金銀花多酚粗提物調(diào)控miR-100-5p參與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299侵襲遷移

申興勇, 白 爽, 李新濤, 李亞紅, 王孝彬

(1.陜西省西安市人民醫(yī)院/西安市第四醫(yī)院航天院區(qū)血液腫瘤中心, 陜西 西安 710004 2.陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科, 陜西 西安 710061 3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院/唐都醫(yī)院胸外科, 陜西 西安 710038)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)為肺癌的主要亞型,占肺癌的70%～80%[1]。在中國,肺癌是發(fā)病率和死亡率較高的原發(fā)性惡性腫瘤,由于缺乏臨床表現(xiàn),大多數(shù)NSCLC患者入院時處于中晚期,錯過了最佳治療時機(jī),預(yù)后并不理想[2]。近年來,中醫(yī)藥在NSCLC的治療中發(fā)揮重要作用,具有增效減毒、提高生存質(zhì)量、延長生存期的目的;且可預(yù)防NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]。金銀花(Lonicera.japonica Thunb.)是我國常用的一味傳統(tǒng)中藥,其主要有效成分可通過“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”發(fā)揮抗肺癌作用[4]。據(jù)報道,四味金銀花湯聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌療效確切,并能延長生存期[5]。金銀花多酚粗提物能夠抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。然而,金銀花多酚粗提物對NSCLC的影響及機(jī)制尚未明確。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是調(diào)節(jié)NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移的重要通路之一,研究顯示,破壞Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)可抑制NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,已被證實在NSCLC中存在異常表達(dá),可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路參與NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[8]。miR-100-5p是一種在多種癌癥中表達(dá)下調(diào)的miRNA,研究顯示,miR-100-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中呈低表達(dá),其過表達(dá)可抑制NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲[9]。此外,miR-100-5p可以抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活而發(fā)揮抗癌活性[10];且金銀花提取物已被證實可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路活性抑制胃腸上皮化生(胃癌惡變前病狀)[11]。因此,本實驗旨在研究金銀花多酚粗提物對NSCLC的影響及其是否與miR-100-5p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑：非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞(美國ATCC,貨號：AC102184);金銀花藥材(河南金陵金銀花藥業(yè)有限公司,批號：20130521);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司,貨號： 22400-089);四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、蛋白提取試劑盒(艾美捷科技有限公司,貨號：TR-100-FJT、KTP3001);Transwell小室、基質(zhì)膠(美國BD公司,貨號：351003、354230);Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(美國Thermo公司,貨號：15596018、K1622、Q33216)。

1.2金銀花多酚粗提物的制備：取100g干燥的金銀花藥材,研制成粉末,50℃條件下用70%甲醇浸提12h,抽濾后旋轉(zhuǎn)濃縮獲得粗浸膏,用甲醇溶解配置成濃度為10mg/mL的金銀花多酚粗提液,于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆肹6]。

1.3細(xì)胞處理與分組：NCI-H1299細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中,分別用濃度為750、1500、3000 μg/mL的金銀花多酚粗提物[6]分別記為金銀花多酚粗提物低、中、高劑量組;常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組;用濃度為0.1μmoL/L紫杉醇處理,記為紫杉醇組。將miR-100-5p模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)染至NCI-H1299細(xì)胞,記為miR-100-5p組、miR-NC組;將miR-100-5p抑制劑及陰性對照分別轉(zhuǎn)染至NCI-H1299細(xì)胞,然后用3000μg/mL的金銀花多酚粗提物處理,記為anti-miR-100-5p+高劑量組、anti-miR-NC+高劑量組。

1.4MTT檢測細(xì)胞活性：將1.3中各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后分別加入20μL MTT和150μL二甲基亞砜(DMSO),反應(yīng)后酶標(biāo)儀檢測490nm處吸光度(A)值。

1.5Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲：將1.3中各組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸制備細(xì)胞懸液。遷移：取100 μL無血清培養(yǎng)的細(xì)胞液加入Transwell小室上室,培養(yǎng)24h,經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色后,擦掉上層未遷移細(xì)胞,顯微鏡下觀察并記數(shù)。侵襲：用基質(zhì)膠包被Transwell上室,其余按遷移實驗操作。

1.6蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測蛋白表達(dá)：提取1.3中各組NCI-H1299細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉后,分別加入E-Cadherin(1∶1000)、N-Cadherin(1∶1000)、Vimentin(1∶1000)、Wnt3a(1∶500)、β-catenin(1∶1000)、p-GSK-3β(1∶500)、GSK-3β(1∶1000)及內(nèi)參β-actin(1∶2000)抗體于4℃孵育過夜,加入二抗(1∶2000)室溫孵育2h,顯影,分析蛋白條帶灰度值。

1.7實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-100-5p表達(dá)水平：提取1.3中各組NCI-H1299細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR條件如下：95℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s,45個循環(huán)。miR-100-5p相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。引物序列：miR-100-5p：F：5'-GAACCCGTAGATCCGAACT-3',R：5'-CAGTGCGTGTGTCGTGGAGT-3';U6：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響：與NC組比較,不同濃度金銀花多酚粗提物組NCI-H1299細(xì)胞活性降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少,E-Cadherin表達(dá)水平升高,N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),紫杉醇組與高劑量組各項指標(biāo)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);金銀花多酚粗提物低、中、高劑量組間各項指標(biāo)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1,表1。

圖1 不同濃度金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表1 不同濃度金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響

2.2金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞中miR-100-5p表達(dá)的影響：與NC組比較,不同濃度金銀花多酚粗提物組miR-100-5p表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),紫杉醇組與高劑量組各項指標(biāo)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);金銀花多酚粗提物低、中、高劑量組間miR-100-5p表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞中miR-100-5p表達(dá)的影響

2.3過表達(dá)miR-100-5p對NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響：與miR-NC組比較,miR-100-5p組NCI-H1299細(xì)胞中miR-100-5p表達(dá)水平升高,NCI-H1299細(xì)胞活性降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少,E-Cadherin表達(dá)水平升高,N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2,表3。

圖2 過表達(dá)miR-100-5p對NCI-H1299細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表3 過表達(dá)miR-100-5p對NCI-H1299細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響

2.4下調(diào)miR-100-5p逆轉(zhuǎn)金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響：與anti-miR-NC+高劑量組比較,anti-miR-100-5p+高劑量組miR-100-5p表達(dá)水平降低,NCI-H1299細(xì)胞活性升高,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量增加,E-Cadherin表達(dá)水平降低,N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3,表4。

圖3 下調(diào)miR-100-5p逆轉(zhuǎn)金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表4 下調(diào)miR-100-5p逆轉(zhuǎn)金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響

2.5金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：與NC組比較,金銀花多酚粗提物高劑量組Wnt3a、β-catenin表達(dá)水平降低(P<0.05),p-GSK-3β/GSK-3β比值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與anti-miR-NC+高劑量組比較,anti-miR-100-5p+高劑量組Wnt3a、β-catenin表達(dá)水平升高(P<0.05),p-GSK-3β/GSK-3β比值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4,表5。

圖4 β-catenin蛋白表達(dá)印跡圖

表5 金銀花多酚粗提物及anti-miR-100-5p處理后β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討 論

中醫(yī)藥在治療腫瘤方面具有悠久的歷史,本實驗用不同劑量的金銀花多酚粗提物處理非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞,結(jié)果顯示,NCI-H1299細(xì)胞活性降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少;表明金銀花多酚粗提物可抑制NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物,是NSCLC轉(zhuǎn)移過程早期階段的關(guān)鍵指標(biāo)。金銀花多酚粗提物處理后,E-Cadherin表達(dá)水平升高,N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平降低;表明金銀花多酚粗提物可抑制NCI-H1299細(xì)胞的EMT進(jìn)展。

miR-100-5p的抗癌功能已從多種來源的癌癥中得到證實,已有研究表明miR-100-5p可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移、侵襲[9]。本實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-100-5p后,NCI-H1299細(xì)胞活性降低,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少,E-Cadherin表達(dá)水平升高,N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平降低;表明過表達(dá)miR-100-5p可抑制NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移侵襲以及EMT。中藥活性成分可通過調(diào)控miRNA表達(dá)參與癌癥進(jìn)展,如人參皂苷Rh2可通過降低miR-28-5p表達(dá),抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)來減緩NSCLC的進(jìn)展[12]。在本研究中,金銀花多酚粗提物可提高NCI-H1299細(xì)胞中miR-100-5p的表達(dá)水平,且下調(diào)miR-100-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT的影響;提示金銀花多酚粗提物可能通過上調(diào)miR-100-5p表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白家族,目前已發(fā)現(xiàn)19種,其中Wnt3a在NSCLC中高表達(dá),與NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[13];且Wnt3a可增加體外NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力[14]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵因子,研究報道β-catenin在NSCLC中高表達(dá),且與患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]。Wnt/β-catenin未被激活時,β-catenin會被GSK-3β組成的復(fù)合物磷酸化而降解;當(dāng)Wnt信號通路激活后,Wnt分泌后能與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5或6共同受體(LRP5/6)結(jié)合形成細(xì)胞表面復(fù)合物,抑制GSK-3β等蛋白形成的β-catenin降解復(fù)合物的降解活性,穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β-catenin蛋白,胞漿中穩(wěn)定積累的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。激活Wnt/β-catenin通路可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞惡性進(jìn)展[7]。miRNA的失調(diào)是Wnt/β-catenin信號激活的關(guān)鍵機(jī)制之一,miR-100-5p被證實可以靶向Wnt/β-catenin信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子-卷曲類受體8(FZD8)來抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活[10]。本實驗結(jié)果顯示,高劑量金銀花多酚粗提物處理后,Wnt3a、β-catenin表達(dá)水平降低,GSK-3β的磷酸化水平升高,表明金銀花多酚粗提物可抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化;而下調(diào)miR-100-5p可減弱金銀花多酚粗提物對NCI-H1299細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。提示金銀花多酚粗提物可能通過上調(diào)miR-100-5p表達(dá)來抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活,進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述,金銀花多酚粗提物可抑制非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其機(jī)制可能與下調(diào)miR-100-5p表達(dá),抑制Wnt/β-catenin通路活化有關(guān)。本研究為金銀花多酚粗提物抑制非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展提供了重要證據(jù),表明金銀花多酚粗提物是一種潛在的治療非小細(xì)胞肺癌的候選藥物。但金銀花多酚粗提物通過何種途徑調(diào)節(jié)miR-100-5p表達(dá)有待進(jìn)一步分析,在未來的研究中將對miR-100-5p的上游調(diào)節(jié)因子進(jìn)行探索,并對Wnt/β-catenin通路進(jìn)行干預(yù),完善金銀花多酚粗提物抗非小細(xì)胞肺癌的分子機(jī)制研究。