基于ox-LDL/LOX-1信號通路探討脂質代謝紊亂促進肺癌進展中的機制

吳陽 姚堅 陳金亮

南通市第一人民醫(yī)院1感染科，2呼吸科（江蘇南通 226001）

代謝重編程是惡性腫瘤的標志之一［1］。腫瘤細胞可以改變其代謝模式以滿足能量需求并促進自身生長，這不僅可以幫助它們抵抗外部壓力，還可以賦予細胞新的功能［2］。已證明異常脂質代謝通過提供能量、大分子和脂質介導的信號傳導在癌癥進展中起著重要作用，這為針對代謝靶點的新治療策略提供了指導［3］。人凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1（lectin-like ox-LDL receptor 1，LOX-1）被認為是氧化低密度脂蛋白（oxidized low-densitylipoprotein，ox-LDL）的受體，研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，二者異常表達與幾種病理的發(fā)展和進展有關，如動脈粥樣硬化、肥胖、二型糖尿病和癌癥。最近，LOX-1在腫瘤微環(huán)境中表達的重要性開始引起關注。據報道［6］，抑制癌細胞中的LOX-1會抑制腫瘤的發(fā)展。此外，一些臨床研究［7-8］表明，血液中的LOX-1 水平反映了某些類型癌癥的發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)強調了LOX-1 在腫瘤進展、遷移、侵襲和腫瘤相關新血管生成中的調節(jié)劑作用，并提出該受體可作為增強當前抗腫瘤策略的有希望治療靶點［9］。然而，LOX-1 在肺癌細胞脂質代謝重編程中的作用仍不清楚。在本研究中，我們系統(tǒng)地探討了LOX-1 與肺癌進展的關系，并利用獨創(chuàng)性通路分析對其中機制進行初步分析。

1 材料與方法

1.1 免疫組織化學分析臨床樣本從本院收集81 個已鑒定的具有成對相鄰非癌組織（離腫瘤至少5 cm）的肺腺癌組織，使用鏈霉親和素-生物素復合物方法進行免疫組織化學檢測LOX-1 表達。將針對LOX-1 兔多克隆抗體（1∶100，武漢三鷹生物技術有限公司）作為第一抗體。基于染色強度和染色細胞的百分比，使用AperioScanScope 系統(tǒng)（美國Vista 公司）計算Histo（H）分數(shù)。強度分數(shù)定義如下：0，細胞中無明顯染色；1，與基質細胞相當?shù)募毎械娜跞旧?，中間染色；3，強染色。陽性細胞的比例被評分為0%～100%。如前［10］所述，通過將強度得分和分數(shù)得分相乘，計算出H 得分，總范圍為0～300。由兩名對臨床病理數(shù)據不知情的研究者對組織切片進行獨立檢查和評分。本研究經南通市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批件號：GY202107011）。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉染和分組A549 和H1299 細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，并在RPMI 1640培養(yǎng)基（美國HyClone 公司）中培養(yǎng)。將LOX-1 基因插入GV208 載體的BamHI 和AgeI 位點之間，以產生LOX-1 過表達（OE）的慢病毒。構建具有空GV208載體的慢病毒作為對照（VC）。將靶向LOX-1基因的shRNA 克隆到GV371-U6-LOX-1 shRNASV40-EGFP 載體（shLOX-1）中。LOX-1 shRNA 序列為：GAACACCATCGCTTTGTTAT。將上述重組慢病毒穩(wěn)定轉染到肺癌細胞系中。然后將細胞在指定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，并進行分析。本研究中使用的慢病毒購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司。

體外實驗分組如下：（1）第1 部分：用不同濃度ox-LDL（0、5、10、25 μg/mL）處理A549 和H1299 細胞72 h，檢測肺癌細胞中LOX-1 表達和侵襲能力。（2）第2 部分：驗證LOX-1 是ox-LDL 誘導的肺癌細胞侵襲所必需的功能靶點。用ox-LDL（25 μg/mL）處理轉染shNC 或shLOX-1 的A549、H1299 細胞72 h，檢測肺癌細胞的侵襲能力。（3）第3 部分：LOX-1過表達的A549（A549-OE）、H1299（H1299-OE）細胞分為對器（Con）組和伊他替尼（Itacitinib）組，其中Con 組用PBS 和Itacitinib 組用Itacitinib（1 μmol/L，瑞士MedChemtronica 公司）處理細胞24 h，檢測肺癌細胞的侵襲能力。

1.3 Transwell 侵襲試驗將重懸浮于無FBS 培養(yǎng)基中的肺癌細胞加入到用Matrigel（美國Sigma公司）包被的頂部室（美國Corning-Costar 公司；孔徑8 μm），底部室填充30% FBS 作為誘導物。48 h后，固定和染色膜底部侵襲的細胞。在光學顯微鏡下對侵襲細胞進行計數(shù)和拍照。

1.4 細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測使用CCK-8 測定用于估計細胞數(shù)量，以評估細胞活力。將LOX-1過表達的A549細胞以2 × 103細胞/孔的密度（每組4 個重復）加載到96 孔板中，并在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用CCK-8 試劑（上海Beyotime 公司）在0、1、2、3 和4 d 檢測細胞增殖能力。將10 μL CCK-8 溶液添加到每個孔中，并在37 ℃避光孵育4 h。使用酶標儀測量每個孔在450 nm 處的光密度（OD值）。

1.5 蛋白質印跡法（Western blot）使用RIPA 裂解緩沖液（上海Beyotime 公司）從細胞中分離總蛋白。采用BCA 試劑盒評估蛋白質濃度。蛋白質樣品進行電泳并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國GE Healthcare 公司）上。在5%脫脂牛奶中封閉后，將膜與靶向LOX-1（1∶1 000）、JAK1（1∶1 000）、STAT6（1∶1 000）、p-JAK1（FSP-1）（1∶500）、p-STAT6（1∶500）和GAPDH（1∶2 000，美國Santa Cruz 公司）的一抗在4 ℃下孵育過夜。然后將膜與HRP 偶聯(lián)的二抗（1∶5 000，英國Abcam 公司）一起溫育1 h，并用ECL 化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Thermo Fisher 公司）觀察條帶。

1.6 癌癥信號通路抗體陣列和獨創(chuàng)性通路分析由上海伯豪生物技術有限公司設計和制造癌癥信號通路抗體陣列。轉染后48 h 收獲細胞裂解物。用抗體陣列檢測試劑盒對來自細胞裂解物的蛋白質進行生物素化。首先將抗體微陣列載玻片封閉溶液中封閉45 min。將載玻片與來自細胞裂解物的生物素標記的蛋白質（25 μg）在偶聯(lián)溶液中孵育2 h，使用Cy3 綴合的鏈霉親和素檢測結合的生物素化蛋白質。載玻片在GenePix 4000B 生物芯片掃描儀上掃描，并用GenePix Pro 6.0（美國Axon Instruments 公司）分析圖像。將來自滿足倍數(shù)變化＞1.2的癌癥信號傳導途徑抗體陣列的蛋白質上傳至生物反應路徑分析系統(tǒng)（美國QIAGEN 公司）以確定哪種典型途徑最歸因于肺腺癌中的LOX-1。

1.7 統(tǒng)計學方法使用SPSS 22.0 進行所有統(tǒng)計分析。統(tǒng)計數(shù)據均以平均值±標準偏差表示。所有實驗獨立重復至少3 次。使用不成對學生的t檢驗或單向ANOVA 分析數(shù)據，然后在適當?shù)那闆r下進行Bonferroni 事后分析。基于P值評估統(tǒng)計顯著性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LOX-1 過表達與淋巴結轉移相關，并預測非小細胞肺癌的不良生存在包含原發(fā)性人肺癌和匹配的鄰近非癌組織中，腫瘤中LOX-1 染色比非癌組織樣品明顯增強（中值H 分數(shù)99.4vs.16.2，t=14.55，P＜0.001）（圖1A）。在Kaplan-Meier 生存分析中，高LOX-1 表達與低生存顯著相關（P＜0.001，圖1B），表明LOX-1 可能有助于肺癌的惡性行為。此外，LOX-1 過表達與高組織學分級、淋巴結轉移和晚期AJCC 分期相關（P＜0.05）（表1）。與無淋巴結轉移的患者相比，發(fā)生淋巴結轉移患者的癌組織具有更高的LOX-1 水平（中值H 分數(shù)83.2vs.121.1，t=3.42，P＜0.01）（圖1C）。

表1 LOX-1 表達與臨床病理參數(shù)的關系Tab.1 Relationship between LOX-1 expression and clinicopathological parameters例

圖1 LOX-1 過表達與淋巴結轉移相關，并預測非小細胞肺癌的不良生存Fig.1 Overexpression of LOX-1 is related to lymph node metastasis and predicts the bad survival of non-small cell lung cancer

2.2 LOX-1 促進肺癌細胞的遷移和侵襲為了評估LOX-1 過度表達的病理后果，我們在肺腺癌細胞系（A549、H1299 細胞）中過表達LOX-1（圖2A）。LOX-1 過表達對細胞增殖沒有影響（圖2B），但在Transwell 侵襲試驗中，OE 組的侵襲轉移細胞數(shù)顯著高于VC 組（t=14.01、13.26，P＜0.01）（圖2C）。這些結果表明LOX-1 過表達促進了肺癌的轉移行為。

圖2 LOX-1 促進肺癌細胞侵襲Fig.2 LOX-1 promotes the invasion of lung cancer cells

2.3 LOX-1 是ox-LDL 誘導的肺癌細胞侵襲所必需的功能靶點用不同濃度ox-LDL處理肺癌細胞，并發(fā)現(xiàn)隨著ox-LDL濃度增加，LOX-1表達逐漸增強（圖3A）。隨后，我們在肺腺癌細胞系（A549、H1299細胞）中敲低LOX-1（圖3B）。與oxLDL+shNC組相比，ox-LDL+shLOX-1 組A549、H1299 細胞的侵襲轉移細胞數(shù)顯著降低（t=4.55、6.12，P＜0.01）（圖3C）。

圖3 LOX-1 是ox-LDL 誘導的肺癌細胞侵襲所必需的功能靶點Fig.3 LOX-1 is a necessary functional target for invasion of lung cancer cells induced by ox-LDL

2.4 LOX-1 調節(jié)肺癌中JAK1/STAT6 信號獨創(chuàng)性途徑分析結果顯示JAK1 和STAT 途徑是排名最高的受影響的典型途徑（圖4A）。Western blot 分析顯示，LOX-1 過表達上調JAK1/STAT6 信號傳導，和LOX-1 敲低則減弱JAK1/STAT6 信號傳導（圖4B）。

圖4 LOX-1 調節(jié)肺癌中JAK1/STAT6 信號Fig.4 LOX-1 regulates JAK1/STAT6 signal in lung cancer

2.5 伊他替尼減弱過表達LOX-1 肺癌細胞的轉移能力與Con 組相比，伊他替尼組LOX-1 過表達的A549（A549-OE）、H1299（H1299-OE）細胞在48 h 的侵襲轉移細胞數(shù)顯著降低（t=6.84、7.02，P＜0.01）（圖5）。

圖5 伊他替尼減弱過表達LOX-1 肺癌細胞的轉移能力Fig.5 Itatinib weakens the metastatic ability of lung cancer cells overexpressing LOX-1

3 討論

脂質代謝紊亂的一個重要特征是循環(huán)中低密度脂蛋白的增加，這種脂蛋白可以被氧化（ox-LDL）［12］。研究［6-8］發(fā)現(xiàn)，ox-LDL 及其受體水平的升高與各種癌癥風險的增加呈正相關。本研究表明，腫瘤中LOX-1 染色比非癌組織樣品明顯增強，高LOX-1表達與低生存顯著相關，表明LOX-1可能有助于肺癌的惡性行為。此外，LOX-1 過表達與高組織學分級、淋巴結轉移和晚期AJCC 分期相關。總之，這些結果表明LOX-1 過表達細胞可能具有更高的淋巴結轉移傾向。由于淋巴結轉移代表了肺癌生物學的一個重大轉變，從局部表型轉變?yōu)榍忠u表型。我們進一步分析了LOX-1 表達與腫瘤侵襲行為的關系，并發(fā)現(xiàn)LOX-1 可能通過激活JAK1/STAT6 信號通路誘導肺癌細胞的轉移。此外，LOX-1 過表達使肺癌細胞的JAK1/STAT6 信號異常活躍，并對JAK1 靶向治療過敏。開發(fā)和使用藥理學JAK 特異性激酶抑制劑治療癌癥引起了廣泛關注，目前正在多個晚期癌癥臨床試驗中評估幾種選擇性JAK1 抑制劑［13-14］。因此，LOX-1 可以作為一個標記物來選擇可能受益于JAK1 抑制劑的患者，進一步改善JAK1 靶向癌癥治療。

LOX-1 是一種眾所周知的CVD 風險因素，并被用作預測心血管事件的生物標志物［4］。在動脈粥樣硬化和內皮功能障礙中，LOX-1 的激活刺激NF-κB 信號通路，從而促進促炎細胞因子的表達，如IL-1b、TNF-α、MCP1、IL-8 和IL-4［5］。近年來，LOX-1 在癌癥生物學中的重要性逐漸引起了關注。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，ox-LDL 激活LOX-1 刺激腫瘤血管生成、上皮-間質轉化和致瘤潛能，是腫瘤生長的決定因素［15］。然而，目前尚無針對肺癌系統(tǒng)中LOX-1 表達和功能的研究。此外，LOX-1在癌癥病理學中的重要性和作用還沒有很好地證明。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)用不同濃度ox-LDL 處理的肺癌細胞中，LOX-1 表達和細胞遷移能力隨著ox-LDL 濃度增加而增強。ox-LDL 代謝失調已被證實會增加肺癌細胞的風險［16］。ox-LDL 穩(wěn)態(tài)被破壞的肺癌細胞亞型患者的總體存活率明顯低于其他亞型患者［17］。此外，異常的ox-LDL 相關代謝降低了腫瘤對靶向藥物的敏感性，而ox-LDL 相關受體的特異性靶向抑制表現(xiàn)出治療癌癥的巨大潛力［18］。本研究中，敲低LOX-1 表達減弱了ox-LDL誘導的A549、H1299 細胞遷移和侵襲能力增強。這些結果證實了LOX-1 是響應異常ox-LDL 水平的關鍵蛋白的觀點。

為了鑒定由于LOX-1 過表達導致的增強轉移的細胞內信號網絡，我們使用磷酸化抗體微陣列進行了大規(guī)模磷酸化蛋白質組篩選，該微陣列包含來自超過12 個信號通路的269 個位點特異性抗體。分析結果顯示JAK1/STAT 途徑是排名最高的受影響的典型途徑。先前研究［19-20］發(fā)現(xiàn)，LOX-1 上調可促進IL-4 的釋放，其能誘導JAK1/STAT6 信號通路的激活。這些發(fā)現(xiàn)支持了本研究的結論。本研究進一步通過體外實驗發(fā)現(xiàn)伊他替尼（一種有效的選擇性JAK1 抑制劑）減弱過表達LOX-1 肺癌細胞的轉移能力。STAT6 是一種轉錄因子，被JAKs 磷酸化，并易位到細胞核中，啟動反應基因的轉錄，包括EMT 的核心調節(jié)因子，如ZEB1，以促進轉移過程［21-22］。基于這些數(shù)據，我們認為LOX-1至少部分通過JAK1/STAT6 信號通路促進肺癌細胞轉移。

總之，本研究表明LOX-1 的表達隨著ox-LDL水平的升高而增加，并且LOX-1 的表達上調促進了肺癌細胞的轉移、侵襲，其作用機制可能與激活JAK1/STAT6 信號通路有關。我們的數(shù)據提高了對脂質代謝紊亂在肺癌轉移機制中的認識，并提供了一種具有潛在臨床應用價值的抑制肺癌轉移的新策略。然而，目前的研究缺少LOX-1 在體內促進肺癌細胞生長、轉移以及對異種移植腫瘤組織中JAK1/STAT6 通路激活影響的證據，更準確的結論有待進一步體內研究。

【Author contributions】WU Yang performed the experiments and wrote the article.YAO Jian performed the experiments.CHEN Jinliang designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.