Kruppel樣因子14介導的JAK-STAT信號通路對非小細胞肺癌預后的影響

王鵬 姚蘇梅 呂學東 陳金亮

南通市第一人民醫(yī)院呼吸科（江蘇南通 226000）

肺癌仍然是全球癌癥相關死亡率的主要原因，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有病例的80%～85%，主要由肺腺癌和肺鱗癌組成［1］。在臨床上，盡管手術、放化療和靶向治療提高了治療效果，但NSCLC 預后仍然較差，5年生存率約為15%［2］。目前，通過低劑量CT 檢查能夠檢出早期腫瘤，但由于對低劑量CT 的篩查價值和意義認識不夠，導致其難以在高危人群的應用推廣［3］。因此，迫切需要探索新的NSCLC 生物標志物。研究［4-5］證明，多種信號級聯(lián)失調參與了NSCLC 的進展，如Kruppel 樣因子（kruppel-like factors，KLFs）失調介導了肺癌的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤干細胞特性和EGFR-TKI 藥物的持久性。據(jù)報道［4］KLFs 參與多種疾病。KLF14 是KLFs 家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，可能是免疫系統(tǒng)和腫瘤發(fā)病機制中的關鍵調節(jié)因子［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，KLF14 通過降低腫瘤細胞增殖抑制HER2 陽性乳腺癌進展。此外，現(xiàn)有證據(jù)［8］表明KLF14 和腫瘤轉移之間的相關性，例如在轉移性和高級別腦癌中，KLF14 表達下調。然而，KLF14 在NSCLC 轉移和預后中的作用仍不清楚。在本研究中，我們證實KLF14 表達在NSCLC 組織樣本和細胞系中均下調。此外，我們評估了KLF14 過表達對細胞增殖、遷移、侵襲的影響，并闡明了相關的分子機制，旨在為理解KLF14 在NSCLC 進展中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集2018年1 月至2019年9 月本院手術切除的80 例NSCLC 組織和25 例癌旁非腫瘤組織。術前沒有患者接受化療或放療。本研究由本院倫理委員會批準（倫理號：2017026），所有患者均簽署知情同意書。隨訪于2023年4月結束。

1.2 免疫組織化學術后石蠟包埋的組織切片標本保存在我院病理科。在二甲苯中脫蠟，在分級醇系列中再水合，高壓下用檸檬酸鹽緩沖液處理3 min。3%過氧化氫用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片與正常山羊血清（5%）共孵育30 min。用KLF14 兔多克隆抗體免疫染色（1∶500 稀釋）。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算并測量每個圖像的積分光密度（IOD）的平均值。根據(jù)KLF14表達的中值水平（45.77）將患者分為高表達組和低表達組。

1.3 細胞系和細胞轉染人支氣管上皮細胞系（Beas-2B）購自中國科學院昆明細胞庫，在BEGM培養(yǎng)基（瑞士Lonza 公司）中培養(yǎng)。NSCLC 細胞系（SPC-A1、A549、HCC827、H1650 和H1975）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，在RPMI-1640 培養(yǎng)基中（美國Gibco 公司）培養(yǎng)。

選擇A549 細胞用于過表達KLF14、JAK1 和HCC827 細胞用于敲低KLF14、JAK1。將兩種細胞系以3 × 105細胞/孔的濃度接種在6 孔板中。用Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司）轉染質粒（上海捷瑞生物工程有限公司）。轉染48 h后，收獲細胞用于進一步的實驗。合成人KLF14、JAK1 編碼DNA 序列（上海捷瑞生物工程有限公司）并亞克隆到pCDH慢病毒載體中，用于建立過表達KLF14、JAK1 質粒。慢病毒載體用于包裝病毒顆粒。用嘌呤霉素（1 μg/mL，美國Sigma-Aldrich 公司）選擇感染病毒48 h 的A549 細胞系1 周。

人重組shKLF14、shJAK1 慢病毒和陰性對照（shNC）慢病毒由上海捷瑞生物工程有限公司構建。用shRNA 慢病毒感染細胞48 h 后，用嘌呤霉素（1 μg/mL）選擇穩(wěn)定表達shKLF14、shJAK1 和shNC 的HCC827 細胞。shNC 的序列為5'-TTCTCGAACGTGTCACGT-3'；shKLF14 的序列為5'-GAGUCUUUUCAUGUCCAUCA-3'；shJAK1 的序列為5'-AGCTTAAAAAACTCCTCAATCTGAGT-3'。

1.4 細胞增殖試驗在集落形成試驗中，將大約500 個肺癌細胞接種到6 孔板中，培養(yǎng)2 周，細胞克隆形成。然后每孔加入2 mL 100%甲醇固定細胞30 min，棄去甲醇，加入結晶紫染色液染色20 min，然后用顯微鏡拍照。

1.5 細胞侵襲和遷移試驗侵襲試驗：將小室插入24 孔板（美國Corning 公司）中，并用基質膠包被至少3 h，模擬血管基底膜；遷移試驗：將小室插入沒有基質膠涂層的24 孔板中。將含有10% FBS的800 μL 細胞培養(yǎng)基作為化學引誘劑加入到下室中。向有涂層的上室中加入1 × 105個肺癌細胞，向無涂層的上室中加入0.5 × 105個肺癌細胞；在兩種情況下，細胞都重懸于200 μL 無血清細胞培養(yǎng)基中。隨后，用100%甲醇固定從上室通過膜遷移到室外的細胞30 min，并用結晶紫染色溶液對細胞染色20 min。隨機選取9 塊視野拍照，并對細胞進行計數(shù)。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）采用T-PER蛋白提取試劑（補充有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑混合物）（美國Thermo Scientific 公司）對肺癌細胞或組織進行勻漿處理。然后，將等體積和等量（2 μg/μL）的蛋白質進行SDS-PAGE 分離，并將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠轉移至PVDF 膜（美國Millipore公司）。將膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜：抗KLF14 抗體（美國Proteintech 公司）、抗JAK1 抗體（美國Santa Cruz 公司）、抗Stat3 抗體（美國Santa Cruz 公司）、抗β-actin 抗體（美國Santa Cruz 公司）。第二日，將膜與辣根過氧化物酶（HRP）綴合的第二抗體（1∶5 000，美國Proteintech公司）孵育2 h。使用化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）顯示條帶，并使用Quantity One軟件（美國Bio-Rad公司）進行分析。

1.7 微陣列分析商業(yè)組織微陣列（購于上海生物芯片有限公司）評估有或無KLF14 過表達的A549 細胞中參與腫瘤進展的18 種典型信號通路分子的相對表達水平并分析結果。

1.8 統(tǒng)計學方法使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。兩組間的平均值比較采用t檢驗。多組間的比較采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著距離事后檢驗。采用χ2檢驗檢測KLF14 表達與臨床病理特征之間的相關性。采用Kaplan-Meier 法計算生存曲線和生存率。使用對數(shù)秩方法進行生存分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KLF14 在NSCLC 組織中表達下調免疫組織結果提示與癌旁正常組織相比，KLF14 在NSCLC 組織中表達降低（t=6.34，P＜0.001）。此外，不同分期的NSCLC 組織中KLF14 表達存在顯著差異，其中KLF14 在分期Ⅰ、Ⅱ的NSCLC 組織中表達較分期Ⅲ顯著增加（P＜0.001），并且分期Ⅰ的NSCLC 組織中KLF14 表達較分期Ⅱ顯著增加（F=26.03，P＜0.05）（圖1A-C）。通過Western blot分析證實了癌旁正常組織中KLF14 表達高于NSCLC 組織（圖1D）。

圖1 KLF14 在NSCLC 組織中表達下調Fig.1 The expression of KLF14 is down-regulated in NSCLC.

2.2 KLF14 的表達與NSCLC 患者的臨床特征相關根據(jù)免疫組化分析的KLF14 中位表達水平，將80 例NSCLC 患者分為低表達組和高表達組。結果顯示KLF14 的低表達與腫瘤直徑＞3 cm、淋巴結轉移、臨床分期Ⅲ期顯著相關（P=0.004、0.004、＜0.001）（表1）。截至隨訪日，80 例NSCLC 患者中有44例死亡。生存分析顯示中位生存時間為43個月。在高KLF14 表達組和低KLF14 表達組之間的總存活率有顯著差異，低KLF14 表達的患者預后不良（P=0.039）（圖2）。

表1 KLF14 蛋白表達與NSCLC 臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between KLF14 protein expression and clinicopathological features of NSCLC例

圖2 生存分析KLF14 表達與NSCLC 患者的預后關系Fig.2 Relationship between KLF14 expression and prognosis of NSCLC patients by survival analysis.

2.3 KLF14 在NSCLC 細胞中表達下調并介導癌細胞的增殖、轉移與Beas-2B 相比，KLF14 蛋白質表達在NSCLC 細胞系（SPC-A1、A549、HCC827、H1650 和H1975）中顯著降低（F=58.06，P＜0.01）（圖3A-B）。在A549 細胞中轉染KLF14 過表達質粒（KLF14）和在HCC827 細胞中轉染KLF14 特異性短發(fā)夾RNA（shKLF14）來過表達或敲低KLF14（圖3C-D）。KLF14 過表達后，A549 細胞的增殖能力、遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著降低（F=22.58、31.56、26.74，P＜0.05），而KLF14 敲低后，HCC827細胞的增殖能力、遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著增加（F=28.53、21.93、22.50，P＜0.05）（圖3E-H）。

圖3 KLF14在NSCLC細胞中表達下調并介導癌細胞的增殖、轉移Fig.3 The expression of KLF14 is down-regulated in NSCLC cells and mediates the proliferation and metastasis of cancer cells

2.4 KLF14上調抑制了JAK-STAT信號通路使用購買的包含18 個典型信號通路分子的商業(yè)人類蛋白質陣列來驗證KLF14 和參與腫瘤進展的下游信號通路的相關性。結果顯示，STAT3 發(fā)生了顯著改變。通過Western blot 進一步驗證顯示，KLF14 過表達后，A549 細胞中JAK1 和STAT3 蛋白表達降低，表明KLF14 影響肺癌中的JAK-STAT 信號傳導途徑（圖4B）。

圖4 KLF14 上調對A549 細胞中JAK1-STAT3 蛋白表達的影響Fig.4 The effect of KLF14 upregulation on JAK1-STAT3 protein expression in A549 cells

2.5 JAK-STAT 信號通路是KLF14 促進肺癌細胞增殖、轉移所必需的功能靶點通過在KLF14過表達的A549 細胞中轉染JAK1 質粒（JAK1）和在KLF14敲低的HCC827細胞中轉染shJAK1（JAK1特異性短發(fā)夾RNA）來過表達或敲低JAK1（圖5A-B）。與Vector + KLF14 組相比，JAK1 + KLF14 組A549細胞的集落數(shù)顯著增加（t=4.26，P＜0.05）（圖5C）；而shNC + shKLF14 組相比，shJAK1 + shKLF14 組HCC827細胞的集落數(shù)顯著降低（t=3.79，P＜0.05）（圖5D）。Transwell 分析表明，與Vector + KLF14 組相比，JAK1 + KLF14 組A549 細胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加（t=4.33、4.42，P＜0.05）（圖5E）；而與shNC +shKLF14 組相比，shJAK1+shKLF14 組HCC827 細胞遷移和侵襲數(shù)顯著降低（t=4.37、3.89，P＜0.05）（圖5F）。

圖5 JAK-STAT 信號通路是KLF14 抑制肺癌細胞增殖、轉移所必需的功能靶點Fig.5 JAK-STAT signaling pathway is a necessary functional target for KLF14 to inhibit the proliferation and metastasis of lung cancer cells

3 討論

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，5年生存率為4%～17%［9］。探索新的生物標志物對于NSCLC 靶向治療具有重要意義。研究［10-11］表明，KLF14 在許多實體瘤如乳腺癌、肝細胞癌、宮頸癌和胰腺癌中起抑癌作用。通過搜索TCGA數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)KLF14 在NSCLC 組織中表達降低。通過組織學和細胞學驗證獲得了相同的結果，KLF14 的低表達與NSCLC 患者的腫瘤直徑＞3 cm、淋巴結轉移、臨床分期Ⅲ期和較差的總生存期相關。因此，我們假設KLF14 在NSCLC 中也起到了抑癌作用。KLF14 對NSCLC 生物學行為影響的進一步研究表明，KLF14的上調抑制了NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲。

KLF14 被證明是多種人類疾病中的轉錄調節(jié)因子，如癌癥和2 型糖尿病［12-13］。越來越多的報道表明KLF14 在腫瘤發(fā)生中經(jīng)常作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。例如，CHU 等［14］發(fā)現(xiàn)KLF14 通過調節(jié)SOCS3/RhoA/Rock/Stat3 信號通路減輕乳腺癌侵襲和M2 巨噬細胞極化。CHEN 等［15］指出，KLF14 下調導致結腸癌、乳腺癌和甲狀腺癌細胞中細胞增殖減少、周期停滯和細胞凋亡增加。與先前研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)，KLF14 在NSCLC 組織和細胞系中下調，KLF14 過表達顯著降低了癌細胞體外增殖、侵襲，表明KLF14 可能是NSCLC 中的腫瘤抑制因子。目前，KLF14 在NSCLC 中的作用尚未完全確定，與肺癌發(fā)生和疾病進展相關的分子機制的數(shù)據(jù)非常有限。因此，我們使用人類蛋白質陣列對KLF14 影響肺癌轉移的機制進行了初步研究，結果表明，KLF14 可以抑制細胞內(nèi)JAK-STAT 信號通路，從而抑制數(shù)百個下游基因表達事件。我們的研究揭示了KLF14 抑制肺癌細胞轉移的一種新的分子機制。

JAK1-STAT3 途徑的異常激活與多種癌癥的惡性發(fā)展有關，如肝細胞癌、胰腺癌、胃癌以及乳腺癌等［16-18］。一些文獻已經(jīng)證實，JAK1-STAT3 途徑的激活促進了NSCLC 的惡性發(fā)展［19-20］。針對JAK1-STAT3 途徑的治療被認為是一種有前途的腫瘤治療方案。目前正在探索JAK1-STAT3 途徑的新型抑制劑［21-22］。本文進一步探討了KLF14 對JAK1-STAT3 通路活性的影響。結果表明，KLF14的上調抑制了JAK1-STAT3通路的激活。深入研究表明，KLF14 的上調可能通過抑制JAK1-STAT3 通路抑制NSCLC 細胞惡性表型。這一發(fā)現(xiàn)為KLF14成為NSCLC 治療的靶點提供了有利的分子證據(jù)。因此，KLF14 的上調可能通過抑制JAK1-STAT3 途徑的活性來抑制NSCLC 的體外生長、轉移。這些數(shù)據(jù)為KLF14 作為NSCLC 的靶點提供了更可靠的證據(jù)。然而，目前的研究缺少KLF14 在體內(nèi)抑制NSCLC 細胞生長、轉移以及對異種移植腫瘤組織中JAK1-STAT3 通路激活影響的證據(jù)，更準確的結論有待進一步體內(nèi)研究。

總之，KLF14 低表達與NSCLC 腫瘤直徑大、淋巴結轉移、高臨床分期和較差的總生存期相關。功能實驗表明，KLF14 上調顯著抑制肺癌細胞在體外的增殖、轉移能力，其作用機制可能與抑制JAK-STAT 信號通路有關。因此，KLF14 可能是一個有價值的NSCLC 預后生物標志物。但KLF14 在NSCLC 中的作用還有待進一步研究。我們的研究結果將為今后NSCLC 的早期診斷和治療提供新的潛在靶點。

【Author contributions】WANG Peng performed the experiments，revised the article and wrote the article.YAO Sumei performed the experiments.LV Xuedong and CHEN Jinliang designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.