紅掌組織培養和快速繁殖技術

周 靜 周力行 周曉靜 孫 欣 沈碧君 蔣亞華

（宿遷學院，江蘇宿遷 223800）

紅掌（Anthurium andraeanumLind.）是花燭屬天南星科的一種多年生常青性草本植物，也稱安祖花、花燭。因其色彩艷麗、花期持久和花型獨特，深受人們喜愛。在紅掌組織培養中，外植體的選擇和處理是其組織培養的重要環節。目前組織培養研究選用的外植體以葉片、葉柄為主[1]。本研究選取紅掌嫩葉作為試驗材料，通過試驗對比，探討在不同生長因素影響下紅掌生長狀況，為紅掌組織培養研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料選擇

選取株型大、花色鮮艷的紅掌盆栽品種特倫薩作為供試品種。切取紅掌基部新生幼嫩葉片，用自來水沖去雜質、洗凈表面，再用流水沖洗30 min，瀝干后移至超凈工作臺上。

1.2 外植體滅菌

在無菌環境下，將嫩葉、葉柄和莖段分成9組并編號，均用75%乙醇浸泡30 s，再用無菌水沖洗3次。然后將1—3 組用0.5% NaCIO 溶液分別浸泡6、8 和10 min；4—6 組用1.0% NaCIO 溶液分別浸泡6、8 和10 min；7—9 組用2.0% NaCIO 溶液分別浸泡6、8 和10 min。待各組時間到后，用無菌水沖洗5次，分別放入消毒瓶中備用[2]。

1.3 培養基配制

培養基分為誘導愈傷組織的培養基、增殖愈傷組織的培養基、誘導叢生芽的培養基和叢生芽生根的培養基。在每個培養基配制好后，進行濕熱滅菌，滅菌條件如下：蒸氣壓0.105 MPa，溫度121 °C，滅菌時間15 min。充分殺菌，減少組織培養時的污染[3]。

1.4 愈傷組織誘導

以紅掌品種特侖薩的嫩葉、莖段及葉柄為材料，用于紅掌組織培養的主要培養基包括MS、1/2 MS、N6 和B5 等。在這些培養基中，誘導紅掌愈傷組織的最有效培養基是1/2 MS[4]。因此，以1/2 MS 為基礎培養基，以6-BA 和2，4-D 為因子，進行了四級正交雙因子檢測，設計不同6-BA 和2，4-D 濃度的培養基配方進行試驗。6-BA 濃度為0.2、0.5、0.8 和2.0 mg/L；2，4-D濃度為0.1、0.3、0.5和0.7 mg/L[5]。

在3 個重復中，每個處理組100 個外植體，共接種300 個外植體。培養30 d 后，統計愈傷組織的誘導情況并得出結論。

1.5 叢生芽誘導

將獲得的愈傷組織在無菌條件下切成長約3 mm的小段，將每個小瓶中的15個接種處理組織接種到誘導叢生芽的培養基中，以誘導叢生芽的發生，通過觀察叢生芽出芽率，比較不同激素比例對誘導發芽的影響。以MS為基礎培養基，以6-BA和NAA為因子，建立三級兩因子正交試驗，6-BA 的濃度分別為0.3、0.5和0.7 mg/L，NAA濃度為0.1、0.2和0.3 mg/L[6]。

培養40 d后，統計合格叢生芽的數量，合格叢生芽判斷標準為苗高≥1.5 cm，葉片≥3片，葉寬≥1.5 cm，葉片嫩綠。

1.6 叢生芽生根

誘導叢生芽獲得大量叢生芽后，選取誘導的合格叢生芽無根苗，去掉黃葉和枯葉，將幼苗分別接種于不同濃度NAA的生根介質中，每瓶裝15個叢生芽苗，并進行誘導。以1/2 MS作為基質，6-BA和NAA作為兩因子進行正交試驗。6-BA 濃度設計為0.3、0.5和0.7 mg/L。NAA濃度為0.1、0.2和0.3 mg/L。

培養14 d后，可見微量潔白的愈傷組織，當苗高4～5 cm 時，可見發達的主根和大量須根，一個月后統計其生根率。

1.7 培養條件優化

在每升培養基中加入30 g蔗糖和2 g植物凝膠，將培養物置于組培室中，溫度為（25±1）℃，每天連續光照12 h，光照強度為1 500～2 100 lx。酸性或堿性過強均會對植株的生長造成較大的影響，而紅掌的pH在5.6～5.8時較好。

組織培養期間，每3～5 d檢查一次培養室，統計結果，并去除受污染的瓶苗。保持溫度和光照。組培室每周用紫外燈照射一次，約30 min，地板每周用75%乙醇噴灑一次，降低培養環境的污染性。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對葉片接種效果的影響

由表1 可知，隨著消毒時間變長，葉片接種成活率先升高后下降，當用NaCIO 溶液浸泡8 min 時，接種成活率最高。當消毒時間小于8 min 時，會造成葉片殺菌不完全，導致污染率上升。當消毒時間大于8 min 時，死亡率大幅提升。因此，消毒時間選8 min最為適宜。

表1 不同消毒時間對葉片接種效果的影響

2.2 不同NaCIO溶液濃度對葉片接種效果的影響

由表2可知，隨著NaCIO 溶液濃度的上升，成活率和污染率降低，死亡率上升。該結果表明，提高NaCIO 溶液濃度可以抑制污染，同時也會導致細胞組織死亡。因此，NaCIO 溶液濃度選用0.5%為宜。

表2 不同NaCIO溶液濃度對葉片接種效果的影響

2.3 不同激素濃度配比對紅掌外植體愈傷組織誘導的影響

控制2，4-D 濃度不變，對比6-BA 濃度變化，其影響如表3 所示。6-BA 的濃度對愈傷組織的直徑有更大的影響，其范圍在0.2～1.8 cm。在6-BA 濃度為0.2～0.5 mg/L 時，隨著6-BA 濃度的增加，愈傷組織的直徑變大。當6-BA濃度超過0.5 mg/L后，直徑略有下降，推測6-BA為0.5 mg/L時最適合愈傷組織生長。

表3 不同激素濃度配比對紅掌外植體愈傷組織誘導的影響

控制6-BA 濃度不變，2，4-D 濃度對愈傷組織狀態的影響較大。2，4-D 濃度為0.1 mg/L 時，無愈傷組織或愈傷組織較小，愈傷組織誘導率低，質地較軟，易碎，導致保花效果不明顯。2，4-D 濃度為0.5 mg/L 時，愈傷組織質地堅硬且誘導成功率高，愈傷出現時間短。2，4-D 濃度超過0.5 mg/L后，會出現僵果和畸形果，外植體愈傷化，形態結構消失。

葉片在培養基（7）中培養10 d后，開始出現膨大現象，60 d即可誘導出愈傷組織，且誘導成功率高達98%。此時在其他培養基中葉片多膨大，邊緣出現愈傷組織，對其繼續培養，部分會出現干死或污染情況，誘導成功率為80%。從形態、質地和顏色等多方面綜合考慮，以0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D 為愈傷組織誘導培養基的最佳配比。

2.4 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽誘導的影響

控制NAA 濃度不變，對比6-BA 濃度變化，其影響如表4 所示。在6-BA 濃度為0.3～0.5 mg/L時，6-BA含量越高，愈傷組織分化數量越多，分化程度越高。當6-BA 濃度為0.5 mg/L 時，誘導率最高；濃度超過0.5 mg/L 后，叢生芽過多，導致養分不足，整體長勢變差[7]。

表4 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽誘導的影響

控制6-BA 濃度不變，NAA 變化時，NAA 在較低的濃度下，叢生芽誘導率較低。當NAA 濃度為0.2 mg/L 時，誘導率可達95%，且芽長勢最好，芽高1.5～2.5 cm，葉片3～5枚，芽點布滿生長空間，屬于合格叢生芽。當濃度繼續升高，叢生芽生根，會導致叢生芽畸形、枯萎壞死或停止生長[8]。

接入培養基40 d后觀察，3組均有小芽生長，其中培養基（5）小芽最多。100 d 后3 組基本萌發完成，培養基（5）在3組中芽萌發率最高，長勢最好，顏色最綠，芽最健壯，其余處理出現畸形、長勢不佳、枯萎壞死或誘導率低等現象[9]。綜上所述，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為誘導叢生芽的最佳濃度。

2.5 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽生根的影響

控制NAA 濃度不變，對比6-BA 濃度變化，其影響如表5所示。當6-BA 濃度為0.3 mg/L 時，根系較淺，芽瘦弱易折。當6-BA 濃度為0.5 mg/L 時，既能保證生根率，又不會對叢生芽形態造成影響。在6-BA 濃度為0.7 mg/L 時，芽有變形的趨勢，生長潛力降低。推測是由于基質膨脹后附著的芽的內部運輸組織的損失，導致大苗發育不良。因此，6-BA 的最佳濃度為0.5 mg/L。此時最適合叢生芽長出粗壯的根，方便之后對苗的移栽。

表5 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽生根的影響

控制6-BA 濃度不變，NAA 對叢生芽生長有較大影響。NAA深度為0.1 mg/L時，叢生芽生根率低。NAA濃度為0.2 mg/L時，叢生芽有氣生根，但氣生根愈傷化，有效苗比率低。NAA濃度為0.3 mg/L時，平均生根數量最多，平均根長最長。

將叢生芽導入生根培養基30 d 后，對其生長狀況進行觀察，發現有部分黃綠色的新根出現，此時培養基（6）生根最早，生根數最多。45 d 后再觀察其生長狀態，培養基（6）的生根率約為98%，平均根數為4.6條，平均根長為3.0 cm，根系旺盛，芽生長良好，呈綠色，其次為培養基（2）。因此，0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA是使叢生芽生根的最佳培養基濃度。

當組培幼苗生根后，將其從瓶子里拿出，用清水洗凈根系的培養基，種植在草炭、蛭石和珍珠石（體積比為2∶2∶1）的混合基質中，然后用塑料膜覆蓋，放在溫室內，一天澆水2～3次，以保證基質的濕度。在幼苗初期要進行遮陰處理，并定期用百菌清溶液進行保護。15 d 后，幼苗的生長狀況良好，逐步撤去覆蓋的塑料膜，適當增加光照強度，直到光強達到2 500 lx，成活率達100%。

3 結論與討論

該試驗探究不同因素對紅掌特侖薩葉片誘導叢生芽的影響，如培養基、激素以及消毒時間等，因此必須保持每個試驗體在同一培養環境下。主導生態環境因子對誘導組織的分裂和分化起著非常重要的作用，如光照和溫度等。光照對特倫薩愈傷組織有較好的刺激作用，有利于從愈傷組織中分化出綠色幼苗，在缺少光線的情況下，會產生發黃的幼苗[4]，在補充光照后會恢復為綠色。在采光良好的培養室中，自然漫射光可滿足要求。然而，在光線不足的培養室中，需要人工照明。因此，本試驗使用日光作為額外的光源，在組培室中，植物每天在（25±1）℃下培養12 h，光照強度為1 500～2 100 lx。

紅掌組織培養的外植體通常選用葉片、葉柄和莖等，其中葉片和葉柄使用較多。盡管紅掌的離體莖段誘導成活率更高，但紅掌莖段材料較少，且切割后易造成植株損傷。因此，本試驗采用葉片作為外植體，相較于其他器官，其易于提取和處理，新形成的葉片雜菌較少，易于消毒[10]。

愈傷組織誘導是植物組織培養的一個重要技術，大多數植株在形成前都處于愈傷組織期。在外植體充分消毒、無細菌感染的基礎上，使用不同激素配比的培養基，對愈傷組織培養會產生不同的影響。本試驗選擇6-BA 和2，4-D 作為愈傷組織培養的激素。6-BA 通過破壞頂端優勢，促進細胞分裂和誘導新芽形成；2，4-D 具有促進細胞分裂的作用，使細胞壁變軟和變松。2 種激素協同作用于外植體，促進愈傷組織形成與增殖。

本研究表明，0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D為愈傷組織誘導培養基的最佳配比，此時愈傷組織質地堅硬，愈傷出現時間短。葉片培養10 d后，開始出現膨大現象，60 d即可誘導出愈傷組織，且誘導成功率高達98%。0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D 為最佳愈傷組織增殖濃度，此時增殖系數高，且愈傷組織發育良好。

內源性植物激素的調節是成功誘導融合芽的一個重要因素。移植組織中不同的內源激素水平會導致最合適的外源生長介質的濃度變化。因此，不同類型和濃度的生長劑需要適應不同的植物組織培養。

在誘導試驗中，分裂素和生長激素對紅掌花序的分化起著重要作用。比例太低或太高均不利于萌發，影響植株的生長。研究顯示，生長素NAA 在誘導叢生芽方面比IBA 更有效[7-8]。因此，本研究使用生長素NAA，當6-BA 為0.6 mg/L、NAA 為0.2 mg/L時，誘導出的叢生芽最佳，萌發率最高，長勢最好，顏色最綠，芽最為健壯。當6-BA 為0.5 mg/L、NAA為0.3 mg/L 時，叢生芽生根最高，約為98%，平均生根數4.6條，平均根長3 cm，根系粗壯，芽生長好，顏色綠。

離體苗的快速繁殖及移栽技術是制約紅掌產業發展的一個重要因素。而紅掌組織培養技術受季節和環境影響較小，且對基質的要求較低，在生產上有較大的應用潛力，有利于提升花卉產業技術水平[9-10]。本研究探究了紅掌特倫薩品種的叢生芽誘導與生根的技術，建立了完整的紅掌組織培養體系，為紅掌組織培養研究提供參考，助力紅掌快繁技術的發展。