LncRNA PURPL調(diào)節(jié)miR-342-3p/PIK3R1軸對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

王紅梅, 陳思瑞, 杜 紅

(四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院肝膽乳腺外科, 四川 綿陽(yáng) 621000)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一,也是癌癥死亡率的第二大原因[1]。盡管在預(yù)防和治療肝癌方面做出了巨大努力,但肝癌的發(fā)病率和死亡率仍在上升[2]。由于在疾病的早期階段缺乏特定的體征和癥狀,當(dāng)診斷為肝癌時(shí),大約70-80%的患者處于不可切除的階段,患者預(yù)后較差[3]。LncRNA可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞惡性行為,如增殖、凋亡抵抗、遷移、侵襲和耐藥性[4]。研究發(fā)現(xiàn),沉默LncRNA PURPL可抑制肝癌細(xì)胞增殖,阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。我們通過TargetScan網(wǎng)站以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)LncRNA PURPL靶向調(diào)控微小RNA-342-3p(miR-342-3p)/磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基1(PIK3R1)軸。而miR-342-3p是肝細(xì)胞癌中有效的腫瘤抑制因子,可以顯著減緩肝腫瘤的發(fā)展并提高生存率[6]。下調(diào)PIK3R1抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。本研究旨在探究LncRNA PURPL是否可以通過調(diào)節(jié)miR-342-3p/PIK3R1軸抑制肝癌惡性生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑：人正常肝細(xì)胞系L02、MTT細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司;人肝癌細(xì)胞系Huh-7、小鼠肝癌細(xì)胞H22、Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢普諾賽生命科技公司;PIK3R1抗體購(gòu)自Abcam。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞分組：將Huh-7細(xì)胞分別用si-NC、si-PURPL、inhibitor NC和miR-342-3p inhibitor轉(zhuǎn)染,分為si-NC組、si-PURPL組、si-PURPL+inhibitor NC組、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor組;另設(shè)置正常培養(yǎng)的Huh-7細(xì)胞為NC組。

1.2.2雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)：于Huh-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染PURPL-WT、PURPL-MUT、PIK3R1-WT、PIK3R1-MUT質(zhì)粒和mimic NC(或miR-342-3p mimic),48h后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)：提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再在Applied Biosystems?7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上通過qRT-PCR檢測(cè)LncRNA PURPL、miR-342-3p的表達(dá)水平,PCR參數(shù)：95℃預(yù)變性5min,95℃變性10s,60℃退火10s,72℃延伸20s(40個(gè)循環(huán))。LncRNA PURPL、miR-342-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參。2-ΔΔCt計(jì)算表達(dá)水平。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.4Western blot檢測(cè)PIK3R1蛋白表達(dá)：將細(xì)胞在RIPA裂解液中勻漿,并在4°C下離心30min。使用SDS-PAGE對(duì)等量蛋白進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)膜。將膜封閉1h后,與一抗：PIK3R1(1∶1000)、GAPDH( 1∶1000)孵育24h,在室溫下再與二抗孵育1h。ECL顯影,Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：首先,將各組Huh-7細(xì)胞接種到96孔板中,在每個(gè)孔加入20μL的MTT溶液孵育4h,再加入100μL二甲基亞砜,然后使用振蕩器輕輕振蕩10min。當(dāng)所有紫色晶體完全溶解時(shí),使用酶標(biāo)儀測(cè)量490nm處的光密度值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡：轉(zhuǎn)染24h后收集各組細(xì)胞,使用Annexin V-FITC及PI(各5 μL)孵育10min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.7Transwell試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲：通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組Huh-7細(xì)胞的侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠包被在Transwell上室中。在下腔室中加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基,在上腔中加入各組的Huh-7細(xì)胞懸浮液,濃度為1×105個(gè)/mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,將上腔中殘留的Huh-7細(xì)胞擦拭干凈,然后用多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。干燥后,在顯微鏡下觀察細(xì)胞,并計(jì)算侵襲細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.8劃痕試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移：在6孔板中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的Huh-7細(xì)胞24h。用槍頭在板底部做垂直劃痕。然后,將6孔板在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24h,計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率越高,細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。劃痕愈合率(%)=(0h劃痕寬度-24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%。

1.2.9異種移植腫瘤模型：從湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(SCXK(鄂)2020—0018)購(gòu)買6周齡雄性BALB/c裸鼠。將1×105個(gè)/mL H22細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠的右側(cè)腋窩皮下,然后通過尾靜脈注射sh-NC、sh-PURPL、sh-PURPL+antiagomir NC、sh-PURPL+miR-342-3p antiagomir,分別記為si-NC組、si-PURPL組、si-PURPL+inhibitor NC組、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor組,僅注射Huh-7細(xì)胞的裸鼠記為NC組,在注射6周后將裸鼠處死,取出裸鼠腫瘤并稱重。腫瘤體積：體積=腫瘤長(zhǎng)度×腫瘤寬度2/2。本研究已獲得本院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA PURPL調(diào)控miR-342-3p：miR-342-3p與LncRNA PURPL有互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。miR-342-3p mimic+WT-PURPL組細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC+WT-PURPL組降低(0.39±0.04比1.07±0.12,t=13.168,P<0.05),miR-342-3p mimic+MUT-PURPL組與miR-NC+MUT-PURPL組熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.04±0.13比1.05±0.11,t=0.144,P>0.05)。

圖1 LncRNA PURPL與miR-342-3p結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.2PIK3R1是miR-342-3p的靶基因：miR-342-3p與PIK3R1有互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。miR-342-3p mimic+WT-PIK3R1組熒光素酶活性較miR-NC+WT-PIK3R1組下降(0.43±0.05比1.09±0.14,t=10.875,P<0.05),miR-342-3p mimic+MUT-PIK3R1組較miR-NC+MUT-PIK3R1組熒光素酶活性無(wú)顯著差異(1.05±0.13比1.07±0.15,t=0.247,P>0.05)。

圖2 PIK3R1與miR-342-3p的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.3LncRNA PURPL、miR-342-3p、PIK3R1在細(xì)胞中的表達(dá)：與L02細(xì)胞相比,Huh-7細(xì)胞中LncRNA PURPL、PIK3R1表達(dá)升高,miR-342-3p表達(dá)降低(P<0.05),見圖3、表2。

圖3 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PIK3R1蛋白水平

表2 LncRNA PURPL miR-342-3p PIK3R1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)

2.4沉默LncRNA PURPL或下調(diào)miR-342-3p對(duì)PIK3R1蛋白表達(dá)的影響：si-PURPL組LncRNA PURPL、PIK3R1表達(dá)較si-NC組降低,miR-342-3p表達(dá)較si-NC組升高(P<0.05);si-PURPL+miR-342-3p inhibitor組PIK3R1表達(dá)較si-PURPL+inhibitor NC組升高,miR-342-3p表達(dá)較si-PURPL+inhibitor NC組降低(P<0.05),見圖4、表3。

圖4 Western blot檢測(cè)Huh-7細(xì)胞PIK3R1蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞中LncRNA PURPL miR-342-3p PIK3R1表達(dá)比較

2.5各組細(xì)胞活性比較：與si-NC組相比,si-PURPL組細(xì)胞活性降低(P<0.05);si-PURPL+miR-342-3p inhibitor組較si-PURPL+inhibitor NC組細(xì)胞活性升高(P<0.05),見表4。

表4 各組細(xì)胞活性比較

2.6各組細(xì)胞凋亡比較：與si-NC組相比,si-PURPL組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與si-PURPL+inhibitor NC組相比較,si-PURPL+miR-342-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),見圖5,表5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞凋亡

表5 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.7各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較：與si-NC組相比,si-PURPL組劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05);與si-PURPL+inhibitor NC組相比,si-PURPL+miR-342-3p inhibitor組劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05),見圖6～7、表6。

圖6 劃痕試驗(yàn)測(cè)定檢測(cè)Huh-7細(xì)胞遷移能力

圖7 Transwell檢測(cè)Huh-7細(xì)胞侵襲(×400)

表6 各組細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.8沉默LncRNA PURPL或下調(diào)miR-342-3p 對(duì)腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量的影響：si-PURPL組腫瘤體積和質(zhì)量較si-NC組下降(P<0.05);si-PURPL+miR-342-3p inhibitor組腫瘤體積和質(zhì)量較si-PURPL+inhibitor NC組升高(P<0.05),見圖8,表7。

圖8 各組裸鼠腫瘤代表圖

表7 沉默LncRNA PURPL或下調(diào)miR-342-3p 對(duì)腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量的影響

3 討 論

LncRNA通過人類轉(zhuǎn)錄組測(cè)序被鑒定出來。研究揭示其與癌癥相關(guān),其中一些在肝癌的發(fā)生和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[8]。近期發(fā)現(xiàn),敲低LncRNA PURPL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并使肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感[9]。而在我們實(shí)驗(yàn)中,與正常肝細(xì)胞系相比,LncRNA PURPL在肝癌細(xì)胞系中明顯過表達(dá)。進(jìn)一步暗示LncRNA PURPL可能是肝癌的靶基因,沉默LncRNA PURPL可能對(duì)肝癌的發(fā)展起到抑制作用。已有報(bào)道證明LncRNA PURPL的敲低抑制癌細(xì)胞增殖,阻斷癌細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[10]。在本研究中,沉默LncRNA PURPL在體外使Huh-7細(xì)胞OD490值、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著下降,Huh-7細(xì)胞凋亡率顯著升高,在體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步證實(shí)敲低PURPL可以抑制Huh-7細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,進(jìn)而抑制肝癌的進(jìn)展。

LncRNA可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA的功能影響各種基因的表達(dá)。LncRNA-miRNA-mRNA參與不同類型癌癥的發(fā)生和發(fā)展。在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-342-3p是LncRNA PURPL的潛在靶miRNA并證實(shí)LncRNA PURPL可調(diào)控miR-342-3p表達(dá)。以上研究已經(jīng)證實(shí)PURPL在肝癌中的作用,而miR-342-3p已被證實(shí)是肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物[11]。miR-342-3p抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。而下調(diào)miR-342-3p促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展[13]。在本研究中,miR-342-3p在Huh-7細(xì)胞中低表達(dá),沉默LncRNA PURPL可上調(diào)miR-342-3p表達(dá),且下調(diào)miR-342-3p可減弱沉默LncRNA PURPL對(duì)Huh-7細(xì)胞的作用。提示沉默LncRNA PURPL抑制Huh-7細(xì)胞惡性表型的功能可能與上調(diào)miR-342-3p有關(guān)。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)PIK3R1是miR-342-3p的靶基因。PIK3R1可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖,PIK3R1在肝癌組織中高表達(dá),敲低PIK3R1抑制肝癌細(xì)胞系的增殖、遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。Liu 等人[15]也發(fā)現(xiàn),下調(diào)PIK3R1影響肝癌細(xì)胞的索拉非尼的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn),PIK3R1在Huh-7細(xì)胞中呈高表達(dá),沉默LncRNA PURPL可抑制PIK3R1蛋白水平,而下調(diào)miR-342-3p后PIK3R1表達(dá)升高,提示沉默LncRNA PURPL對(duì)Huh-7細(xì)胞惡性表型的抑制作用可能與調(diào)控miR-342-3p/PIK3R1軸有關(guān)。

綜上,沉默LncRNA PURPL可抑制Huh-7細(xì)胞惡性表型,其功能可能與調(diào)控miR-342-3p/PIK3R1軸有關(guān)。本研究體內(nèi)研究較淺,我們下步將在小鼠上深入研究。