納米銀對銅綠微囊藻生物毒性的電荷效應

雍玲麗,陳猷鵬,郭勁松,方 芳,孫壯壯,晏 鵬(重慶大學環境與生態學院,重慶 400045)

近幾十年來,淡水藍藻有害藻華(CyanoHABs)在全球范圍內顯著增加[1-2].大部分藍藻會產生藻毒素,危害水生生物和人類健康[3].水體環境中的營養物質(氮、磷)、溫度、pH 值和鹽度對藍藻的增殖有顯著影響[4].目前,人類活動的加劇導致一些新興污染物進入水生環境,如納米顆粒[5].一些研究報道,納米顆粒可以抑制藍藻的生長和增殖[6-8].但是,其抑制機制尚不清楚.銀納米顆粒(AgNPs)作為代表性納米顆粒,廣泛存在于水生環境中,據估計,水環境中銀納米顆粒的濃度在納克/升到毫克/升之間[9].AgNPs 可引起細胞膜破壞、氧化損傷和蛋白質變性,進而抑制細胞增殖.AgNPs 釋放的Ag+離子和內化的AgNPs對藍藻細胞的生物毒性在以往的研究中已被廣泛報道[10-11].這些研究大多集中在AgNPs 的濃度、大小和形態對藍藻的毒性作用[12-14].AgNPs 的表面性質,如電位、親水性和表面官能團等,尤其是表面電荷[15]也顯著地影響納米顆粒對微生物的生物毒性.研究表明,水環境中AgNPs 表面電荷以正電荷和負電荷兩種形式存在[16-17].AgNPs 表面電荷會影響其聚集性和吸附性,進而影響顆粒的生物毒性[18-19].El Badawy等[20]研究發現,帶負電荷的AgNPs和芽孢桿菌細胞之間存在高度排斥,形成了限制細胞-顆粒相互作用的靜電屏障.帶正電荷的AgNPs 與大腸桿菌間較大的電荷差造成了對大腸桿菌較高的毒性[15].遺憾的是,很少有研究關注AgNPs 對藍藻生物毒性的電荷效應,藍藻如何響應和適應不同表面電荷AgNPs 的生物脅迫尚不清楚.銅綠微囊藻(M.aeruginosa)是水生環境中最常見的有害藍藻之一.支鏈聚乙烯亞胺和檸檬酸鹽作為常用的納米顆粒的涂層/穩定劑,能夠有效分散納米顆粒,在本研究中,這兩種涂層材料修飾的AgNPs 表面分別帶有穩定的正電荷和負電荷.本研究通過研究不同表面電荷的AgNPs 對銅綠微囊藻生長狀態、生理代謝特性和微觀結構的影響,以期揭示AgNPs 對銅綠微囊藻生物毒性的電荷效應.研究結果將為AgNPs 對藍藻銅綠微囊藻的生物毒性提供參考.

1 材料與方法

1.1 表征及暴露實驗

支鏈聚乙烯亞胺包覆的AgNPs(BPEI-AgNPs,(15.23±2.17)mV)和檸檬酸鹽包覆的 AgNPs(Citrate-AgNPs,(?14.36±4.21)mV)由北京德科納米科技有限公司生產.兩種AgNPs 的平均粒徑為50nm,均具有光滑的球形外觀和均勻的粒徑分布.

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa,FACHB-132)來源于中國科學院武漢水生生物研究所(中國武漢).將處于指數生長期的銅綠微囊藻接入盛有新鮮BG1-11 培養基的500mL 無菌錐形燒瓶中(初始藻密度約為1.5×106cells/mL),再分別加入新鮮制備的NPs 母液(經600W 超聲處理30min 后使用),使錐形燒瓶中NPs 最終暴露濃度分別為0(對照),0.05,0.2和0.5mg/L.每組設3 個平行試驗組,培養周期為16d,實驗過程培養條件為:25°C,光照強度4000lx,光暗比12h:12h.本研究中所選取的AgNPs 暴露濃度是既考慮了實際環境濃度范圍,同時結合了先前研究所選擇的濃度條件[21-23].整個給藥過程在無菌操作臺下進行.

1.2 生理代謝特性分析

通過測量藻液在680nm 波長處的OD 值(OD680)來測定藻細胞密度.采用流式細胞儀(FACSVantageSE,BD,美國)檢測藻細胞凋亡情況.利用多脈沖調制葉綠素熒光儀(Phyto-PAM,Walz,Effeltrich,德國)計算和測量光合反應過程中光系統(PSII)過程的最大光能轉換效率(Fv/Fm)和最大相對電子轉移速率rETRmax.

將藻細胞經超聲波細胞破碎儀(JY 92-IIN,650W,4s-4s)冰浴破碎5min 后用丙二醛檢測試劑盒(A003-1-2,南京建成生物工程研究所,中國)測定樣品中丙二醛含量.

藻細胞胞外聚合物(EPS)通過熱提法提取,利用硫酸-蒽酮法測定EPS 中多糖的含量,EPS 中的蛋白用蛋白含量測定試劑盒(P930077-100T/EA,上海麥克林生化科技有限公司,中國),最后用酶標儀測定562nm 處吸光度并計算蛋白含量.多糖和蛋白的總和為EPS 含量.

用10kDa 過濾器(Millipore,德國)和電感耦合等離子體發射光譜(ICP-OES,Thermo,Bremen,德國)提取并測定AgNPs 在培養液中釋放的Ag+離子含量,胞內Ag+離子含量測定需先對藻液樣品進行前處理,包括藻液離心、清洗藻泥、超聲破碎后再離心10min,得上清液進行測定.

利用掃描電子顯微鏡(DM 2000,LEICA,Wetzlar,德國)和透射電子顯微鏡(JEM-2100,JEOL,Tokyo,日本)觀察藻類細胞表面微觀形貌和內部結構的變化[24].

1.3 RNA 提取和轉錄組學分析

根據制造商的說明(Invitrogen,Carlsbad,CA,美國),使用Trizol 試劑從銅綠微囊藻樣品中提取總RNA,分別使用 Agilent Bioananlyzer 2100(Santa Clara,CA,美國)和Nano Photometer?分光光度計(IMPLEN,CA,美國)對總RNA 的完整性和純度進行檢測.之后利用Illumina平臺生成的數據進行生物信息學分析.所有分析均使用上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺(cloud.majorbio.com)進行,使用edgeR、DESeq2 和DESeq 軟件進行基因差異表達分析.

1.4 統計分析

所有實驗過程和結果的測定重復3 次,然后使用IBM SPSS Statistics 26 軟件進行顯著性分析,數據以平均值±標準差表示,以P<0.05 為顯著性差異.

2 結果與討論

2.1 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻生長和光合活性的影響

藻細胞密度是反映藻細胞生長情況的基本指標之一.對照組銅綠微囊藻細胞密度逐漸增大,而AgNP組細胞密度先增大后減小(圖1A 和1B).此外,3 種濃度下的BPEI-AgNPs 在第2d 均對銅綠微囊藻生長呈現顯著抑制(P<0.05),而3 種濃度的Citrate-AgNPs 在第6d 均顯著抑制藻細胞生長(P<0.05).6d 后,Citrate-AgNP組銅綠微囊藻生長抑制率大于BPEI-AgNP組.這表明BPEI-AgNPs 在早期對銅綠微囊藻的生長有較強的抑制作用,而Citrate-AgNPs 在后期的抑制作用更大.與相同濃度的BPEI-AgNPs 相比,0.05,0.2 和0.5mg/L Citrate-AgNPs 對藻細胞生物量的最大抑制率分別高48.73%,83.57%和96.8%,說明帶負電荷的AgNPs 對銅綠微囊藻的生長抑制作用比帶正電荷的AgNPs 更強.

圖1 AgNPs 對銅綠微囊藻藻密度和光合作用參數的影響Fig.1 Effects of AgNPs on algal density and photosynthetic parameters of M.aeruginosa

Fv/Fm是最大光化學效率,rETRmax通常用來表征光合作用的最大電子傳遞速率,兩者都是表征藻類細胞光合系統II活性的常用指標[25].AgNP處理組的Fv/Fm低于對照組,說明銅綠微囊藻的光合活性受到抑制(圖1C).BPEI-AgNPs 在前期對光合系統II 抑制作用更強,而Citrate-AgNPs 在后期抑制作用更為顯著.此外,對于Fv/Fm的最大抑制率,0.05,0.2 和0.5mg/LCitrate-AgNP 組分別比同濃度BPEI-AgNP 組高17.72%,22.2%和34.24%.同時0.05,0.2 和0.5mg/L BPEI-AgNP 組的rETRmax峰值分別為12.05,13.20 和9.72μmol/(m2·s),Citrate-AgNP 組的rETRmax峰值分別為11.90,10.06和8.25μmol/(m2·s)(圖1D),這表明銅綠微囊藻暴露于帶負電荷的AgNPs 下具有較低的能量代謝活性.

2.2 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻的氧化損傷

丙二醛(MDA)是脂質過氧化的產物,可以指示細胞被AgNPs 氧化損傷的程度[26].暴露于兩種AgNPs 后,銅綠微囊藻細胞內MDA 含量均高于對照組(圖2A 和2B),說明AgNPs 的加入導致銅綠微囊藻細胞膜脂質過氧化,破壞膜的流動性、通透性和細胞膜的完整性[11].隨著暴露時間延長,BPEIAgNP 處理組MDA 含量先升高后穩定,Citrate-AgNP 處理組MDA 含量一直升高.此外,各濃度Citrate-AgNP 組的 MDA 峰值含量最終均高于BPEI-AgNP 組,其中,0.5mg/L Citrate-AgNP 組的丙二醛(MDA)含量峰值(100.8nmol/mgprot))是同濃度BPEI-AgNP 組(82.5nmol/mgprot)的1.22 倍.這說明Citrate-AgNPs 造成了更大的氧化損傷.

圖2 AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的MDA,EPS 和胞內外Ag+含量變化情況Fig.2 The changes in MDA,EPS,and intracellular and extracellular Ag+ content in M.aeruginosa under AgNPs exposure

胞外聚合物(EPS)常被用作藻細胞抵抗環境脅迫的方式之一,其含量可間接指示藻細胞所受脅迫的程度.暴露于這兩種AgNPs 的銅綠微囊藻細胞分泌明顯更多的EPS(P<0.05),且EPS 含量與AgNPs濃度基本呈正相關(圖2C),這表明BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 都會引起銅綠微囊藻的應激反應且應激反應程度具有劑量效應.于朋飛等[27]也發現銅綠微囊藻細胞可分泌胞外物質吸附細胞附近的AgNPs 顆粒.銅綠微囊藻在BPEI-AgNPs 作用下分泌的EPS 含量大于Citrate-AgNPs 作用下分泌的EPS 含量,第16d,0.5mg/L BPEI-AgNP 組的EPS 含量(32.21mg/gSS)是同濃度Citrate-AgNP 組(4.42mg/gSS)的7.29 倍.這說明銅綠微囊藻對BPEI-AgNPs更為敏感,分泌大量EPS 以減輕BPEI-AgNPs 的毒性.因此,銅綠微囊藻對帶正電荷的AgNPs 具有更強的耐受性,BPEI-AgNPs對銅綠微囊藻的生長抑制和細胞生理代謝損傷較低.

為進一步揭示不同表面電荷AgNPs 對銅綠微囊藻的影響,測定了0.5mg/L AgNP 處理組胞內外Ag+的釋放情況(圖2D).兩種AgNP 組中,胞內外Ag+含量隨暴露時間的增加而增加.此外,BPEI-AgNP 組胞內外Ag+含量在早期均較高,而Citrate-AgNP 組在后期均顯著升高.最終Citrate-AgNP 組胞內外Ag+含量分別為BPEI-AgNP 組的2.13 倍和1.63倍.Ag+含量的變化與銅綠微囊藻中MDA 含量和細胞損傷的變化一致,表明Ag+的釋放量在不同電荷下AgNPs 的毒性中起重要作用.

2.3 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻細胞形態的影響

通過SEM 觀察0.5mg/L 不同電荷AgNPs 作用下銅綠微囊藻的表面形貌,結果如圖3所示.BPEIAgNPs 聚集在銅綠微囊藻細胞表面(第4d)(圖3A),然而,未觀察到Citrate-AgNPs 吸附在銅綠微囊藻的表面,細胞表面也無明顯變化(第4d)(圖3B).這表明BPEI-AgNPs 可因靜電引力而吸附在帶負電荷的銅綠微囊藻細胞表面,進而可能導致掩蔽效應[28-29],使得早期BPEI-AgNPs 嚴重抑制了銅綠微囊藻對光能的吸收和利用.16d 后,暴露于BPEIAgNPs 的銅綠微囊藻細胞表面出現大量EPS,其中包裹著BPEI-AgNPs(圖3C),說明BPEI-AgNPs 刺激銅綠微囊藻分泌大量EPS,進而減輕了BPEIAgNPs 的毒性.暴露于Citrate-AgNPs16d 后,細胞表面皺縮、碎裂,細胞形態不完整(圖3D),這可能與處理后期 Citrate-AgNPs 引起的強烈的氧化損傷(MDA 含量激增)有關.透射電鏡也得到了類似的結果(圖3E 和3F).同時在藻細胞內部觀察到少量BPEI-AgNP,但未觀察到有Citrate-AgNPs 存在.此外,暴露于Citrate-AgNPs 后,銅綠微囊藻細胞表現出明顯的損傷(圖3E 和3F),這與Citrate-AgNPs 作用后期大量Ag+釋放到細胞中有關,大量Ag+進入銅綠微囊藻細胞后可能干擾酶活性中心,刺激了ROS 的產生[30],造成了比BPEI-AgNPs 更嚴重的細胞損傷.

圖3 AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖像Fig.3 Scanning electron microscope(SEM)and transmission electron microscope(TEM)images of M.aeruginosa under AgNPs exposure

2.4 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻細胞凋亡的影響

采用流式細胞術檢測兩種AgNPs 對銅綠微囊藻細胞凋亡的影響.Q3-UL、Q3-UR、Q3-LR 和Q3-LL 分別代表壞死區、晚凋區、早凋區和活菌區.對照組存活細胞比例從第 0d(96.84%)到第 16d(96.15%)基本保持不變,對照組壞死、早凋和晚凋區細胞比例均小于3%,從第0～16d 無明顯變化(圖4A和4B).16d 時,AgNP 處理組活細胞比例低于對照組,壞死和早凋細胞比例高于對照組.0.05,0.2 和0.5mg/LCitrate-AgNP 處理組的活細胞比例分別比BPEIAgNP 處理組低2.79%,16.14%和20.79%(16d).各濃度水平下,Citrate-AgNP 處理組的壞死細胞和早凋細胞比例均高BPEI-AgNP 處理組,說明在整個試驗周期內,Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻細胞的損傷更大,這與生物量的變化趨勢一致.

圖4 AgNPs 對銅綠微囊藻細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of AgNPs on apoptosis of M.aeruginosa cells

2.5 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的轉錄組

GO 富集分析結果顯示,BPEI-AgNPs 對銅綠微囊藻的影響主要涉及能量代謝、光合作用和胞外聚合物相關途徑(圖5A 和5B).其中,鐵硫簇結合途徑基因顯著富集(FDR=0.045),說明BPEI-AgNPs 顯著抑制了銅綠微囊藻光合作用和呼吸作用中的相關電子傳遞過程.此外,胞外聚合物代謝相關的糖胺聚糖代謝基因和肽聚糖代謝基因表達顯著上調,這可能是藻細胞減輕BPEI-AgNPs 毒性的機制之一.Citrate-AgNP 組差異基因的GO 富集分析結果如圖5C 和5D所示.光合色素合成和含卟啉化合物代謝相關基因表達量顯著下調(FDR<0.01),表明Citrate-AgNPs 干擾了銅綠微囊藻對光能的吸收利用.同時,呼吸通路相關基因表達量顯著下調(FDR<0.01),能量代謝受到Citrate-AgNPs 的嚴重影響.值得注意的是,與離子跨膜轉運蛋白活性相關的基因表達顯著上調(FDR=0.037).因此,后期大量Ag+進入銅綠微囊藻細胞,刺激SOD 活性增強以降低活性氧水平.

圖5 AgNPs 暴露下銅綠微囊藻差異基因GO 富集分析及KEGG 富集分析熱圖Fig.5 Heat maps of differential gene GO enrichment and KEGG enrichment in M.aeruginosa exposed to AgNPs

2.6 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的分子調控網絡

2.6.1 與光合作用和能量代謝相關的調控途徑 在BPEI-AgNP 和Citrate-AgNP 組中,分別有14個和15 個與卟啉和葉綠素代謝相關的基因下調(圖5E 和5F).rbcS 和rbcL 編碼了參與光合碳固定生成3-磷酸-D-甘油(PGA)的羧化過程[31-32].銅綠微囊藻中rbcS 的表達量在BPEI-AgNP(Log2FC=-1.04)和Citrate-AgNP(Log2FC=-1.12)組中顯著下調,rbcL 的表達量在 BPEI-AgNP(Log2FC=-2.04)和 Citrate-AgNP(Log2FC=-2.16)組顯著下調(圖6).同時,fbp、tktA 和prk 負責調節產生β-D-果糖6-磷酸(F6P)、D-酮糖-5-磷酸(RP)和核糖1,5-二磷酸(RuBP)的酶促反應,在Citrate-AgNP 組中,它們的下調幅度更大.por涉及調節丙酮酸(PYR)轉化為乙酰輔酶A過程,BPEI-AgNP(Log2FC=-2.31)和Citrate-AgNP(Log2FC=-2.75)組por 的表達水平均下調,Citrate-AgNP 組下調水平更高.在兩種AgNPs 脅迫下,cs 和pckA 表達水平分別上調和下調,草酰乙酸(OAA)濃度升高,從而向檸檬酸(CIT)轉化效率提高,這可能是銅綠微囊藻細胞應對兩種AgNPs 脅迫相同的補償策略之一.此外,BPEI-AgNP 組有其他補償方式:提高了pyk 的基因表達水平,增加了將磷酸烯醇丙酮酸(PEP)轉化為PYR的酶的表達,促進了PYR的合成.以上結果說明BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 抑制光捕獲和能量轉換,同時Citrate-AgNPs 的抑制率較高,可能與大量Ag+的侵入有關,最終導致銅綠微囊藻的生長受到明顯抑制.

圖6 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻光合作用、能量代謝和氧化應激途徑的KEGG 分析Fig.6 KEGG analysis of photosynthesis,energy metabolism and oxidative stress pathways in M.aeruginosa exposed to BPEI-AgNPs and Citrate-AgNPs

2.6.2 與氧化應激相關的調控途徑 暴露于兩種AgNPs 時,sod2 表達上調,且Citrate-AgNP 組上調幅度(log2FC=1.33)高于 BPEI-AgNP 組(log2FC=1.03)(圖6),說明兩種AgNPs 均刺激了銅綠微囊藻中SOD 酶的轉錄,Citrate-AgNP 組轉錄更多.而GPX 參與了過氧化氫轉化為分子水的過程,其表達量在BPEI-AgNP 和 Citrate-AgNP 組中均表現為下調.sod2 基因的上調和GPX 基因的下調導致藻類細胞中過氧化水平升高.結合第16d BPEI-AgNP 組和Citrate-AgNP 組MDA 水平的激增,我們推測暴露于兩種AgNPs 的銅綠微囊藻細胞受到了嚴重的氧化損傷,且Citrate-AgNP 組藻細胞損傷程度更大.

2.6.3 與細胞外聚合物合成相關的調控途徑 纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu)等氨基酸是細胞外蛋白(PN)的主要前體.pdhA、pdhB 和aceF 的表達調節了PEP 向Val和Leu 的轉化,它們在BPEI-AgNP 組的表達量均顯著上調(Log2FC>1)(圖7).相比之下,暴露于Citrate-AgNPs 后,銅綠微囊藻中 pdhB 的表達量上調(Log2FC=1.27),然而pdhA 和aceF 的表達量均有下調.尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDPGlcNAc)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和甘露糖6-磷酸(Man-6P)是胞外多糖的重要前體,其中glmM 和glmU 參與調節葡萄糖胺6-磷酸(GlcN-6P)向UDP-GlcNAc 的轉化.兩種AgNPs 均刺激glmM和glmU的表達,且BPEI-AgNP組上調幅度更大.ugd參與尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)向UDP-GlcA 的轉化,BPEI-AgNP 組(Log2FC=0.67)的ugd 表達上調幅度高于Citrate-AgNP 組(Log2FC=0.58).此外,編碼Man-6P 合成的 manA 表達在 BPEI-AgNP 組(Log2FC=1.13)中表現為上調,而在Citrate-AgNP 組(Log2FC=-1.15)中為下調.

圖7 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻氨基酸和氨基糖途徑的KEGG 分析Fig.7 KEGG analysis of amino acid and amino sugar pathways in M.aeruginosa exposed to BPEI-AgNPs and Citrate-AgNPs

與Citrate-AgNPs 相比,BPEI-AgNPs 顯著促進了PN 和PS 前體的合成,說明銅綠微囊藻分泌EPS包裹BPEI-AgNPs并中和其毒性,而在Citrate-AgNP組中EPS 分泌不足,因此Citrate-AgNPs 對藻細胞的生長抑制和氧化損傷程度均大于BPEI-AgNPs.

本研究有效揭示了不同表面電荷AgNPs 對銅綠微囊藻的生物毒性效應,為探究銀納米顆粒潛在的生態風險以及藍藻水華的防治策略提供了理論支撐.

3 結論

3.1 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 均通過抑制光合作用和能量代謝來抑制銅綠微囊藻的生長,并且破壞細胞膜.

3.2 銅綠微囊藻對 Citrate-AgNPs 的耐受性較差.BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 都干擾了銅綠微囊藻光合電子傳遞和光合色素合成代謝,阻礙了能量轉換.

3.3 BPEI-AgNPs 易吸附于銅綠微囊藻細胞表面,因而刺激其分泌大量EPS,從而中和了BPEI-AgNPs的毒性.Citrate-AgNP 組中大量Ag+的存在激活了活性離子進入藻細胞的轉運過程,導致ROS 水平上升,對藻細胞的損傷更為顯著.