Anammox)是近年來成功開發(fā)的新型生物脫氮技術,與傳統(tǒng)硝化-反硝化工藝相比,Anammox 無需供氧和外加碳源,在總氮控制、污水處理和節(jié)能降耗等方面擁有巨大的優(yōu)勢[4].但由于厭氧氨氧化菌(AnAOB)生長速率慢、細胞產(chǎn)率低且活性受溫度影響較大[5],目前,一般通過引入或培養(yǎng)具有良好沉淀性能的顆粒污泥、選用具有較高生物持留能力的反應器和引入載體構建生物膜系統(tǒng)這三種方法來富集AnAOB[6-8].其中,生物膜法憑借其污泥停留時間長、工程改造成本較低等優(yōu)勢而受到廣泛關注[9],但如何快速培養(yǎng)大量的Anammox 生物膜是限制其在工程上大規(guī)模推廣應用的一個瓶頸.

現(xiàn)有調查研究發(fā)現(xiàn)城市污水處理廠缺氧池填料上的生物膜中存在著一定豐度的AnAOB,如西安市某污水處理廠(IFAS 工藝)缺氧生物膜中的AnAOB 豐度達到0.11%[10],遠高于傳統(tǒng)城市污水處理廠絮狀污泥中報道的相對豐度(0.003～0.01%)[11-12].研究還發(fā)現(xiàn)污水處理廠缺氧池海綿載體上出現(xiàn)了紅色Anammox 生物膜,且其Anammox脫氮速率是反硝化的4.85 倍[13].如果能利用污水處理廠現(xiàn)有填料快速培養(yǎng)具有較高活性的Anammox生物膜,就有可能有效解決工程上Anammox 生物膜培養(yǎng)問題.

本研究引入西安市某污水處理廠缺氧池填料啟動UAFB(升流式厭氧固定床生物膜)-Anammox反應器,逐步提高氮負荷以培養(yǎng)Anammox 生物膜,探究富集培養(yǎng)過程中Anammox 生物膜特性和菌群變化情況,以期為雙碳背景下污水處理廠的提標改造提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置及運行

采用UAFB-Anammox 反應器(圖1),有效容積5.0L,填料區(qū)容積3.5L,填充率70%.通過恒溫水浴將反應器內溫度控制在(33±2)℃;通過外部循環(huán)泵使內部水流充分混合;在進水中添加NaHCO3將pH 值控制在7.5～8.2;所用接種填料均取自西安市某污水處理廠的缺氧池,填料比表面積為500m2/m3,初始Anammox 活性為(0.11±0.03)g/(m2·d).

圖1 UAFB 反應器示意Fig.1 Schematic diagram of UAFB-Anammox reactor

整個實驗運行過程分5 個階段,各階段表面氮負荷率(SNLR)逐步增加.反應器以序批式運行,具體運行參數(shù)、周期、水力停留時間(HRT)見表1,每個周期進水5min,出水5min,閑置5min,換水比為50%.

1.2 試驗用水

試驗用水采用人工配制,進水使用NH4Cl 和NaNO2配制NH4+-N 和NO2--N(具體濃度見表1),控制NH4+-N :NO2--N= 1 :1.32;KHCO30.5g/L;MgSO4·7H2O 0.14g/L;CaCl2·2H2O 0.14g/L;KH2PO40.03g/L 并配制一定濃度的微量元素[14].

1.3 分析項目及方法

NH4+-N、NO2--N 和NO3--N 濃度的測定采用標準分析方法[15],pH 值及溶解氧(DO)分別采用雷磁PHS-3C pH 計和Seven2Go S9 型溶氧儀(Mettler Toledo,瑞士)進行測定.

生物膜厚度測定采用顯微鏡法,先用冷凍切片機(Leica CM1950,德國)對預先包埋過的填料進行切片,然后通過尼康50i 電子顯微鏡(Nikon,日本)觀測生物膜厚度,多次測定取平均值;生物膜干重測定采用差值法[16].

Anammox 最大活性采用直接取樣法進行異位測定,以氮素濃度變化來確定Anammox 活性[17];血紅素采用吡啶血紅素分光光度法進行測定[18].肼氧化酶(HZO)利用低溫高壓連續(xù)細胞破碎儀(JN-02C,廣州聚能納米生物科技有限公司)進行提取,具體方法參照文獻[19-20].

1.4 計算方法

Anammox 表觀活性(以NH4+-N 計)根據(jù)公式(1)計算:

式中:[NH4+]inf為進水氨氮濃度,mg/L;[NH4+]eff為出水氨氮濃度,mg/L;70%為反應器的填充率;HRT 為水力停留時間,h;500 為填料的比表面積,m2/m3.

1.5 高通量測序

DNA 的提取采用美國MoBio 公司的PowerSoil DNA 試劑盒,提取后的生物膜樣品使用1%凝膠電泳檢查所提取DNA 片段純度.以提取的DNA 片段為PCR 模板,采用引物序列515a(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)在Miseq PE300 平臺(Illumina,USA)對DNA樣品的16S rRNA 基因的V4 區(qū)進行擴增.具體測定方法參考文獻[21].

2 結果與討論

2.1 脫氮性能

本實驗根據(jù)進水負荷差異共分為5 個階段,UAFB-Anammox 反應器的脫氮性能及各階段Anammox 活性變化如圖2所示.

隨著網(wǎng)絡經(jīng)濟的不斷發(fā)展，未來五到十年后，社會消費群體將以90后、00后為主流，他們更能運用網(wǎng)絡技術手段滿足自己的需求，他們對實體店的依賴度會更加低。同時，他們更追求個性化，追求自我需求，不盲目跟從，傳統(tǒng)的營銷方法難以吸引這類人群。另外，由于網(wǎng)絡的全天候和全球性，加上無線互聯(lián)技術的逐步成熟，消費者可以隨時隨地傳達自己的需求信息，只有互聯(lián)網(wǎng)經(jīng)濟能滿足消費者在碎片化時間購物的需求。

圖2 UAFB-Anammox 反應器中氮濃度、負荷及Anammox 活性的變化Fig.2 The variation of nitrogen concentration,SNLR and anammox activity

2.1.1 快速啟動階段(階段 Ⅰ)考慮到接種填料的初始Anammox 活性相對較低((0.11 ± 0.03)g/(m2·d)),較高濃度的游離氨(FA)及游離亞硝酸(FNA)會對初期AnAOB 形成抑制[22],所以反應器的初始SNLR 設計為0.23g/(m2·d)(以TN 計),即0.1g/(m2·d)(以NH4+-N 計).

運行第1～5d,反應器出水NH4+-N 濃度高于進水,出水TN 濃度從59.82mg/L 增加至67.11mg/L,這可能是接種填料上的部分微生物(尤其是異養(yǎng)菌)無法適應新環(huán)境,進而發(fā)生菌體自溶現(xiàn)象,釋放出部分有機物及NH4+-N 導致的[7].

第6～16d,出水NH4+-N 濃度從29.06mg/L 逐漸降低至4.76mg/L,出水NO2--N 濃度在24.41mg/L 左右波動,出水 NO3--N 濃度從 4.06mg/L 上升至8.86mg/L,TN 去除率從22.69%增加至68.18%,這可能是反應器內少量的氧氣引起的部分硝化和Anammox、部分反硝化共同造成的.之后,出水NH4+-N 和NO2--N 濃度開始同步降低,TN 去除率逐步上升,反應器Anammox 現(xiàn)象逐漸明顯.培養(yǎng)至29d時,反應器NH4+-N 和NO2--N 去除率分別達到96.53%和 98.88%,TN 去除率和去除負荷高達76.22% 和 1.77g/(m2·d),且第 17～29d 內,出水NH4+-N、NO2--N 的去除量和NO3--N 的生成量之間呈現(xiàn)一定比例,(1 :1.31 :0.33)與Strous 等[23]提出的理論值(1 :1.32 :0.26)接近,這均說明UAFBAnammox 反應器的成功啟動.

本實驗反應器接種缺氧生物膜所需啟動時間(29d)與以往接種厭氧顆粒污泥(140d)[24]、硝化-反硝化污泥(94d)[25]和常規(guī)活性污泥所需接種時間(60d)[26]相比,大幅縮短.這是因為在接種反硝化池中,反硝化過程產(chǎn)生的NO2--N 和進水中帶入的NH4+-N 在此處同時存在,為AnAOB 的生長提供了必要的基質條件,同時生物膜又給AnAOB 提供了一定的持留環(huán)境,這使得缺氧生物膜中含有一定豐度的AnAOB.同時有研究表明,在接種污泥中預先富集AnAOB,反應器能更快的檢測出Anammox活性[27].

第 30～91d,反應器進入穩(wěn)定運行狀態(tài),出水NH4+-N 及NO2--N 濃度均小于3mg/L,去除率均達98%以上,出水NO3--N 濃度為(22.15 ± 4.12)mg/L,TN 平均去除率為70.28%,Anammox 最大活性增長至(0.16 ± 0.04)g/(m2·d)(第91d).反應器成功啟動后,通過提高進水基質濃度和縮短HRT 提升SNLR 以進一步富集AnAOB.

如圖2所示,SNLR 由0.35g/(m2·d)(階段Ⅱ)提升至2.59g/(m2·d)(階段 Ⅴ),Anammox最大活性由(0.16±0.05)g/(m2·d)(第101d)提升至(2.20±0.12)g/(m2·d)(468d),提升了1275%,AnAOB 富集效果顯著.但在階段Ⅴ末期Anammox 最大活性出現(xiàn)小幅下降,由(2.20± 0.12)g/(m2·d)(468d)降低至(2.15 ± 0.07)g/(m2·d)(492d),這可能是隨著生物膜上AnAOB 的不斷富集,生物膜空隙逐漸變小,甚至逐漸出現(xiàn)了堵塞現(xiàn)象(圖3)所導致的[28].最終UAFB-Anammox 反應器最大活性維持在(2.15 ± 0.07)g/(m2·d),負荷提升結束.

圖3 缺氧生物膜轉型厭氧氨氧化生物膜過程中的形態(tài)變化Fig.3 The morphological changes of the biofilm during the culturing process

2.2 Anammox 生物膜特性

圖3 為生物膜在轉型培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化.如圖3a所示,懸浮填料表面較為粗糙,且有較多小凸刺,適宜生長緩慢的AnAOB 附著生長,填料表面黏性物質將微生物緊緊黏附在一起,形成了較為密實的生物膜結構.如圖4所示,從接種到培養(yǎng)至137d,生物膜厚度由(147.17 ± 73.22)μm 增長至(437.48 ±196.39)μm,隨著SNLR 進一步增加,生物膜厚度最終培養(yǎng)至(774.07 ± 140.87)μm.同時,生物膜干重也從(98.18 ± 9.31)mg/個增加到(250.80 ± 5.35)mg/個.

圖4 生物膜培養(yǎng)過程中質量和厚度的變化趨勢Fig.4 The variation of biofilm quality and biofilm thickness during the culturing process

整個負荷提升過程中,生物膜顏色呈現(xiàn)出黑褐色-紅棕色-橘紅色-胭脂紅的變化.由于接種填料是取自缺氧池的生物膜,膜上富集的大多是類似反硝化菌的異養(yǎng)菌群,所以接種生物膜呈現(xiàn)黑褐色.培養(yǎng)至第137d時,生物膜中不適宜環(huán)境的微生物菌體被淘汰,生物膜變?yōu)榧t棕色,AnAOB 在生物膜中逐漸富集;培養(yǎng)至357d 時,生物膜呈現(xiàn)橘紅色;第492d 時,生物膜呈胭脂紅色.對比357 和492d 的生物膜發(fā)現(xiàn),進一步提升SNLR 后培養(yǎng)的生物膜更為密實,這可能是由于生物膜在培養(yǎng)過程中,微生物會向體外不斷分泌高分子的胞外聚合物(EPS),EPS 會覆蓋在微生物聚集體表面或者填充在細胞之間,從而使生物膜變得相對緊實[29].

培養(yǎng)終期生物膜顏色偏向暗紅,這表明Anammox 生物膜已成熟,Anammox 活性達到一個較高值((2.15 ± 0.07)g/(m2·d)).此時生物膜具有一定厚度((774.07 ± 140.87)μm),但孔隙率降低(圖3),與此時Anammox 最大活性出現(xiàn)小幅下降(由(2.2 ±0.12)g/(m2·d)降低至(2.15 ± 0.07)g/(m2·d))結果一 致.

2.3 HZO 活性和血紅素含量

AnAOB 介導氮轉化過程中有多種酶的參與,其中HZO 是AnAOB 所特有的酶[30].同時血紅素c 是AnAOB 中參與主要代謝反應的重要輔助因子,具有催化和電子傳遞的潛力,可用作評估Anammox 性能的指標[31].為了建立UAFB-Anammox 生物膜反應器脫氮性能與HZO 活性的關系,分別選取接種填料以及第137,357 和492d 的生物膜進行HZO 活性和血紅素含量測定.

如圖5所示,接種填料上HZO 活性很低,而隨著UAFB 反應器的成功啟動,Anammox 生物膜上的HZO 活性呈明顯增加趨勢,第137,357 和492d 時生物膜HZO 活性分別為(0.75 ± 0.08),(1.73 ± 0.15)和(2.03 ± 0.17)μmol/(個·min),同時反應器也表現(xiàn)出較穩(wěn)定的脫氮效果.血紅素變化結果顯示,相較于接種填料的血紅素含量(0.03μmol/個),第137,357 和492d生物膜的血紅素含量分別增加了333.38%、607.08%及960.60%.相關性分析結果顯示,本研究中SNLR與 HZO 活性、血紅素含量都呈顯著正相關(P<0.05,P<0.05).這說明AnAOB 在應對負荷不斷提升的環(huán)境下,逐步適應并成功富集.

圖5 生物膜培養(yǎng)過程中血紅素含量和HZO 活性的變化趨勢Fig.5 The variation of heme content and HZO activity during the process of biofilm cultivation

2.4 生物膜群落結構變化

2.4.1 門水平 如圖6a所示,接種填料上微生物種類豐富,其優(yōu)勢菌門(相對豐度>5%)有脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicutes),同時還含有 2.62%的浮霉菌門(Planctomycetota).隨著培養(yǎng)的進行,生物膜內微生物群落結構變化顯著.培養(yǎng)至 137d 時,生物膜內AnAOB 所屬的Planctomycetota 門相對豐度大幅度上升至 48.05%并占絕對優(yōu)勢,次優(yōu)勢菌門為Proteobacteria,而 Bacteroidota 、 Chloroflexi 、Firmicutes 和Desulfobacterota 則大幅下降.

圖6 生物膜中的微生物群落結構變化Fig.6 Changes of microbial community structure

2.4.2 屬水平 如圖6b所示,接種生物膜中優(yōu)勢菌屬(相對豐度大于2%)主要包括具有脫硫功能的Desulfobacterium(3.89%)、Desulfomonile(2.37%)和具有反硝化功能的Denitratisoma(2.26%),同時,檢測到的AnAOB 菌屬為Candidatus_Brocadia(0.88%).第137d,生物膜中Desulfobacterium、Desulfomonile被淘汰(相對豐度<0.01),Denitratisoma 的相對豐度增長至7.40%,Ca.Brocadia 被高度富集,其相對豐度從培養(yǎng)前的0.88%增至28.88%,占絕對優(yōu)勢.第357d時,生物膜中檢測出 1.64% Candidatus_Jettenia,AnAOB 多樣性增加.第492d 時,Ca.Brocadia 和Ca.Jettenia 相對豐度分別為33.38%和3.02%,AnAOB 富集效果明顯,這是Planctomycetes豐度顯著增加的主要原因,也是反應器Anammox 脫氮效率提升的關鍵.

此外,作為接種生物膜上兩種豐度較高的反硝化菌,Denitratisoma(2.26%)和Comamonas(1.99%)在反應器 SNLR 提升過程中,相對豐度呈現(xiàn)出相反變化.Denitratisoma 相對豐度增長至(6.85±1.28)%,與已有研究[32-33]中的豐度相近,而Comamonas 豐度則不斷下降,最終降低至0.03%,被系統(tǒng)淘汰.此現(xiàn)象表明在AnAOB 富集過程中,生物膜上存在著細胞代謝或者劣勢菌群被淘汰后的有機物,而Denitratisoma 具有較強的與AnAOB共存的能力[32],Denitratisoma消耗這些有機碳源,并利用Anammox 過程中產(chǎn)生NO3--N,將其還原成N2,進一步提高反應器的脫氮效率.

3 結論

3.1 采用污水處理廠缺氧池填料,經(jīng)29d 快速啟動了Anammox 生物膜反應器.SNLR 由0.23g/(m2·d)提升至2.59g/(m2·d)的過程中,生物膜厚度從(147.17±73.22)μm 增加至(774.07±140.87)μm,反應器TN 去除率高達83.68%.

3.2 在Anammox 生物膜培養(yǎng)過程中,血紅素含量和HZO 活性均與SNLR 呈顯著正相關,生物膜顏色也呈現(xiàn)出紅棕色-橘紅色-胭脂紅的變化,培養(yǎng)結束時,HZO 活性由(0.75±0.08)μmol/(個·min)增至(2.03±0.17)μmol/(個·min),反應器最大Anammox活性維持在(2.15±0.07)g/(m2·d).

3.3 富集后的生物膜中優(yōu)勢門為Planctomycetota,相對豐度為48.05%;Anammox 菌屬為Ca.Brocadia和Ca.Jettenia,其中Ca.Brocadia 相對豐度從培養(yǎng)前的0.88%增至33.38%.說明采用城市污水處理廠缺氧生物膜轉型培養(yǎng)Anammox 生物膜這一方法具有工程應用可行性.