全氟烷基酸在大型溞體內的競爭富集作用及機制

肖 璐,張尚偉,程 浩,于丹鳳,姜曉滿,胡蝶旋,文 武*,夏星輝(.北京師范大學珠海校區理工實驗平臺,廣東 珠海 59087；.北京師范大學環境學院水沙科學教育部重點實驗室,北京 00875；.北京師范大學環境與生態前沿交叉研究院,廣東 珠海 59087；4.中南林業科技大學環境科學與工程學院,湖南 長沙 40004)

全氟烷基酸(PFAAs)是一類人工合成的含氟有機化合物,作為一類碳鏈上的氫原子全部被氟原子取代的新污染物,PFAAs 通常是由其前體全氟及多氟化合物(PFAS)在環境中轉化形成的穩定產物,因此被稱為末端PFAS[1-2].由于以全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)為代表的典型長鏈PFAAs(全氟碳原子數超過6 個)具有優秀的理化特性,從20世紀50年代被廣泛應用于生產生活的眾多領域[3],致使其成為一類全球性有機污染物[4-6].研究發現,長鏈PFAAs 表現出肝臟毒性、生殖毒性、發育毒性和內分泌干擾效應等多種生物毒性效應和較高的生物累積潛力[6-8],并與人體疾病具有一定的相關性[6,9].因此,長鏈PFAAs 逐步在全球范圍內被淘汰或限制生產和使用.但以全氟丁酸(PFBA)和全氟丁基磺酸(PFBS)為代表的碳鏈更短、功能相近的替代品開始被生成和使用,并在環境中被廣泛檢出,甚至成為環境介質中的主要PFAAs[10-14].據估計,在1951～2015年間全氟羧酸(C4～C14)的全球排放總量約為2160～21400t,而在2016～2030年間可能達到20～6420t[15].由于碳氟鍵極高的鍵能,導致這些污染物在環境中具有極強的生物穩定性.到目前為止,仍然沒有有效的數據證明這些污染物可在自然環境中被生物降解[16-18].因此,長鏈和短鏈PFAAs 將在環境介質中普遍同時存在,然而有關這些污染物之間的相關作用對生物影響的研究仍然十分有限.

自2001年首次在野生動物中檢測到PFAAs 以來[16,19],大量研究證明這些污染在世界各地(甚至偏遠的北極地區和人跡罕至的青藏高原地區)各種野生動物中廣泛存在,包括無脊椎動物(如浮游動物、貝類、蝦類、片腳類等)、魚類、鳥類、爬行動物、兩棲動物和哺乳動物等[6,13,16,20-22].近些年來,這些PFAAs 在人體中有檢出的報道也越來越多[23-26].然而,有關短鏈PFAAs 在生物體內檢出頻率和生物累積系數不高.研究發現,當長鏈和短鏈PFAAs 共存時,短鏈PFAAs 在斑馬魚體內的含量受到長鏈的明顯抑制,且該作用隨暴露時間等增加呈現先增強后趨于穩定的趨勢[27].據此推測長鏈與短鏈PFAAs 的競爭富集作用可能是導致短鏈PFAAs 在生物體內檢出率和生物累積系數相對較低的原因之一.雖然這種競爭富集作用在高等級的硬骨魚體內有明顯的表現,但在等級較低、生理結構相對較簡單的浮游動物體內是否也有相似的現象目前還不清楚.

為了驗證長鏈和短鏈PFAAs 在浮游動物大型溞(Daphnia magna)體內的競爭富集作用,本研究選擇6 種典型長鏈PFAAs(包括C8～C12 全氟羧酸和PFOS)和5 種短鏈PFAAs(C4～C7 全氟羧酸和PFBS)作為目標污染物,以大型溞為實驗對象,通過長鏈PFAAs 存在和不存在條件下的暴露實驗比較,分析PFAAs 在大型溞體內生物富集動力學參數和生物濃縮系數與PFAAs 理化性質的相關關系,剖析長鏈PFAAs 對短鏈PFAAs 上述指標影響,探討長鏈PFAAs 對短鏈PFAAs 生物富集的競爭富集作用及其相關機制,以期為全面厘清PFAAs 的環境行為和準確評價PFAAs 的生態環境效應及風險提供理論和數據支持.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

11 種目標污染物包括C4-C12 直鏈全氟羧酸以及全氟磺酸PFBS 和PFOS,純度高于95%,購自Matrix Scientific Trade、Tokyo Chemical Industries以及Acros Organics 等公司.4 種回收率指示劑包括13C4-PFBA(MPFBA,99%)、13C4-PFOA(MPFOA,99%)、13C4-PFBA(MPFOS,99% 和13C4-PFDoA(MPFDoA,99%),購自Wellington Laboratories 公司.色譜純甲醇和乙腈購自J.T.Baker of Phillipsburg 公司;甲基叔丁基醚(MTBE,99.5%)購自Acros Organics公司;四丁基硫酸氫氨(TBA,99%)購自百靈威公司;醋酸銨(色譜純)、冰醋酸(色譜純,>99.8%)和氨水(色譜純,～50% v/v)購自Alfar 公司;超純水(18.2M?)由Milli-Q Advantage A 10 系統(美國,Millipore)提供.0.22μm 尼龍濾膜購自Agilent Technologies 公司;Oasis WAX 6cc(150/500mg)固相萃取(SPE)柱購自Waters 公司.

1.2 實驗設計

將用于污染物暴露實驗的聚丙烯燒杯分成三組.第一組為對照組,暴露液中不添加任何PFAAs.第二組為短鏈PFAAs 暴露組,暴露液中添加5 種短鏈PFAAs,總濃度為50μg/L(每種PFAA濃度為10μg/L).第三組為5 種短鏈和6 種長鏈PFAAs 的暴露組,總濃度是110μg/L(每種PFAA 濃度為10μg/L).每個燒杯中放入300 只實驗室培養的健康活潑的成年大型溞.生物富集實驗持續14d.在整個暴露期內,每個燒杯中的暴露液在每天喂食2h 后完全更換,繁殖的幼溞撈出棄用.對照組和暴露組操作完全相同.對照組和暴露組每組均設置3 個重復.

在實驗開始和結束以及暴露24h 的換水前、后,從每個燒杯中采集50mL 水樣,用以監測暴露液中PFAAs 的實際濃度.在第1,3,7,12,24,36,48,72,120,168 和336h 分別從每個燒杯中采集10 只大型溞,用以分析PFAAs 在大型溞體內的含量.采集的大型溞立即用超純水沖洗以除去采樣時大型溞體表攜帶的暴露液,并置于濾紙上吸干大型溞體表水分,然后稱量其濕重,置于5mL 聚丙烯離心管中勻漿以備后續分析.

1.3 樣品前處理方法

暴露液中PFAAs 的萃取和凈化采用固相萃取法進行樣品的富集和凈化,生物樣品采用離子對法萃取,并結合固相萃取法進行凈化[28].

1.4 儀器分析方法

樣品中PFAAs 含量用高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀測定.其中,液相系統為UPLC Nexera XR LC-20AD系列液相色譜儀(Shimadz,Japan),配備二元梯度泵和自動進樣器,分離柱為 BEH C18(1.7μm,2.1mm × 100mm,Waters,USA).進樣體積是2μL.流動相為水(含5mmol/L 乙酸銨)和甲醇,流速為0.2mL/min.流動相梯度淋洗程序為:初始甲醇比例為30%,持續1min,然后在4min 內上升至85%,接著在3min 內上升至100%并保持5min,然后在0.5min內回復到初始狀態(30%甲醇)并穩定3min.質譜系統為AB 4500 三重四級桿串聯質譜檢測系統(Applied Biosystems 4500,Singapore),配備電噴霧離子源.使用多反應監測模式對PFAAs 進行定量分析.儀器離子源參數和質譜檢測條件分別見表1、表2.

表1 ESI-MS/MS 離子源參數Table 1 Parameters of ion source for AB 4500 ESI-MS/MS

表2 質譜檢測條件Table 2 MS detector condition for AB 4500

1.5 質量保證和質量控制

目標化合物的MQLs 定義為信噪比(S/N)的10倍,基于基質和完整的前處理程序計算獲得,水樣和生物樣品的MQLs 范圍分別為0.0093～0.063ng/L 和0.42～3.9ng/g.樣品中PFAAs 的含量使用外標法定量,標準曲線線性范圍為0～200μg/L.曲線相關系數均高于0.99.樣品測定過程中,為避免背景污染和確保儀器穩定性,每測定10 個樣品后插入1 個溶劑空白和1 個標準樣品.當標準樣品測定值與理論值相比超過±20%時,重新繪制標準曲線.為確保樣品的萃取效率和測定的準確性,分別水樣和生物樣品進行加標回收率實驗.結果表明,水樣和生物樣中不同碳鏈長度的 PFAAs 加標回收率分別為(75.2%±3.2%)～(105%±14.8%)和(77.5%±5.4%)～(101%±4.9%).換水前后暴露液中的PFAAs 濃度沒有發生顯著變化(P>0.05)(表3),這表明生物富集實驗過程中暴露液濃度基本保持穩定.

表3 大型溞暴露液中全氟烷基酸濃度(μg/L)Table 3 Concentrations of PFAAs in the exposure water for D.magna(μg/L)

表4 不同條件下大型溞體內PFAAs 的動力學參數及生物濃縮系數(平均值±標準偏差,n=3)Table 4 Bioconcentration kinetic parameters and BCFss of shorter chain PFAAs in D.magna in the absence and presence of longer chain PFAAs(mean±SD,n=3)

2 結果與討論

2.1 PFAAs 在大型溞體內的生物富集作用

2.1.1 只有短鏈PFAAs 暴露條件下,PFAAs 在大型溞體內的生物富集動力學參數與生物濃縮系數.如圖1所示,無長鏈PFAAs時,短鏈PFAAs在大型溞體內的含量隨暴露時間的增加先快速升高,最后在3～5d 左右達到穩定狀態.根據各時間點短鏈PFAAs 在大型溞體內的含量,通過兩箱動力學模型計算短鏈PFAAs 在大型溞體內的生物富集動力學參數[29-30]:

圖1 PFAAs 在大型溞體內的富集動力學曲線Fig.1 Bioconcentration curves of PFAAs in D.magna

式中:Cb為大型溞體內的PFAAs 濃度,ng/gww;Cw為暴露液中PFAAs 濃度,ng/mL;ku0為組織中PFAAs 的吸收速率常數,L/(kgww?d);ke0為組織中PFAAs 的排出速率常數,d-1;下標“0”表示無長鏈PFAAs 暴露時的動力學參數.

生物富集動力學參數擬合結果如表 4所示.BCFss表示當短鏈PFAAs 在大型溞體內的生物富集達到穩定狀態時,大型溞體內PFAAs 含量與暴露液濃度的比值.短鏈PFAAs 在大型溞體內的ku0和BCFss值均隨全氟碳原子數的增加而增加,且呈顯著線性正相關關系(圖2).PFBS 的ku0和BCFss值均高于與其具有相同全氟碳原子數(C-F=4)的PFPeA,這與其他有關長鏈PFAAs 在水生生物體內生物富集的研究結果一致[28,31-32].這表明,PFAAs 自身理化性質對其在水生生物體內生物富集的影響相似,即全氟碳原子數和酸性基團類型是決定PFAAs 生物富集的重要因素.

圖2 無長鏈PFAAs 時,全氟碳原子數與生物富集參數之間的相關關系Fig.2 Relationships between numbers of perfluorinated carbonand and bioconcentration factors in the absence of longer chain PFAAs

2.1.2 長鏈和短鏈PFAAs 共同暴露條件下,PFAAs在大型溞體內的生物富集動力學參數與生物濃縮系數.當長鏈PFAAs 存在時,長鏈和短鏈PFAAs 在大型溞體內生物富集曲線如圖1所示.短鏈PFAAs在大型溞體內的含量先快速升高,達到峰值后開始下降,最終在第7d 左右達到穩定狀態.短鏈PFAAs生物富集達到穩定狀態所需的時間比沒有長鏈存在條件下有所增加.這與長鏈和短鏈PFAAs 共同暴露時,短鏈PFAAs 在斑馬魚各組織中的生物富集曲線的變化規律相似[27].長鏈PFAAs 存在條件下,短鏈PFAAs 在大型溞體內的生物富集動力學參數計算分為2 個階段:上升階段和下降階段.短鏈PFAAs 上升階段和長鏈PFAAs 的生物富集動力學參數按式(2)計算:

式中:ku1[mL/(gww?d)]表示長鏈PFAAs 全階段和短鏈PFAAs 在上升階段的吸收速率常數;ke1(d-1)表示長鏈PFAAs 全階段和短鏈PFAAs 在上升階段的消除速率常數.下降階段大型溞體內短鏈PFAAs 的生物富集動力學參數按式(3)計算:

式中:ku2[mL/(gww?d)]和 ke2(d?1)分別是存在長鏈PFAAs 暴露時短鏈PFAAs 在下降階段的吸收速率常數和消除速率常數;Cpeak(ng/gww)和T(d)分別是短鏈PFAAs 在大型溞體內達到峰值的含量和時間,且t1

長鏈PFAAs 存在條件下,PFAAs 的動力學參數和 BCFss結果如表 4所示.可見,與只有短鏈PFAAs 暴露時相似,短鏈和長鏈PFAAs 在大型溞體內的ku1、ku2以及BCFss值均隨全氟碳原子數的增加而增加,且呈顯著線性正相關關系,但ke1與全氟碳原子數呈顯著線性負相關關系(圖3).全氟磺酸的上述指標都高于與其具有相同全氟碳原子數的全氟羧酸.

圖3 長短鏈PFAAs 暴露下,生物富集動力學參數、生物濃縮系數與全氟碳原子數的相關關系Fig.3 Relationships between numbers of perfluorinated carbon,bioconcentration kinetic parameters and bioconcentration factors in the present of longer and shorter chain PFAAs

PFAAs 是一類同時具有疏水性碳氟鏈和親水性酸性基團的污染物.研究認為,PFAAs 在生物體內的富集主要有2 種機制.一種是PFAAs 在細胞膜磷脂上的分配作用[18,33-35].該理論的基礎是帶電分子與磷脂的親和力比中性分子相對更高[7,33,36-37].在生物體中,磷脂是組成生物膜的重要成分,構成了一個重要的與帶電或部分帶電分子非特異性結合的庫.PFAAs 與磷脂的非特異性結合的強弱也與PFAAs 的全氟碳原子數相關,且隨全氟碳原子數的增加而增加[38].基于該理論建立的可離子化有機物的生物富集預測模型可成功預測包括長鏈PFAAs在內的多種有機酸類物質在生物整體(非組織)中的生物濃縮系數[18].通過對PFAAs 在大型溞體內富集的ku和BCFss分別與辛醇-水分配系數和膜-水分配系數的相互關系分析發現,無論是只有短鏈PFAAs暴露(圖4a～d),還是長鏈和短鏈PFAAs 共同暴露(圖4e～h),上述指標與分配系數之間均呈顯著正相關關系),這與其他研究結果一致[32,39].

圖4 PFAAs 在大型溞體內的生物富集動力學參數、生物濃縮系數、辛醇-水分配系數和膜-水分配系數[32,40]的相關關系Fig.4 Relationships between octanol-water partition coefficients,membrane-water distribution coefficients,bioconcentration kinetic parameters,bioconcentration factors in the absence longer chain PFAAs

PFAAs 生物富集的另一種機制是PFAAs 與蛋白質之間的相互作用[6,41].研究認為PFAAs 與生物內源性脂肪酸具有形態和功能的相似性,能夠激活某些基因、蛋白質和信號通路[42-46].大量研究已經證明PFAAs 能與多種生物的多種蛋白質結合,如血清白蛋白、肝臟脂肪酸結合蛋白、陰離子轉運蛋白、甲狀腺素轉運蛋白以及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)α、β/δ、γ 等,并且它們之間的相互作用一方面對生物產生內分泌干擾效應,另一方面對PFAAs 的生物富集和組織分布有著重要作用[7,42,45,47-48].離體實驗和基于分子對接的計算機模擬分析發現人類和魚類蛋白質與PFAAs 的結合親和力隨全氟化碳原子數的增加而明顯增強,但當全氟碳原子數超過9 后與蛋白質的結合系數明顯降低[28,49].通過對PFAAs(C4～C9)在大型溞體內富集的ku1和BCFss分別同PFAAs 與蛋白質結合系數(Ka)的相互關系分析發現,ku1和BCFss分別與Ka呈顯著正相關關系(圖5).分子對接分析發現,當與肝脂肪酸結合蛋白結合時,PFAAs 的磺酸基與結合蛋白結合位點的氨基酸殘基形成的氫鍵數比羧基多1 個[28,49-50],這可能是全氟磺酸在生物體中具有更高的吸收速率和生物富集能力的原因之一.

圖5 長短鏈PFAAs 暴露下,PFAAs 在大型溞體內的吸收速率常數、生物濃縮系數與PFAA-蛋白質結合系數[28]的相關關系Fig.5 Relationships between PFAA-protein binding affinities,uptake rate constants and bioconcentration factors in the presence of longer and shorter chain PFAAs

2.2 長鏈PFAAs 對大型溞體內短鏈PFAAs 生物富集的影響

比較長鏈PFAAs 存在和不存在2 種條件下短鏈PFAAs 在大型溞體內的生物富集動力學曲線,發現長鏈PFAAs 存在時,其曲線明顯更低,并在達到峰值后這種差距更明顯.比較2 種條件下的動力學參數,發現長鏈PFAAs 存在條件下短鏈PFAAs的ku1和ku2均比無長鏈PFAAs 條件下的ku0低,且兩者的降低比例隨全氟碳原子數的降低而增加(表5).即PFAAs 碳鏈越短吸收速率常速降低程度越大.當富集達到相對穩定狀態后,長鏈PFAAs 存在條件下的BCFss值也比無長鏈存在下有明顯降低.這表明,長鏈PFAAs 對短鏈PFAAs 的吸收和生物富集有抑制作用.另外,ku2的降低比例比ku1大,這說明可能是隨著暴露時間的增加,長鏈PFAAs在大型溞體內的富集量逐漸增加,短鏈PFAAs 在大型溞體內的吸收速率受到的抑制作用逐漸增強,導致短鏈PFAAs 在下降階段ku2的降低比例大于ku1.

表5 長鏈PFAAs 存在條件下,大型溞體內短鏈PFAAs 吸收速率常數和生物濃縮系數(ku1、ku2 和BCFss)比無長鏈存在條件下的相關參數(ku0 和BCFss)降低的比例(%)Table 5 Decreased proportion of uptake rate constants and bioconcentration factors of shorter chain PFAAs in the presence of longer chain PFAAs in D.magna compared with those in the absence of longer chain PFAAs(%)

PFAAs 與蛋白質之間相互作用本質上是PFAAs 與蛋白質結合點位的氨基酸殘基之間的相互作用,并且蛋白質的結合點位形成的“口袋”和PFAAs 碳鏈之間的疏水作用在PFAAs 的結合中起著關鍵作用[48,51].通過分子對接分析發現,PFAAs與蛋白質結合時,其全氟碳鏈延伸到蛋白質形成的疏水“口袋”內部,從而與其周圍非極性的氨基酸殘基形成疏水接觸,其結合力大小具有全氟鏈長的依賴性[7,28,49-51].對PFAAs 與蛋白質結合的空間構象分析發現,短鏈 PFAAs,特別是 PFBA 和PFBS,由于其全氟碳鏈很短,整個分子幾乎僅結合在袋口位置,發生疏水接觸的氨基酸殘基十分有限;但隨著全氟碳鏈長度的增加,疏水性全氟碳鏈逐漸深入“口袋”內部,與更多的氨基酸殘基發生疏水接觸,增加其結合力[28].PFAAs 與蛋白質的競爭吸附實驗發現,長鏈PFAAs 可取代蛋白質上吸附的短鏈PFAAs,且短鏈PFAAs 的全氟碳原子數越少取代作用越顯著[28].因此,可以推測,長鏈與短鏈PFAAs 的競爭富集作用可能存在兩條途徑.一是PFAAs 在大型溞體內的吸收和排出過程中的競爭作用.二是PFAAs 進入大型溞體內后在貯存點位的競爭作用.當只有短鏈PFAAs 暴露時,PFAAs之間不存在競爭(或者短鏈PFAAs 之間的競爭作用很弱),每種PFAA 可以“自由”地被大型溞吸收、排出和累積在體內.但是在長鏈與短鏈PFAAs 共同暴露時,由于競爭作用,大型溞吸收、排出和累積短鏈PFAAs 時均受到長鏈PFAAs 的競爭,導致短鏈PFAAs 的ku1、ku2和累積量均比只有短鏈PFAAs暴露條件下的值更低.特別是隨著暴露時間增加(下降階段),長鏈與短鏈PFAAs 的競爭作用加劇,相對于只有短鏈PFAAs 暴露或長鏈和短鏈PFAAs共同暴露的上升階段的短鏈PFAAs 的ku2、ke2和BCFss的降低比例更大.例如,暴露第7d,長鏈和短鏈PFAAs 共同暴露條件下,PFBA 的吸收速率ku1比只有短鏈PFAAs 暴露的ku0降低45%;暴露第14d,吸收速率降低65%.總體而言,競爭富集作用導致短鏈PFAAs 的吸收速率常數和穩定狀態下的生物濃縮系數明顯降低,分別為8%～65%和56%～80%.

可見,長鏈和短鏈PFAAs 在大型溞體內的生物富集存在競爭作用,而且這種作用隨大型溞體內長鏈PFAAs 含量的增加而增強.這與此前研究的斑馬魚體內PFAAs 的生物富集作用相似[27].這表明,在復雜的自然環境中短鏈PFAAs 可能因污染物之間的競爭作用導致在生物體內含量水平和檢出率降低.因此,在全面評價全氟碳鏈長度PFAAs 的生態環境效應和風險時不應該忽視污染物之間的競爭作用.

3 結論

3.1 PFAAs 在大型溞體內生物富集的吸收速率常數和穩定狀態下的生物濃縮系數與全氟碳原子數顯著正相關,且具有相同全氟碳原子數的全氟磺酸的吸收速率常數和生物濃縮系數明顯高于全氟羧酸.

3.2 長鏈和短鏈PFAAs 在大型溞體內發生競爭富集,競爭強度隨大型溞體內長鏈PFAAs 含量的升高而增強.競爭富集作用導致短鏈PFAAs 的吸收速率常數和穩定狀態下的生物濃縮系數明顯降低,分別為8%～65%和56%～80%.