氣相色譜法檢測紅樹林濕地土壤中氯/溴代多環芳烴

左梓岑,張 麗,倪 潔,何 真*,楊桂朋(.中國海洋大學化學化工學院,山東 青島 6600；.自然資源部熱帶海洋生態系統與生物資源重點實驗室,廣西 北海 536000)

氯/溴代多環芳烴(Cl/Br-PAHs)是多環芳烴(PAHs)上的一個或多個氫原子被氯/溴原子取代形成的一類新污染物.由于氯/溴原子的取代位置數目和相應母體PAHs 的種類的不同,Cl/Br-PAHs 具有眾多的同系物.Cl/Br-PAHs 在環境中普遍存在,具有較高的穩定性和持久性,難以降解,目前已經在各種環境基質(空氣、水、土壤和沉積物)中檢測到Cl/Br-PAHs 的存在[1-7].現有研究表明Cl/Br-PAHs的主要來源是金屬冶煉、工業生產、廢棄物燃燒、電子廢物拆解和交通工具尾氣排放等熱過程及光化學反應過程[8-11].它們在結構上與多氯二苯并對二惡英(PCDDs)類似,具有相近的物理化學性質(蒸汽壓、辛醇-水分配系數(Kow)和亨利定律常數),表現出類似的三致效應(致癌、致畸和致突變毒性)[12-14].Ohura 等[12]通過向YCM3 酵母細胞培養皿中加入不同種類的Cl/Br-PAHs,發現Cl/Br-PAHs 會通過芳香烴受體的介導作用產生毒性.目前,毒性當量商(TEQ)被視為評估Cl/Br-PAHs 潛在毒性較好的指標,有研究評估了芳香烴受體介導的Cl/Br-PAHs不同單體的活性,并報告了其相對于苯并[a]芘(REPBaP)或對 2,3,7,8-四氯二苯并對二惡英(REPTCDD)的毒性表現[12,15-17].

紅樹林生態系統位于熱帶和亞熱帶沿海灘涂地帶,由一系列能適應高鹽、高潮和低氧環境的特殊植物組成.作為重要的碳匯,紅樹林能吸收并儲存大量的碳,緩解全球氣候變化[18].研究表明,廣西紅樹林有機碳埋藏速率為44.0～444.1g/(m2·a)[19].紅樹林還具有水質凈化功能,能過濾水中污染物,改善水質,并具有防風、消浪和除淤等生態功能[20].然而隨著經濟發展、城鎮化和工業化的加速,全球紅樹林逐漸減少,其正面臨著嚴重的威脅.研究顯示,自21世紀以來廣西紅樹林面積減少嚴重,紅樹林濕地遭受到城市發展、近海水產養殖等人類活動以及海平面上升的嚴重破壞[21].紅樹林濕地作為連接陸地與海洋的重要濱海濕地生態系統之一,目前對于Cl/Br-PAHs 在紅樹林濕地的環境影響的研究尚存在不足.因此開展紅樹林濕地土壤中Cl/Br-PAHs的研究具有重要意義.

氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)方法在檢測環境中的持久性有機污染物(POPs)方面分析成本低,且具有較高的靈敏度和準確性,具有較好的應用前景.由于Cl/Br-PAHs 在環境中的濃度水平較低,電子捕獲檢測器(ECD)對于具有電子親和力的化合物檢測特別適用,能夠檢測到皮克級(pg)的濃度.根據劉明洋等[11]對Web of Science 核心數據庫中相關文獻的綜述,目前對于環境中Cl/Br-PAHs 尚未有統一且精確的檢測方法.本研究對土壤樣品前處理方法進行了探究,建立了一種可靠、靈敏的GC-ECD方法用于定性定量分析18 種Cl/Br-PAHs,并與GC-MS 方法進行了對比,評價了GC-ECD 方法的可行性.最后對采自廣西北部灣紅樹林濕地土壤樣品中的Cl/Br-PAHs 進行了檢測,探究了其污染特征.本研究為后續相關研究提供了方法參考和數據支持,有助于評估Cl/Br-PAHs 對紅樹林濕地生態系統的潛在風險,為環境污染防治提供科學依據.

1 材料和方法

1.1 儀器和主要試劑

氣相色譜儀(Agilent 8890A),配備電子捕獲檢測器(ECD);氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS,Agilent 7890A/5975C);HP-5 毛細管色譜柱(30m×0.32mm×0.25μm);氮吹儀(N-EVAP-112,Organomation 公司);旋轉蒸發儀(N-1300V-W,EYELA 公司);冷凍干燥機(FD-1D-50,北京博醫康實驗儀器有限公司);低速離心機(SC-3610,中國科大創新股份有限公司);超聲波清洗器(KQ-300E,昆山超聲儀器有限公司);C18小柱(6mL,500mg,BKMAM 公司);Florisil 小柱(6mL,500mg,BKMAM 公司);正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、異辛烷和甲醇均為色譜純,購自天津大茂化學試劑廠.

18 種Cl/Br-PAHs 標準品(純度均≥97%):2-氯菲(2-ClPhe)、9-氯蒽(9-ClAnt)購自中國上海畢得醫藥科技有限公司;2-氯蒽(2-ClAnt)、9,10-二氯蒽(9,10-Cl2Ant)、3-溴菲(3-BrPhe)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1,8-二氯蒽(1,8-Cl2Ant)購自江蘇艾康生物醫藥研發有限公司;9-氯芴(9-ClFle)、2,7-二氯芴(2,7-Cl2Fle)、5-溴苊(5-BrAna)購自上海源葉生物科技有限公司;2-溴芴(2-BrFle)、2-溴蒽(2-BrAnt)、9-溴蒽(9-BrAnt)、2,7-二溴芴(2,7-Br2Fle)購自美國 Sigma Aldrich 公司;1,8-二溴蒽(1,8-Br2Ant)、9,10-二溴蒽(9,10-Br2Ant)購自上海麥克林生化科技股份有限公司;3-溴熒蒽(3-BrFlu)、4-溴芘(4-BrPyr)購自上海皓鴻生物醫藥科技有限公司;7-溴苯并[a]苊(7-BrBaA)購自上海吉至生化科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 本研究于2022年7月中旬在廣西欽州市紅樹林濕地采集了5 份土壤樣品,每份土壤樣品采用五點采樣法進行采樣(選定研究區域后分別在其幾何中心和4 個頂角采集土壤樣品),采集后的土壤樣品均勻混合后用四分法去除多余土樣[22](A1:21°50.619′N,108°36.867′E;A2:21°50.613′N,108°36.857′E;A3:21°50.603′N,108°36.854′E;A4:21°50.594′N,108°36.867′E;A5:21°50.587′N,108°36.855′E),采樣點如圖1所示.收集的樣品被放置在干凈的鋁箔紙上(使用前在馬弗爐中450℃灼燒6h 以除去可能存在的污染物),密封在封口袋中,存放在-20℃的冰箱中進行保存,直至下一步分析.

圖1 廣西欽州市紅樹林濕地采樣點Fig.1 Sampling sites of mangrove wetlands in Qinzhou City,Guangxi

1.2.2 樣品提取與凈化 準確稱取10g 冷凍干燥后土壤樣品,使用瑪瑙研缽研磨,過80 目篩.以50mL乙酸乙酯:二氯甲烷:正己烷(1:2:2,體積分數,下同)混合溶劑作為提取溶劑進行超聲提取,每次提取前加入4g 銅粉,共進行3 次提取,每次提取時間為15min.提取結束后,樣品在2500r/min 下離心10min 收集上清液.合并3 次提取的上清液,利用旋轉蒸發儀將提取溶液濃縮至約1mL,再轉移到C18固相萃取柱(使用前依次使用6mL 正己烷、二氯甲烷、甲醇進行活化)進行凈化.使用20mL 二氯甲烷:正己烷(1:1,體積分數)混合溶劑作為洗脫溶劑進行洗脫,收集洗脫液,用旋轉蒸發儀濃縮.將濃縮液轉移至氮吹管中,用溫和的氮氣定容至100μL,最后將濃縮液存放在色譜進樣瓶中,待測.

1.2.3 色譜條件 HP-5 毛細管色譜柱(30m ×0.25mm×0.25μm),不分流進樣,進樣量1μL,載氣(氮氣)流速為1mL/min,進樣口溫度280℃ .柱溫程序:柱溫50℃,保持3min;以5 ℃/min的速率升至175℃,保持2min;以1 ℃/min升至182℃后再以1.5 ℃/min升至200℃,保持3min;最后以8 ℃/min升至300℃,保持5min.18 種Cl/Br-PAHs 的GC-ECD 方法色譜流出圖如圖2.

圖2 18 種Cl/Br-PAHs 的色譜圖Fig.2 Chromatogram of the 18Cl/Br-PAHs

1.2.4 質譜條件 離子源溫度:230℃;電子轟擊源(EI);離子化能量:70eV;接口溫度:280℃;四級桿溫度:150℃;傳輸線溫度:300℃;質量掃描范圍:50～500aum;溶劑延遲時間:6min;掃描模式:全掃描Scan和選擇離子檢測(SIM)模式.

1.3 數據處理

相關圖形使用Origin 2023b 繪制,使用excel 2022 處理回收率、相對標準偏差等實驗數據.

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

樣品的提取是準確分析環境樣品中 Cl/Br-PAHs 的關鍵步驟,常用的提取方法有液液萃取(LLE)、索氏提取(SE)、加速溶劑提取(ASE)和超聲提取(UE)等[11].索氏提取(SE)是一種經典提取方法,當提取過程中溶劑沸騰時,蒸汽會上升并通過冷凝管冷凝成液體,當溶劑達到一定高度后,通過虹吸作用,溶劑及其中溶解的目標化合物會回流入燒瓶中.這個過程會不斷循環,純的溶劑在循環過程中不斷的沖洗樣品,從而使目標化合物從樣品中溶解出來.超聲提取(UE)是一種利用超聲波能量促進目標化合物從樣品中溶解到溶劑中的提取方法.超聲提取的原理是當超聲波通過液體介質時,會產生正負壓力交替的波動.這種波動會引起液體內部產生微小的空泡,隨著波動的持續,這些空泡會迅速增長并最終破裂,這個現象會產生高溫、高壓和強烈的湍流,會加速目標化合物從樣品中提取出來.研究對比了這兩種提取方式對18 種Cl/Br-PAHs 的提取效率.

2.1.1 索氏提取 參考國標HJ 834-2017[23]中索氏提取的方法,首先選取污染較小區域的土壤于馬弗爐中450℃灼燒48h 后作為空白基質土壤.準確稱取10.00g 空白基質土壤,加入20.00μL 1000ng/mL 的Cl/Br-PAHs 標準溶液后包裹在濾紙套中放入索氏提取器,分別使用200mL 乙酸乙酯:二氯甲烷:正己烷(1:2:2)和二氯甲烷:正己烷(1:1)兩種不同的提取溶劑于80℃下提取36h.將提取液濃縮后分別用C18固相萃取柱和Florisil 固相萃取柱進行凈化,其對目標化合物的平均回收率見表1.

表1 索氏提取不同條件下對目標Cl/Br-PAHs 的平均回收率Table 1 Average recovery rate of target Cl/Br-PAHs under different conditions of Soxhlet extraction

2.1.2 超聲提取 參考國標HJ 911-2017[24]中超聲提取的方法,準確稱取10.00g 空白基質土壤,加入20.00μL 1000ng/mL的Cl/Br-PAHs標準溶液,分別使用50mL乙酸乙酯:二氯甲烷:正己烷(1:2:2)和二氯甲烷:正己烷(1:1)兩種不同的提取溶劑進行超聲提取.并且設置1,2,3,4 四種不同的提取次數和5,10,15,20min四種不同的提取時間,以此來探究在不同超聲提取條件下,C18(十八烷基)和Florisil(弗羅里硅土)兩種不同類型的固相萃取柱對18 種Cl/Br-PAHs 同類物回收率的差異,各條件下回收率見表2.

表2 超聲提取不同條件下對目標Cl/Br-PAHs 的平均回收率Table 2 Average recovery rates of target Cl/Br-PAHs under different ultrasonic extraction conditions

2.2 提取方法探究

2.2.1 提取條件 如圖3所示,索氏提取和超聲提取在對目標化合物的提取回收率上相近,但索氏提取所需時間較長且會消耗大量有機溶劑,因此最終選取超聲提取作為實際樣品的提取方法.由圖3b 和圖4 對超聲提取的實驗探究結果顯示,不同的提取溶劑、提取時間和次數對提取回收率有著較大影響.當提取時間為15min,提取次數為3次,提取溶劑為乙酸乙酯:正己烷:二氯甲烷(1:2:2)時得到的目標化合物的平均回收率最高.

圖3 提取方法(a)及提取溶劑(b)對18 種Cl/Br-PAHs 同類物的回收率對比Fig.3 Comparison of the recovery rates of the 18Cl/Br-PAHs homologues using different extraction methods(a)and extraction solvents(b)

圖4 不同超聲提取次數和時間下18 種Cl/Br-PAHs 的平均回收率比較Fig.4 Comparison of average recovery rates of 18Cl/Br-PAHs under different ultrasonic extraction times and time

2.2.2 凈化方法 本研究還對比了兩種不同類型的固相萃取柱對目標Cl/Br-PAHs 的回收率的影響(圖4).C18(十八烷基)和Florisil(弗羅里硅土)都有被報道過從環境基質中凈化POPs.C18固相萃取柱是反向柱,以疏水性強的十八烷基作為填料,通過強疏水相互作用保留非極性化合物.Florisil(弗羅里硅土)固相萃取柱,是一種正向柱,弗羅里硅土是一種由氧化鎂(MgO)和硅土(SiO2)組成的強極性,高活性的多孔吸附劑,通過極性作用對低極性和中等極性的化合物進行吸附.如圖5所示,兩種固相萃取柱在對目標化合物的回收率上沒有明顯差異,因此選擇更加經濟的Florisil 固相萃取柱作為凈化材料.

圖5 不同凈化材料對18 種Cl/Br-PAHs 同類物的回收率對比Fig.5 Comparison of the recovery rates of the 18Cl/Br-PAHs homologues using different purification materials

2.3 方法有效性驗證

采用已經建立的氣相色譜方法,對濃度逐級稀釋的Cl/Br-PAHs 標準溶液進行測定,直到目標化合物的信噪比為3,平行測定3次,得到各個化合物單體的儀器檢出限為0.07～1.25ng/g,方法檢出限為0.21～3.75ng/g.實驗中共配制7 種不同濃度的Cl/Br-PAHs標準溶液(1,10,20,50,100、500,1000ng/g),建立了18種Cl/Br-PAHs的標準曲線.同時,基于土壤樣品的污染水平,于空白基質土壤樣品中加入 20 μL 1000ng/mL 的標準溶液進行完整的前處理步驟,得到全部同類物的回收率在64.9%～106.4%之間,具體結果見表3.取7 份5ng/g Cl/Br-PAHs 標準溶液使用GC-ECD 重復測定,計算7 次重復實驗的RSD,18 種Cl/Br-PAHs 同類物的RSD 均小于20%,具體結果見表4.

表3 18 種Cl/Br-PAHs 的標準曲線和回收率Table 3 Standard curves and recovery rates of the 18Cl/Br-PAHs

表4 18 種Cl/Br-PAHs 的方法檢出限和相對標準偏差Table 4 Detection limits and relative standard deviations of 18Cl/Br-PAHs

2.4 與GC-MS 方法的比較

將GC-ECD 方法與GC-MS 方法進行了對比,使用相同的前處理方法后,GC-MS 方法測定得到的18 種Cl/Br-PAHs 同類物的儀器檢出限為0.04～0.60ng/g,方法檢出限為0.13～1.80ng/g,同樣對7 份5ng/g Cl/Br-PAHs 標準溶液使用GC-MS 進行重復測定,得到GC-MS 方法的RSD 在0.52%～15.32%之間,具體結果見表4.

同GC-MS 方法相比,GC-ECD 方法對多數Cl/Br-PAHs 同類物上具有相近的檢出限.但對于部分Cl-PAHs 同類物,GC-ECD 方法的檢出限要高于GC-MS 方法.總體而言,GC-ECD 和GC-MS 方法在環境土壤樣品中的Cl/Br-PAHs 定量分析均可滿足實驗要求.但相比于GC-MS 方法,GC-ECD 方法具有較低的操作和維護成本,設備相對更加簡單和穩定,因此考慮到整體的分析成本、操作復雜性和設備維護等因素,在滿足多數Cl/Br-PAHs 同類物分析的靈敏度和準確性條件下,GC-ECD 方法是一種更為實用且更易于普及的選擇.

2.5 紅樹林濕地土壤樣品的測定

在上述樣品前處理方法和GC-ECD 分析條件下,測定了2022年7月采自廣西欽州市紅樹林濕地的土壤樣品,分析了5 個采樣點的7 種Cl-PAHs 和11 種Br-PAHs 的污染狀況,每個土壤樣品重復測定3 次,以平均值代表該采樣點Cl/Br-PAHs 的污染水平,結果如圖6a所示,5 個采樣點Cl/Br-PAHs 總濃度分別為 163.24,195.82,244.45,235.31,180.91ng/g dw,5 個采樣點幾乎都表現出Cl-PAHs的濃度高于Br-PAHs 的特征(圖6b).18 種Cl/Br-PAHs 的單體濃度范圍分別為 n.d.～36.64,n.d.～33.21,n.d.～53.91,n.d.～131.21,n.d.～104.55ng/g dw(表5),與深圳茅洲河表層底泥(3.0～285ng/g)[6]和中國浙江臺州地區某電子垃圾拆解廠附近土壤(13.2～278ng/g)[25]中的Cl/Br-PAHs 的濃度水平相當.本研究中,18 種Cl/Br-PAHs 的平均濃度最高的2種單體為9-氯蒽(45.62ng/g)和2-氯菲(45.33ng/g).結合研究區域周邊曾有多家水泥廠、金屬加工廠和大量的垃圾焚燒和非法伐木行為以及紅樹林濕地土壤的理化性質(表 6),推測該區域較高的Cl/Br-PAHs 污染程度主要是由于水泥窯生產和垃圾焚燒的Cl/Br-PAHs 排放以及紅樹林濕地土壤對Cl/Br-PAHs 較強的積累能力,這與先前的研究報道9-氯蒽和2-氯菲的主要來源是水泥窯生產和垃圾焚燒是相符合的[27].盡管本研究為該區域Cl/Br-PAHs 的污染提供了初步的科學數據,但由于樣本量有限,尚不能明確指出其主要的污染來源.未來研究計劃將擴大采樣范圍,并進行更為細致和深入的分析,以準確識別和量化該地區 Cl/Br-PAHs 的污染來源.

表5 5 個采樣點土壤中Cl/Br-PAHs 的單體濃度(ng/g)Table 5 Concentration of Cl/Br-PAHs in soil(ng/g)at five sampling sites

表6 5 個采樣點土壤的基本理化性質Table 6 Basic physicochemical properties of soil at the five sampling sites

圖6 土壤中Cl/Br-PAHs 的總濃度和土壤中Cl/Br-PAHs 濃度對比Fig.6 Comparison of total Cl/Br-PAHs concentrations and Cl/Br-PAHs contrast in soil concentration in soil

3 結論

3.1 建立了GC-ECD 分析紅樹林土壤中18 種Cl/Br-PAHs 的方法,探究了土壤樣品的前處理方法,確定了以乙酸乙酯:二氯甲烷:正己烷(1:2:2)為提取溶劑,以及C18 固相萃取柱進行凈化的超聲提取-固相萃取前處理條件.

3.2 以GC-MS 方法為參照,驗證了本研究的方法的可行性.該方法具有較高的靈敏度和穩定性,可以滿足土壤樣品中土壤樣品中的Cl/Br-PAHs 的分析檢測要求.

3.3 利用該方法測定了廣西欽州市紅樹林濕地土壤樣品中Cl/Br-PAHs 的污染水平,除2-氯蒽和2,7-二氯芴外,其余Cl/Br-PAHs 均有檢出.