運用復發型膽總管結石患者膽道細菌建立豚鼠膽石癥模型

卞昊宇, 韓 冉, 段學光, 姚玉璞, 呂福琪, 魏驕陽, 張立平

(1.北京中醫藥大學東方醫院, 北京 100078 2.北京中醫藥大學研究生院, 北京 100029)

膽總管結石(common bile duct stones,CBDS)作為膽石癥中的一類,多易合并急性化膿性膽管炎等急腹癥威脅人們的生命健康。目前對于CBDS的治療通常采用經內鏡逆行胰膽管造影術(endoscopic retrograde cholangiopancreatography,ERCP)、內鏡下膽道括約肌切開術(endoscopic biliary sphincterotomy,EST)等,但術后存在著較高的復發率,有研究發現ERCP術后CBDS的復發率為16.53%,復發的中位時間為10.25個月[1]。其中EST等術式會導致Oddi括約肌(sphincter of Oddi,SO)功能的部分喪失,使十二指腸細菌逆行進入患者的膽道系統,成為CBDS復發的危險因素之一。現代研究發現,除內鏡操作導致膽道中出現細菌外,在本應為無菌的膽道環境中也出現了由十二指腸移位而來的細菌,并且在膽石癥患者的結石中發現了細菌成分,這些均證明膽道微生物在膽石癥的形成中發揮了重要作用[2]。目前基于膽道細菌感染所建立的膽石癥動物模型,多采用大腸桿菌或假單胞菌屬的單一菌種進行造模,造模后動物死亡率高,成石周期長,操作難度較高,且不符合臨床中此類病人出現腸膽反流后的膽道微生物組成。故本研究擬使用膽道插管注射復發型CBDS患者膽道細菌的方式建立豚鼠膽石癥模型,旨在探索并建立膽石癥動物模型造模新方式,為今后開展探究ERCP術后CBDS復發及膽石癥形成機制的相關實驗研究提供可靠的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實驗動物：普通級Dunkin Hartley豚鼠(北京市昌揚西山養殖場提供,機構許可證號：SCXK(京)2021-0008)35只,200～300g,雌雄不限。在實驗室用標準豚鼠飼料喂養(由中國中醫科學院中藥研究所提供),適應性喂養1周后,開展ERCP術后復發型CBDS動物模型建立。實驗操作均通過中國中醫科學院中藥研究所動物倫理審查委員會批準(2023C002、2023C003)。

1.1.2膽道細菌來源：所有膽道細菌均來自于復發型CBDS患者膽總管內膽汁,患者膽汁通過十二指腸鏡收集。在十二指腸鏡進鏡到位后,使用20mL無菌生理鹽水沖洗活檢孔道及鏡頭先端,然后應用弓刀切開Oddi括約肌并插管,在注射造影劑前使用無菌注射器抽取膽總管內膽汁5mL后即刻分裝于無菌凍存管中,用于以后的細菌高通量測序分析及細菌復蘇培養。本研究通過北京中醫藥大學東方醫院倫理委員會倫理審查,倫理審查批件號：JDF-IRB-2020031502。

1.1.3主要試劑與儀器：LB肉湯干粉(批號：20230710,規格：每瓶250g,有效期至2026年7月,生產單位：青島海博生物技術有限公司)。瓊脂粉(批號：20230225,規格：每瓶250g,有效期至2026年2月,生產單位：青島海博生物技術有限公司)。 ED-530XT型十二指腸鏡(FUJINON富士)、WSW-Thermo-1300-Ⅱ-A2型生物安全柜(賽默飛世爾蘇州儀器有限公司)、MJ-01型霉菌培養箱(黃石市恒豐醫療器械有限公司)、Pannoramic 250FLASH型病理切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)、生物信息分析軟件(美吉生物云)。

1.2方 法

1.2.1膽道細菌DNA擴增、文庫構建及測序：膽道膽汁樣本采集后立即凍存于無菌凍存管內,保存于-80℃冰箱中。基因組 DNA 提取、文庫構建和測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2.2膽道細菌的復蘇及培養：將LB肉湯干粉與蒸餾水按比例配置成LB肉湯液態培養基后,于高壓滅菌鍋(121℃,15min)中滅菌備用,待液態培養基冷卻后,取無菌LB液態培養基5mL至無菌試管中。將存放于-80℃冰箱內的膽汁樣本取出,使用一次性無菌微生物接種環接種50μL膽汁樣本于5mL LB液態培養基的試管中,確保接種環蘸取的膽汁充分溶解于試管中。所有操作均在生物安全柜中進行。菌液接種完畢將其放置于恒溫霉菌培養箱中培養。將成功復蘇的膽道菌液900μL與450μL無菌60%甘油溶液混合后,留置于無菌凍存管中,凍存于-80℃冰箱中保存菌群,以待動物模型造模前制備菌液時使用。

1.2.3固態培養基的制備與菌落計數：將LB肉湯干粉、瓊脂粉與蒸餾水按比例充分混合后,置于高壓滅菌鍋(121℃,15min)中加熱滅菌,滅菌后待培養基冷卻至50℃左右時,將溶液均勻倒于無菌培養皿中,等待其冷卻,以制備LB肉湯固態培養基。制作平板操作均在生物安全柜中進行。固態培養基制備完畢后,使用移液槍將稀釋為10-2、10-4、10-6、10-8、10-10的菌液吸取100μL分別接種在5個平板上,涂布棒涂抹均勻后將平板倒轉,放置于恒溫霉菌培養箱中培養過夜。直至長出菌落后計數,同時使用超微量分光光度計檢測對應菌液吸光度并記錄數值,結合平板菌落數對應的菌液吸光度以判斷菌液中菌落濃度。(以上操作均在北京中醫藥大學東方醫院檢驗科微生物實驗室中進行)

1.2.4動物實驗分批及處理：本次實驗分兩個階段進行,第一階段實驗為膽道插管、注射復發型CBDS患者菌液后,觀察動物模型長期存活率及第6、8、9周時動物膽道結石形成情況,使用的細菌從成功復蘇的6名復發型CBDS患者的膽汁樣本隨機選擇,編號為20號,膽道細菌復蘇成功后繼續培養12h,結合平板菌落生長情況及吸光度,本階段造模注射菌液濃度為1.5×108cfu/mL。本階段實驗,實際建立CBDS豚鼠模型20只,實驗周期9周。第二階段實驗在第一次實驗的基礎上增大菌液注射濃度,于造模結束后第2天起每日通過取材兩只動物模型,觀察膽道系統成石情況,使用的菌液來自于剩余的5名復發型CBDS患者膽汁樣本中隨機選擇的膽汁樣本,編號為17號,膽道細菌復蘇成功后繼續培養24h,結合平板菌落生長情況及吸光度,造模注射菌液濃度為3.5×108cfu/mL。本階段實驗,實際建立CBDS豚鼠模型14只,1只豚鼠于適應性飼養期間死亡,實驗周期11d。

1.2.5ERCP術后CBDS復發模型建立方法：兩階段實驗均采用膽總管插管、注射CBDS復發患者菌液的方式制備ERCP術后因腸膽反流導致膽道感染,CBDS復發動物模型。具體模型制備：動物模型制備前適應性飼養1周。術前8～12h禁食不禁水,腹腔注射3%戊巴比妥納(40mg/kg)麻醉。右上腹正中切開3～5cm,逐層開腹直至暴露豚鼠胃及胃竇部,沿胃竇尋找十二指腸與膽總管連接處,從十二指腸大乳頭對側壁使用24G留置針穿刺十二指腸腸壁,穿刺進入十二指腸大乳頭并將針尖插入膽總管中,確定留置針位于膽總管內后,向膽總管內注入菌液0.5mL并撤針,逐層縫合手術切口關腹,縫合完畢,使用碘伏消毒手術切口,并使用紗布加壓包扎。術后所有動物分籠飼養,6h后普通飼料喂養,自由飲水,每日予維生素C 0.2～0.4g/L加入飲用水中,每日檢查手術切口恢復情況并換藥。

1.2.6樣本采集：腹腔注射3%戊巴比妥納(40mg/kg)麻醉,暴露十二指腸大乳頭,24G留置針穿刺十二指腸腸壁,經十二指腸大乳頭插管進入膽總管后抽取膽汁。剖取肝臟、膽囊、膽總管后,使用4%多聚甲醛溶液沖洗固定,4℃冰箱保存。

1.2.7評價檢測：第一階段實驗主要評價應用膽總管插管、注射CBDS復發患者菌液的方式制備動物模型術后動物長期存活率;動物模型6周以后膽汁性狀及膽道系統內結石形成情況;并留取膽汁樣本做細菌培養。第二階段實驗在一階段實驗的基礎上,加大注射菌液的濃度,留取動物模型的肝臟、膽囊、膽總管組織并制作石蠟切片,HE染色;觀察動物模型膽汁性狀及膽道系統內結石形成情況,以綜合評估本實驗方法建立ERCP術后CBDS復發動物模型的可行性。

2 結 果

2.1復發型CBDS患者膽道細菌組成分析：本次共采集復發型膽總管結石患者膽汁樣本6例,以屬水平分析物種相對豐度柱形圖展示如圖1。其中第一階段實驗中使用的20號膽道細菌,在屬水平分類上腸球菌屬(Enterococcus)占97.57%;第二階段使用的17號膽道細菌,在屬水平分類上前幾位分別為腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)44.16%、擬桿菌屬(Bacteroides)29.88%、腸桿菌埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)17.97%、梭菌屬(Fusobacterium)3.50%、腸球菌屬(Enterococcus)2.26%。見圖1。

圖1 復發型CBDS患者膽道細菌組成情況

2.2膽道細菌功能預測分析：根據膽道細菌組成分析可得知,兩次造模使用的2個膽道細菌樣本在細菌組成上具有很大的差異性,在對所有復發型CBDS患者膽道細菌做進一步的功能預測分析后發現,即使膽道細菌的種類具有顯著差異,但是在能量轉換和代謝、輔酶運輸和代謝、脂質轉運和代謝、無機離子運輸和代謝等功能上,所有復發型CBDS患者的膽道細菌具有相似性。見圖2。

圖2 復發型CBDS患者膽道細菌功能預測分析

2.3動物模型存活率及結石產生情況：在第一階段實驗中,6周后豚鼠存活7只,存活率為35%,造模后1周內為死亡高峰,共有11只豚鼠死亡,2只于造模后第2周死亡。對死亡豚鼠進行解剖發現,1周內未皺縮排空的豚鼠膽道系統中存在少量黃色泥沙樣物質。在第6、8、9周分批取材時發現所有豚鼠膽道系統內膽汁均澄清,未見明顯絮狀物或泥沙樣結石。在第二階段實驗中,造模后第2天起每日隨機選取豚鼠2只進行取材發現,所有豚鼠膽道系統中均可見散在黑色或黃色沉渣,伴或不伴膿液。通過術后第2天起至所有豚鼠死亡時止的取材過程中發現,在增大菌液濃度后,膽道系統結石形成進程加快,直至第4天時可形成完整的巨大結石,見圖3。

圖3 造模后第2天至第4天結石形成過程

2.4膽總管膽汁細菌培養：第一階段實驗最終存活的7只豚鼠中,其中4只膽總管抽取的膽汁細菌培養結果呈陽性3只呈陰性。7只豚鼠在取材過程中膽總管、膽囊內膽汁澄清,并未見泥沙樣結石產生。

2.5肝臟、膽囊及膽總管組織結構及形態：第二階段實驗予高濃度菌液插管注射后,可見肝臟組織內膽小管周圍出現明顯炎性細胞浸潤。膽囊及膽總管粘膜上皮柱狀細胞排列整齊,組織內未見明顯炎癥反應,見圖4、圖5。

圖4 肝臟組織HE染色(×20)

圖5 膽囊及膽總管組織HE染色(×10)

3 討 論

基于細菌通過腸膽反流進入膽道系統并導致結石產生的觀點[3],早在上個世紀60年代,日本學者Maki就提出了著名的膽紅素鈣結石成因的假說[4],認為膽汁中細菌所分泌的β-Gase打破了膽紅素鈣沉淀生成和溶解的平衡狀態,最終導致了膽色素結石的產生。在對于膽道細菌與CBDS復發及膽石癥形成之間關聯的進一步研究中發現,膽道細菌不僅會導致色素結石的產生,同時也會導致膽固醇類結石及混合型結石的產生[5],并且復發型CBDS患者膽道細菌的種類較非復發型患者存在明顯差異[6],當患者出現了SO功能的紊亂,不僅增加了膽道中機會致病菌的種類,膽道細菌的組成較無結石的患者也出現了明顯的變化[7-8]。以上研究均證實膽道細菌在CBDS的復發及膽石癥的產生中發揮了重要的作用,因此探究膽道細菌與CBDS復發及膽石癥間的關聯,是目前臨床及實驗研究的重點,而建立合適的動物模型,是開展各項研究的基礎。

目前膽石癥動物模型大多選用兔、豚鼠及小鼠。造模方式以致石飼料喂養法、注射藥物法、細菌植入法及人結石植入法等為主,結石形成的時間為1～8周不等[9]。致石飼料及注射藥物法作為常見的造模方式,是從改變膽汁成分的角度產生結石。膽道細菌植入法產生結石,是基于十二指腸部位的細菌隨著腸膽反流定植于膽道系統,引發膽管長期的慢性炎癥,進而導致結石產生及復發的理論[10-11],但是此類造模方式常需要聯合膽總管不完全梗阻以保證細菌注射后能停留在動物的膽道系統中,因而存在操作難度大,死亡率高等缺點,故實驗中運用相對較少。在細菌植入法中常使用大腸桿菌,但使用大腸桿菌單一菌種造模,與臨床中膽石癥患者膽道細菌的組成不相符[5],無法解釋為何復發型CBDS患者膽汁中的厚壁菌門等亦可成為優勢菌種,所以此類造模方式,無法合理的闡釋膽道微生物群與CBDS復發及膽石癥之間的關系。因此,此類造模方式有待改進。

基于以上考慮,本實驗嘗試采用復發型CBDS患者膽道細菌作為膽道插管后注射的菌液來源。首先是基于CBDS患者的首選治療方式為ERCP術,該術式相較于傳統手術方式,獲取患者膽汁更為簡易,且內鏡下操作具有創傷小、恢復快等優點,術中獲取的膽汁樣本中的細菌均由十二指腸部位移位進入膽道系統。其次,根據膽道細菌組成來看,雖然腸桿菌屬在膽道細菌的組成中占有絕大部分,但膽汁主要由膽鹽、膽色素、膽固醇、卵磷脂、鉀、鈉、鈣等組成,并不符合腸桿菌屬細菌生存所需要的相關生存物質。最后,考慮到當大腸桿菌進入并定植于動物的膽道系統后,需要適應膽道環境才能成功定植于膽道系統,相較于已經適應膽道環境的復發型CBDS患者膽道中的細菌,使用這類細菌并合理的控制菌液濃度進行造模,可以更好的模擬臨床CBDS復發節點時的膽道微生物群,模擬結石復發及產生的過程。同時結合第一階段動物模型膽道細菌的培養結果,存在于患者膽道中的細菌能更好的適應膽道環境,因此可以縮短模型的建立周期并提高成功率。雖然兩次實驗使用的細菌種類存在差異,但本研究在對多名復發型CBDS患者的膽道菌群進行功能預測分析后發現,復發型CBDS患者膽道中的優勢菌種即便存在差異,但從功能預測的結果上看,不同種類的細菌,在相同的生存環境中,遵循生物進化理論,細菌的功能表現出了一定的相似性。

綜上所述,通過膽道插管,膽道內注射適當濃度復發型CBDS患者膽道細菌菌液的方式制備膽石癥動物模型,相較于既往使用膽道插管注射大腸桿菌聯合膽道不完全梗阻的方式,成模周期短,模型成功率高,操作難度更小,動物死亡率更低,更貼合臨床ERCP術后CBDS復發及膽結石產生時患者膽道的微生物組成。此類造模方式的嘗試,可為更多探究膽道細菌與CBDS復發及膽石癥間關聯實驗的開展提供基礎。