基于轉錄組測序探究C-MET表達在非小細胞肺癌中的免疫調控機制

徐越 張言斌 蘇珊

1清遠市人民醫院（廣東清遠 511518）；2廣州市紅十字會醫院（廣州 510240）；3廣州市胸科醫院（廣州 510095）

肺癌作為全球第二大最常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率極高。在中國2022年新增約87 萬肺癌病例，發病率高達19%，且為五大癌癥死亡的首要原因［1-2］，造成了巨大的經濟和醫療負擔。C-MET 是一種原癌基因，編碼由內源性配體或肝細胞生長因子（HGF）激活的受體酪氨酸激酶。最近研究表明，C-MET 基因擴增患者具有免疫抑制的特征，主要表現為相關的陽性耗竭自然殺傷（NK）細胞亞群增加，CD8+T 細胞和NK 細胞群減少［3］。更有研究［4］發現，C-MET 的致癌激活通過上調CD274（編碼PD-L1）或SOCS1等參與免疫抑制的不同轉錄物促進免疫逃逸。C-MET 擴增還與腫瘤浸潤T 淋巴細胞表達增加有關［5］，HGF/C-MET通路可用于調控CD8+T 細胞介導的抗腫瘤免疫應答［6］。通過以往的研究得出C-MET 與腫瘤免疫微環境密切相關，但是C-MET 影響免疫微環境的具體機制尚不清楚。為進一步探索C-MET 對免疫微環境的具體調控機制，本研究基于細胞水平，通過轉錄組測序技術篩選出C-MET 調控表達前后的差異表達基因（DEGs），并通過生物信息學分析方法進行數據挖掘，篩選出可能參與免疫調控的基因，并建立肺癌細胞與人免疫細胞體外培養模型，進一步驗證C-MET 基因敲低后對免疫因子的影響，深入探究了可能參與C-MET 調控通路的功能蛋白，為尋找新的肺癌藥物作用靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料通過CCLE（癌癥細胞系百科全書）篩選出H1993、EBC-1 為C-MET 高表達細胞株。肺腺癌細胞H1993 購自廣州德為生物科技有限公司；肺鱗癌細胞EBC-1 購自廣州零壹生物科技有限公司。培養基（minimum essential medium，MEM、bronchial epithelial cell growth medium bulletKit、BEGM、1640）、細胞轉染試劑（jetPRIME）、胎牛血清（FBS）、胰酶由biosharp 公司提供；蛋白定量測定試劑（bicinchoninic acid，BCA）和蛋白免疫印跡（western blot）一、二抗試劑，酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒（ELISA）均購自ABclonal 公司。CD8+T 細胞全負選試劑盒來自STEMCELL 公司。PBMC 細胞來自健康志愿者的外周血。

1.2 C-MET 低表達細胞模型的構建通過siRNA 干擾構建C-MET 低表達細胞模型，按每孔5 μL jetPRIME、75 pmol siRNA（由吉碼基因合成）及2 × 125 μL 的Opti-MEM 培養基比例混合轉染試劑，siRNA 分子的濃度為110 nm，siRNA 序列：正義鏈5′-AGUGCCACUAACUACAUUUATT-3′，反義鏈5′-UAAAUGUAGUUAGUGGCACTT-3′。 RT-qPCR法檢測C-MET 基因轉錄水平，反應體系：2 × Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，引物各0.8 μL，cDNA 加入1 μL，ddH2O 補足至20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，循環反應95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，循環反應95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s。高溫變性及退火延伸40 個循環。采用2-ΔΔCT算法計算并分析結果。引物序列為：C-MET：正義鏈5′-CGACAGCTGACTTGCTGAGA-3′，反義鏈5′-AGGTTTATCTTTCGGTGCCCA-3′；GAPDH：正義鏈5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，反義鏈5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；INF-β：正義鏈5′-GCTACGGAATGAAGACGCCA-3′，反義鏈5′-CCTCCAGGTAGGCTCTCCTT-3′；CXCL-10：正義鏈5′-GCTTCCAAGGATGGACCACA-3′，反義鏈5′-GCAGGGTCAGAACATCCACT-3′；INF-γ：正義鏈5′-CCAAGGTCGATGTGTTCCGT-3′，反義鏈5′-ATGGGGCCTTCAGATTGCTC-3′。

1.3 Western blot 檢測肺腺癌細胞株H1993、肺鱗癌細胞株EBC-1 中C-MET 蛋白的表達轉染48 h 后取4 組細胞，根據BCA 試劑盒（購自于廣州德為生物公司）提取并測定4 組細胞蛋白濃度。步驟：將細胞裂解并將其稀釋至相同的蛋白濃度，100 ℃煮沸5 min 使蛋白變性；每組取蛋白40 μg，10% SDS-PAGE 凝膠電泳（150 V，50 min）；轉膜（400 mA，1 h）至PVDF 膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（或4 ℃過夜）；一抗1∶1 000，室溫孵育2 h（或4 ℃過夜）；TPBS 洗滌3 次，PBS 洗滌1 次；之后進行Western blot 反應，拍照記錄后進行軟件圖像分析，測定4 組細胞中C-MET 蛋白的相對表達水平。

1.4 轉錄組測序

1.4.1 提取總RNA 送檢測序收集三次實驗組（siRNA 沉默H1993、EBC-1 細胞48 h）與對照組（NC 組為未經siRNA 沉默H1993、EBC-1 細胞48 h）Trizol 提取其總RNA，按送檢要求稀釋后交由江西海普洛斯基因科技有限公司完成質檢并進行轉錄組測序。采用NovaSeq 6000 儀器及配套NovaSeq S4 reagent kit 進行文庫測序。

1.4.2 篩選差異基因進行分析將實驗組與對照組基因差異表達倍數（FC）取以2 為底的對數值，定義log2（FC）＞1，校正后Q值＜0.05的基因為DEGs，使用Dr.Tom 軟件進行基因定量分析、以篩選出差異表達基因（DEGs），對DEGs 進行聚類熱圖及火山圖分析總覽DEGs 分布情況、差異大小及差異顯著性等信息；對DEGs 進行GO 功能注釋、KEGGpathway 功能注釋，根據注釋結果篩選出信號傳導相關的DEGs 進行GO_Biological Process 及KEGG pathway 富集分析，尋找與免疫相關的信號通路，將相關的免疫細胞因子進行驗證。

1.5 人外周單個核細胞（PBMC）提取和培養、與肺癌細胞共同培養使用淋巴細胞分離液（STEMCELL technology）分離外周單個核細胞，20%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培養液調整細胞密度至1 × 106/mL。按照100 × 106個/mL的濃度培養。第0 天加入濃度為25 μl/mL 的細胞激活劑CD3/CD8 和10 ng/mL 人重組刺激因子IL-2，之后每隔2～3 d 加入人重組刺激因子IL-2。在第3、5、7 和10 天時，根據細胞的密度和生長情況進行傳代處理。在肺癌細胞轉染48 h后，收集細胞上清液制作條件培養基。去除培養基內的細胞碎片，將細胞上清液離心10 min，10 000 ×g，4 ℃，取上清液備用。刺激活化的免疫細胞在顯微鏡下觀察生長狀態良好，制作條件培養基的肺腺癌細胞和肺鱗癌細胞數為50 × 104，培養免疫細胞數為100 × 104，將條件培養基加入免疫細胞中培養，48～72 h 后停止培養。

1.6 統計學方法所有數據統計分析均在SPSS 26.0統計軟件上進行，使用GraphPad Prism 9 軟件進行圖形制作。所有的實驗均進行獨立重復操作3 次，通過單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組數據間均數的比較，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差描述，視P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C-MET 低表達細胞模型的構建使用siRNA沉默C-MET，得到C-MET 低表達細胞株：si-EBC-1、si-H1993，見圖1。

圖1 siRNA 對C-MET 基因的沉默Fig.1 siRNA was used to silence the C-MET gene

2.2 轉錄組測序結果分析本次測序兩組共分別檢測出38 和467 個差異表達基因（DEGs），其中肺腺癌細胞組上調的差異表達基因有24 個，下調的差異表達基因有14 個（表達差異最大的前10 個基因表1）。EBC-1 的C-MET 調控前后表達差異組的表達差異基因共有467 個，上調的差異表達基因有347 個，下調的差異表達基因121 個（表達差異最大的前10 個基因見表2）。差異基因火山圖示DEGs 表達倍數及差異程度（圖2）。

表1 H1993 的差異表達基因Tab.1 The expression of differential gene of H1993

表2 EBC-1 的差異表達基因Tab.2 The expression of differential gene of EBC-1

圖2 EBC-1、H1993 差異基因表達Fig.2 The expression of differential gene

2.3 轉錄組結果的生物信息學分析GO 分析注釋結果如圖3。C-MET 不同表達水平樣本測出的DEGs 進行KEGG Pathway 富集，見圖4。肺腺癌細胞株的KEGG 富集到下調的差異基因參與免疫調節的通路為IL-17 信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、MAPK 信號通路，參與IL-17 信號通路的基因具體為IL1B、JUND、FOS、CXCL8、HSP90AA1、FOSL1、CSF2、S100A9。

圖3 GO 分析注釋柱狀圖Fig.3 The analysis of GO term

圖4 DEGs 進行KEGG Pathway 富集Fig.4 The analysis of KEGG pathway term

2.4 敲低C-MET 基因對免疫細胞分泌細胞因子的影響EBC-1 與PBMC 間接共培養，C-MET 表達影響INF-β、CXCL-10、INF-γ 的表達，見圖5。

圖5 EBC-1 與PBMC 間接共培養Fig.5 EBC-1 was co-cultured indirectly with PBMC

3 討論

以往研究已經證實，C-MET 與腫瘤的免疫微環境密切相關，但具體調控機制并不清楚。為進一步揭示C-MET 調控免疫微環境的機制，本研究建立了兩組C-MET 不同表達水平的細胞模型并進行轉錄組測序。經生物信息學分析證實C-MET 主要參與IL-17 信號通路調控，細胞因子-細胞因子受體相互作用、癌癥中的轉錄調控異常、MAPK 信號等信號通路。利用人免疫細胞與肺癌細胞共培養技術發現，C-MET 基因敲低后表達影響INF-β、CXCL-10、INF-γ 的表達，C-MET 的低表達可能會抑制INF-β、CXCL-10、INF-γ 的分泌。這表明，CMET 對腫瘤微環境的調控可能為促進作用。結合生物信息學分析結果，C-MET 可能通過參與IL-17信號通路等影響相關免疫因子的分泌，促進腫瘤周圍免疫細胞的炎性環境形成。

有研究［7］表明，C-MET 擴增和C-MET 激活通過調節腫瘤細胞STING 基因表達調控免疫微環境，影響PEM（培美曲塞）治療后抗原特異性CD8+T 細胞的免疫原性。本研究發現C-MET 通過白介素17 信號通路、MAPK 信號通路參與腫瘤免疫微環境調控。IL-17 刺激產生的T 淋巴細胞對免疫治療有抵抗作用［8］，IL-17家族通過其相應的受體發出信號，并激活包括NFκB、MAPKs 和C/EBPs 在內的下游通路，以誘導抗微生物肽、細胞因子和趨化因子的表達［9-10］。在T 細胞中PD-1 信號傳導通過抑制PI3K/AKT和MAPK途徑抑制TCR信號傳導和CD28刺激信號［11］，目前有MAPK 的抑制劑已被證明可以調節腫瘤微環境，增加免疫原性，從而潛在地增加免疫療法的敏感性［12］，這與本研究結果一致。

本研究通過共培養實驗發現C-MET 表達影響CXCL-10、INF-γ、INF-β 的表達，與si-EBC-1 共培養的PBMC 的CXCL-10、INF-γ、INF-β 下降，與C-MET低表達組相比，C-MET 高表達可使PBMC 中INF-γ的轉錄水平增加77 倍，CXCL-10 增加1.6 倍，INF-β增加2 倍。CXCL-10 由多種類型細胞分泌，包括內皮細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、甲狀腺細胞、前脂肪細胞等；外周細胞液中高水平的CXCL-10的是T 輔助細胞宿主免疫反應的標志［13］。Th1 淋巴細胞聚集并促進IFN-γ 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 的產生，繼續刺激各種細胞分泌CXCL-10，從而產生擴增反饋回路［14］。干擾素IFN-γ 誘導其配體CXCL-10 的分泌，INF-γ 為細胞免疫的關鍵調節因子，由活化的T 淋巴細胞、γδT 細胞和自然殺傷細胞分泌［15］。IFN-γ 可促進抗PD-1 治療后腫瘤細胞中的yes 相關蛋白（YAP）凝聚，其信號傳導還可以激活MAPK、PI3K AKT mTOR 和NF-κB 信號傳導途徑，以調節基因轉錄和促進mRNA 翻譯［16-17］。更有研究［18］表明，IFN-γ 通過激活JAK1/2STAT1 和AKT-mTOR 信號傳導，在肺腺癌細胞中誘導內質網應激，促發細胞凋亡和細胞周期停滯。IFN-γ信號通路增強MHC-I 的表達以刺激抗腫瘤免疫，但也上調程序性死亡配體1（PD-L1）的表達［19-20］。C-MET上調免疫微環境中PBMC相關INF-γ、CXCL-10、INF-β 的表達，可能會影響T 細胞的激活以及程序性死亡配體1 的表達，進而形成炎癥型腫瘤微環境。炎癥性腫瘤微環境以免疫細胞和免疫因子浸潤為主，促進PD-1 抑制劑發揮抗腫瘤效應［21］。C-MET可能通過上調INF-γ、CXCL-10、INF-β參與免疫微環境調控，增強免疫治療療效。

本研究發現C-MET 高表達可能通過調節腫瘤細胞中IL-17 信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、MAPK 等信號通路，上調腫瘤免疫微環境中巨噬細胞INF-β、CXCL-10、INF-γ 的表達。本研究首次使用C-MET 敲低的肺鱗癌細胞模型、肺腺癌細胞模型，進行轉錄組測序技術并進行生物信息學分析，而且體外建立了人免疫細胞與肺癌細胞共同培養模型，說明了C-MET 參與腫瘤免疫微環境的具體通路，闡述了C-MET 基因敲低后對免疫細胞免疫因子分泌的影響。但C-MET 高表達對于肺癌免疫微環境調控的具體分子機制有待進一步深入探索。接下來的研究中，我們將進一步深入探究C-MET介導巨噬細胞細胞因子上調表達的分子機制，為開發非小細胞肺癌治療的藥物靶點和分子標志物提供理論依據。

【Author contributions】XU Yue performed the experiments and wrote the article.ZHANG Yanbin revised the article.SU Shan designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.