肺泡灌洗液外泌體表皮生長因子受體基因突變檢測對晚期非小細胞肺癌患者的臨床意義

楊昌恒 陳穎 張中元 馬慶慶

貴州航天醫院1呼吸與危重癥醫學科，2中心實驗室（貴州遵義 563000）

肺癌是常見惡性腫瘤之一，其中NSCLC 占全部肺癌的80%～85%，大多數患者在診斷時已屬晚期，病死率高［1-2］，鉑類藥物為主的聯合化療方案是其主要治療手段［3］。盡管診療技術方面已取得了很大的進步，5年存活率也只有13%左右［4］。近來，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）在NSCLC 患者治療中的地位日顯突出，靶向個體化治療成為EGFR基因突變的晚期NSCLC 患者的一種治療手段［5-7］。檢測EGFR 基因突變主要標本有原發腫瘤組織、血液。然而原發腫瘤組織因手術禁忌證、并發癥等難以獲得足量DNA 的腫瘤組織標本限制了臨床應用，血清標本循環腫瘤DNA（ctDNA）含量甚微常導致EGFR 基因突變檢測結果與組織標本檢測結果存在差異，假陰性率高，致使無法及時為部分患者EGFR-TKIs 治療提供有效依據。為此，本研究對78 例晚期NSCLC 患者利用ARMS 法進行BALF 外泌體、血液、肺癌組織標本EGFR 基因突變檢測并以肺癌組織標本檢測結果為標準進行相互比較，旨在探討BALF 外泌體標本是否可替代組織、血液標本檢測EGFR 基因狀態用于臨床靶向治療前的患者篩選，為晚期NSCLC 患者盡早個體化治療決策提供新的思路和篩檢方法，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料入選患者為貴州航天醫院呼吸與危重癥醫學科2021年5 月至2023年5 月住院晚期NSCLC 患者78 例，其中男35 例，女43 例，年齡為49～79 歲，平均（59.35±4.78）歲，腺癌52 例；腺鱗癌18例；鱗癌8例。準入標準：（1）組織活檢明確NSCLC；（2）臨床TNM 分期為Ⅲb-Ⅳ期；（3）初診未接受任何治療；（4）無嚴重心肺、肝腎功能和凝血功能障礙，能耐受檢查；（5）患者及家屬均簽署知情同意書，倫理編號：倫審［2023］1-024。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液收集、外泌體分離、鑒定及DNA提取完善術前檢查并簽署知情同意書，以2%利多卡因5 mL 采用高流量氧氣霧化吸入進行局部麻醉，OLYMPUS BF-1TQ290電子支氣管鏡經鼻插入，常規檢查左右支氣管，據患者胸部CT 顯示的病變部位，將支氣管鏡遠端楔于目標支氣管開口處，注入37 ℃溫生理鹽水，10 mL/次，灌洗3 次，以13 kpa負壓吸引，收集25～30 mL 肺泡灌洗液，送本院中心實驗室無菌紗布過濾后2 000 r/min 離心5 min，取上清液10 mL 再次15 000 r/min 離心10 min，取上清液10 mL 加入外泌體沉淀液混勻4℃保持直立放置30 min，室溫下將混合物以2 000 r/min 離心10 min，去上清液后再以2 000 r/min離心5 min 徹底去除液體，沉淀中即外泌體。利用透射電子顯微鏡對提取的外泌體進行鑒定，利用DNA 直接提取試劑盒（DNA-Direct Extraction kit）嚴格按照操作說明書抽提外泌液體中的DNA，紫外分光光度計檢測DNA 的質量，ARMS 法進行PCR 擴增檢測EGFR 基因突變。

1.2.2 血液DNA 提取清晨抽取患者空腹外周靜脈血10 mL 送本院中心實驗室置于帶有血清分離膠的血清管中靜置于常溫下，血清管3 000 r/min 離心5 min，分離上清液，取上清液5 mL 再2 000 r/min離心5 min，使用血液DNA 提取試劑盒嚴格按操作說明書提取DNA，無菌蒸餾水對所提取的DNA 進行反復洗脫。同上方法檢測DNA 質量并進行EGFR 基因突變檢測。

1.2.3 肺癌組織DNA提取將CT引導下經皮肺穿刺或支氣管鏡鉗取的新鮮肺癌組織送本院中心實驗室經反復離心后，取其中沉淀的細胞團常規脫水，中性福爾馬林固定后石蠟包埋。將制作好的腫瘤細胞蠟塊連續4 μm厚切10片，HE常規染色鏡下觀察腫瘤細胞，選取瘤細胞比例＞50%的按石蠟組織DNA 提取試劑盒操作說明書提取DNA。同上方法檢測DNA的質量并進行EGFR基因突變檢測。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0 軟件包進行統計學分析，肺泡灌洗液外泌體、血液、肺癌組織標本檢測EGFR 基因突變狀態采用例表示，突變率采用例表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺泡灌洗液外泌體鑒定結果透射電子顯微鏡下觀察外泌體，電鏡視野內可見具有雙層膜的微小囊泡，直徑約為40～200 nm 的圓形顆粒，見圖1。

圖1 肺泡灌洗液外泌體電鏡鑒定結果Fig .1 Electron microscopy identification of BALF exosomes

2.2 肺泡灌洗液外泌體、肺癌組織標本檢測EGFR 基因突變結果比較肺泡灌洗液外泌體標本檢出EGFR 突變型33 例，野生型42 例，檢測無結果3 例，檢測突變率42.3%（33/78），假陰性率6.4%（5/78）；肺癌組織標本檢出突變型38 例，野生型40例，檢測突變率48.7%（38/78）。肺泡灌洗液外泌體標本EGFR 基因突變檢測符合率86.8%（33/38），比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 肺泡灌洗液外泌體、肺癌組織標本EGFR 基因突變率結果比較Tab.1 Comparison of results of EGFR gene mutation rate in BALF exosomes and lung cancer tissue samples例

2.3 肺泡灌洗液外泌體、血液標本檢測EGFR 基因突變結果比較肺泡灌洗液外泌體標本檢出EGFR 突變型33 例，野生型42 例，檢測無結果3 例，檢測突變率42.3%（33/78），假陰性率6.4%（5/78）；血液標本檢出突變型25 例，野生型53 例，檢測突變率32.1%（25/78），假陰性率16.7%（13/78），二者比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 肺泡灌洗液外泌體、血液標本EGFR 基因突變率結果比較Tab.2 Comparison of results of EGFR gene mutation rate in BALF exosomes and serum samples例

2.4 肺癌組織、血液標本檢測EGFR基因突變結果比較肺癌組織標本檢出EGFR 突變型38 例，野生型40 例，檢測突變率48.7%（38/78）；血液標本檢出突變型25 例、野生型53 例，檢測突變率32.1%（25/78），血液標本EGFR 基因突變檢測符合率65.8%（25/38），二者比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 肺癌組織、血液標本EGFR 基因突變率結果比較Tab.3 Comparison of results of EGFR gene mutation rate in lung cancer tissue and serum samples例

3 討論

肺癌流行病學統計呈現發病率、病死率雙高的局面，其中NSCLC 占所有肺癌的絕大多數，發現時多為晚期，40%患者失去最佳手術機會［8］，每年全球約有138 萬例死于肺癌，是一種全球性的疾?。?］。癌癥相關死亡中，肺癌是全球及我國癌癥死亡的主要原因［10-11］。近來大量研究表明［12-13］EGFR 基因突變與NSCLC 的發生、發展、病理類型等密切相關，檢測EGFR 基因突變狀態，預測晚期NSCLC 患者口服EGFR-TKIs 的療效已成定論，EGFR 基因突變陽性NSCLC 患者是對靶向治療有反應的肺癌亞群［14］，患者可明顯獲益，有效率明顯高于野生型患者，效果不亞于含鉑的聯合化療方案。治療模式已從經驗性細胞毒性化療轉向為分子靶向治療［15］，顯著延長了EGFR 基因突變晚期NSCLC 患者的無進展生存期（PFS）［16］。因此，晚期NSCLC 患者EGFR 基因突變檢測顯得尤為重要。

血液、肺癌組織標本檢測EGFR 基因突變已應用于臨床。然而，血液標本因多種原因致使EGFR 基因突變檢測結果與肺癌組織標本檢測結果不一致，假陰性率高。本研究中血液標本檢測EGFR 基因突變率32.1%（25/78），組織標本檢測EGFR 基因突變率48.7%（38/78），二者比較差異有統計學意義（P＜0.05），血液標本檢測突變率低、假陰性率16.7%（13/78）較高成為血液標本檢測EGFR基因突變的缺陷；腫瘤組織檢測突變率高，是用于EGFR 基因突變檢測的“金標準”標本來源，但組織活檢存在并發癥、禁忌證、創傷性、不易重復性、耗時長等缺陷，限制了臨床應用。因此尋找EGFR基因突變檢測的替代標本用于晚期NSCLC 患者靶向治療前篩檢，是本研究所要解決的問題。

外泌體是細胞分泌的微小囊泡，存在于多種體液中，參與細胞與細胞之間的交流，運輸特定的內容物如DNA、蛋白質和脂類等［17］，這些物質在其保護下不易被降解破壞［18］。有關可成功提取到血漿外泌體、肺泡灌洗液外泌體方面的研究已有報道［19-22］。本研究BALF 外泌體標本檢出33 例EGFR基因突變型，突變率42.3%（33/78）與HAN 等［23］肺泡灌洗上清液檢測EGFR 基因突變率（44.8%）一致；血液檢測出EGFR 突變型25 例，突變率［32.1%（25/78）］與周小昀等［24］檢測170例 NSCLC 患者外周血清游離DNA 中EGFR 基因敏感突變率（35%）相一致，二者檢測EGFR 基因突變率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；肺癌組織標本檢出EGFR基因突變38 例，突變率［48.7%（38/78）］與李迎雪等［25］手術切除組織檢測EGFR 基因突變率（46.15%）一致，BALF 外泌體標本EGFR 基因突變檢出率與肺癌組織標本比較差異無統計學意義（P＞0.05）。研究發現BALF 外泌體標本EGFR 基因突變檢出率高于血液標本檢測，假陰性率6.4%（5/78）低于血液標本檢測16.7%（13/78），優于血液標本檢測，分析原因可能是灌洗液外泌體中腫瘤細胞DNA 出現的局部濃度較高的緣故；以腫瘤組織標本檢測為標準，BALF外泌體標本EGFR基因突變檢測符合率86.8%（33/38）高于血液標本檢測65.8%（25/38）。結果說明檢測EGFR 基因突變率，BALF 外泌體標本檢測結果介于組織、血液標本檢測之間，優于血液標本檢測。

BALF 外泌體標本EGFR 基因突變檢測具有以下特點：（1）可行性及有效性：BALF 可成功提取外泌體，EGFR 基因突變檢測結果介于肺癌組織、血液標本檢測之間，優于血液標本；（2）標本易獲取性及方便性：BALF 標本可根據患者病情在內鏡室、病床邊經支氣管鏡灌洗獲得；（3）治療決策及時性：BALF 外泌體標本EGFR 基因突變檢測克服了組織活檢耗時較長、不易獲取，且提高部分血液標本假陰性患者靶向治療機會。然而，本研究也存在一定的不足之處：3 例檢測失敗，失敗率3.8%（3/78），分析最可能原因是目標支氣管定位不準確所致，術前CT 支氣管三維成像并認真閱片選擇目標支氣管和有經驗醫師操作支氣管鏡十分必要；缺少與患者臨床特征關系和與EGFR-TKIs 療效相關性的研究，且研究樣本量較少，難免出現研究數據偏倚。在后續研究中，會擴大樣本量并進行以上臨床研究，進一步明確BALF 外泌體EGFR基因突變檢測在晚期NSCLC 患者的應用價值。

綜上所述，支氣管肺泡灌洗液外泌體標本EGFR 基因狀態的檢測可以替代原發腫瘤組織、血液標本EGFR 基因狀態檢測應用于臨床靶向治療前的患者篩選，為臨床上晚期NSCLC 患者盡早開始個體化治療決策開辟了新的思路和篩檢方法。

【Author contributions】YANG Changheng designed the study，performed the experiments，wrote and revised the article.CHEN Ying collected and statisticsed datas，looked up literature，performed the experiments.ZHANG Zhongyuan performed the experiments and statisticsed datas.MA Qingqing designed the study，performed the experiments and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.