納米技術在動脈粥樣硬化中的應用與研究進展

王婷婷 于莉莉 沈祥麗 鄭峻萌 陳玉善 尚莎莎 王建茹

1河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（鄭州 450000）；2河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管內科（鄭州 450000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種全身性、炎癥性的血管系統(tǒng)疾病，是心血管疾病的主要病因，特別是冠狀動脈粥樣硬化中個別“高危斑塊”被認為是急性心肌梗死等急性臨床事件的主要決定因素。因此，迫切需要先進和創(chuàng)新的診療技術來發(fā)現(xiàn)和治療疾病的早期階段，如不穩(wěn)定斑塊和血栓形成［1］。納米材料的分子成像探針與前沿成像方法的結合，構建納米藥物遞送系統(tǒng)，為監(jiān)控AS 中病變反應指明方向。AS 斑塊的特征性改變是血管狹窄，動脈管腔變窄引起血流動力學變化，增加了斑塊纖維帽的剪切力，從而導致斑塊不穩(wěn)定，不穩(wěn)定斑塊極易促進新生血管，增加患者發(fā)生不良心血管事件的風險。臨床上將患者管腔狹窄程度、新生血管的數量和分布作為選擇AS 診斷及評判預后的重要依據［2］。目前診斷AS 影像學方法包括有創(chuàng)腔內檢查：冠脈造影、血管內超聲、近紅外光譜、血管鏡檢查、光聲成像；無創(chuàng)腔外檢查：頸動脈高頻體表超聲、超聲造影、多排螺旋計算機化X 線體層照相術（computed tomography，CT）、磁共振顯像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射計算機斷層成像（positron emission computed tomography，PET）等［3］。但傳統(tǒng)影像學檢查過程存在成相差、準確性低等特點，對AS 早期診斷有一定的局限性［4］。例如，超聲造影技術是借助微泡造影劑加大組織與血流對比的一項新技術，可實時動態(tài)觀察器官或血管內微循環(huán)灌注，優(yōu)點是價格低、安全性高、操作方便、實時觀察。但這項技術仍然存在諸多問題，如親和力低、穿透性差、半衰期短等缺點［5］。而納米技術和分子成像的結合彌補了現(xiàn)有影像學的不足，具有較高的磁化率和良好的生物相容性，精準檢測不穩(wěn)定斑塊，為指導AS 臨床管理和療效評價提供重要的依據。大量臨床前研究［6］證明，納米技術因其特有的超順磁性、光響應性、小尺寸等優(yōu)點，在AS生物學診斷中發(fā)揮著巨大優(yōu)勢，例如納米微泡、納米探針、納米顆粒，分別是超聲造影、MRI 和熒光成像示追蹤劑，將分子影響對比劑整合到納米載體中，可以精準區(qū)分病理組織和正常組織，靶向斑塊的納米載體能夠識別AS 斑塊中過表達的生物標志物、修飾病變區(qū)域積累的特異性配體，使AS 診斷準確性得到極大的提高，實現(xiàn)定點監(jiān)控AS 的病變情況［7］。

此外，納米顆粒被認為是最有前途的藥物載體之一，通過兩親和共聚物在水介質中自組裝合成了高分子納米顆粒，負載不同藥物，在AS 治療中發(fā)揮不同機制［8］。與傳統(tǒng)藥物相比，納米顆粒負載傳統(tǒng)藥物具備以下優(yōu)勢：第一，利用靶向配體分子對納米顆粒表面進行功能化修飾，使納米藥物精準地靶向AS 血管內皮細胞，減少脫靶效應；其次，天然及仿生細胞膜修飾后的納米顆粒，具有保留細胞膜固有特性和功能的能力，能夠躲避巨噬細胞吞噬，以其獨有的特性免疫侵襲和靶向能力，發(fā)揮抗AS 的作用；第三，納米顆粒實現(xiàn)炎癥微環(huán)境刺激響應智能釋藥，定點清除AS 的炎癥病灶；最后，納米顆?？梢载撦d多種抗AS 藥物，實現(xiàn)時/空間精準同步抗AS 綜合治療；因此，納米技術在AS 的診療中具有廣闊的前景。

1 納米微泡在AS 診斷中應用

納米技術與超聲造影相結合已成為當前超聲成像研究的熱點，它在保留超聲造影技術原有的優(yōu)勢下，將靶向超聲造影劑特異性抗體與納米微泡結合，通過抗體與患者體內的特異性抗原結合，優(yōu)化了超聲造影在AS 診斷中的不足之處（圖1）。WANG 等［9］將特異性抗體血管內皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）與納米微泡結合，靶向VEGFR-2 的抗體納米微泡可以準確檢測斑塊的位置，并且對斑塊的檢出率、靈敏度和特異性均高于空白的納米微泡。這種結合避開傳統(tǒng)微泡對直徑的限制，能夠通過患者血管內皮細胞的縫隙進入斑塊，增強AS斑塊新生血管的超聲信息獲取，對早期不穩(wěn)定斑塊的診斷更具有優(yōu)勢。

圖1 納米微泡在冠狀動脈粥樣硬化中發(fā)生過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the occurrence of nanobubble in coronary atherosclerosis

LI 等［10］同樣證明了靶向納米造影劑在診斷AS 斑塊炎性損傷和早期病變中的極大優(yōu)勢，較常規(guī)超聲造影更精準。研究者通過細胞間粘附因子（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）靶向納米超聲造影，評價兔的AS 模型中腹主動脈不同階段炎癥損傷程度。與二維、常規(guī)超聲造影相比，ICAM-1 靶向納米超聲造影可以顯示第4～12周外膜強度增強，第16 周內-中膜和外膜均增強，與AS 斑塊炎癥損傷進展一致。因此，攜帶特異性配體的靶向造影劑，不僅增強血流的超聲信號，還提高超聲圖像的清晰度和分辨率，針對于在檢測早期斑塊穩(wěn)定性方面具有良好的發(fā)展前景。

2 納米探針在AS 診斷中的應用

2.1 納米探針與MRIMRI 是一種主流的無創(chuàng)成像技術，能夠穿透深層組織，顯示帶有斑塊和血栓的異常血管壁，被用來成像AS 斑塊，脂質核體積，纖維帽厚度和出血量。優(yōu)勢在于無電離輻射、更高的空間分辨率。但MRI 存在的缺點是造影劑靈敏度低［11］。因此，設計敏感、特異的血管病灶富集探針，對于促進MRI 在AS 診斷中的應用至關重要。納米技術的超微尺寸與表面修飾相結合，極大地增加了造影劑特異性積累。納米探針分為納米乳劑和納米晶體兩種分子類型，因含有機氟化合物分子，具備良好的生物相容性，能更好地增強造影劑的靈敏度［12］。BONNET 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，納米乳劑負載超順磁性氧化鐵能產生精準的MRI信號。而首個抗半乳糖凝集素-3 的人抗體（human antibody against galectin-3，p3）能夠監(jiān)測到只在AS主動脈組織中存在的半乳糖凝集素-3（Galectin-3），Galectin-3 代表AS 的主要免疫細胞亞群TREM2 陽性的巨噬細胞亞群強烈表達。研究者構建的納米探針，即NEs-SPIO-PEG；它與抗體功能化組合，利用聚乙二醇（PEG）層進行表面功能修飾，減少肝臟攝取，延長半衰期，開發(fā)一種改進的靶向造影劑，通過對小鼠主動脈和人動脈切片以及Apoe-/-小鼠AS 模型的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，該造影劑能準確識別AS 生物標志物Galectin-3，實現(xiàn)了靶向監(jiān)測AS 斑塊內病變，為AS 的無創(chuàng)靶向成像和監(jiān)測治療應用鋪平了道路。

研究［14］證實，攜帶納米探針的造影劑與成像技術結合，可精準檢測到AS 斑塊內炎癥反應，錳離子（Mn2+）修飾的納米顆粒可以在富含過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）的情況下分解生成Mn2+，這使得Mn2+增強的T1 加權MRI 能夠放大AS 斑塊內病變的信號。研究者利用多孔錳取代普魯士藍納米晶體，釋放Mn2+來照亮AS 內斑塊的病變部位，體外MRI 結果顯示，在不含H2O2的情況下，T1 加權MRI 信號強度與納米立方體濃度正相關。而一旦引入H2O2，H2O2誘導Mn2+從納米晶體中釋放MRI信號強度明顯升高，能更有效地定量測定AS 斑塊中的脂核、纖維帽厚度核出血量，且靈敏度更強。為監(jiān)測H2O2相關AS 的演變奠定了堅實的基礎，也將有利于H2O2相關治療過程的監(jiān)測。

2.2 納米探針與近紅外熒光成像仿生納米技術的分子成像可用于無創(chuàng)評估炎癥狀態(tài)和斑塊內血管生成，特別是在納米探針方面，已開發(fā)出針對特定病變的細胞膜涂層合成仿生納米探針，能夠靶向病變部位及增強成像顯影，提高診斷高效性及準確性。近紅外熒光成像具有靈敏度高、檢測線低、時空分辨率高、可視化、實時追蹤和非侵入性等特點?；钚耘菽奘杉毎母患寗覣S 斑塊的形成和演化，是精確識別易損斑塊的重要目標［15］。WU 等［16］通過與驅動的泡沫巨噬細胞靶向肽偶聯(lián)，采用氧化鐵作為磁芯進行T2 和T2*加權MR 成像，制備介孔二氧化硅層裝載近紅外熒光成像染料新型納米探針，將兩種成像元件疊加，通過組織切片染色得到證實在MR/近紅外熒光雙模態(tài)中，顯影出泡沫巨噬細胞沉積和AS 斑塊成像，最終實現(xiàn)雙模成像效果。并且生物相容性實驗進一步證實了納米探針在體內的安全性高。

JIANG 等［17］開發(fā)了一種在第二近紅外光譜區(qū)中性粒細胞膜偽裝納米探針，仿生納米探針通過趨化因子受體與ICAM-1 的相互作用靶向炎癥、高危斑塊聚集，檢測兔和小鼠AS 模型中炎癥、高危斑塊的成像，與對照組相比，熒光強度提高276%，具有良好的生物相容性，更清晰顯影ICAM-1 在炎癥部位高表達。這說明新型納米成像技術對AS中炎癥、高危斑塊進行活體成像更具有優(yōu)勢。此外，WANG 等［18］采用萘酰亞胺基熒光探針對細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）進行識別，靶向泡沫細胞的血小板膜包裹探針表面，形成具有兩個囊泡的納米探針。體內研究結果表明，利用納米探針識別和清除ROS 的能力，可以特異性識別巨噬細胞來源的泡沫細胞，并且不被巨噬細胞吞噬，膜融合后可以識別到ROS 發(fā)出的熒光信號，納米探針可在早期AS 大鼠胸主動脈內積累，且病理切片未見明顯生物毒性。這表明泡沫細胞靶向系統(tǒng)具有良好生物相容性，能夠安全高效地診斷早期AS 泡沫細胞形成，實現(xiàn)了“早發(fā)現(xiàn)”的目的。

2.3 納米探針與光聲成像光聲成像是一種集光學成像與超聲成像于一體的無創(chuàng)檢查，利用納秒脈沖激光與組織中的光吸收劑之間的產生的光吸收、熱膨脹和壓力聲波，實現(xiàn)光聲重建，其優(yōu)點是費用低、空間分辨率高，能夠穿透深層組織［19］。JIANG 等［20］利用新型的脂滴誘導物磷脂二酰絲氨酸修飾的納米探針，它被特異性的泡沫細胞中的脂滴識別，并攜帶到斑塊部位，特異性識別AS 病變部位。此外，高度疏水的脂滴使成像探針具有高效的光吸收，能夠極大地增強光聲信號，最終為診斷AS 斑塊的離體熒光成像和體內光聲成像方面表現(xiàn)出強大的效力。

光學成像定量多模態(tài)納米探針的生物分布明顯更準確，特別是在白色組織中，巨噬細胞在AS中起著關鍵作用，是AS診斷的重要靶點，這進一步實現(xiàn)了巨噬細胞的高分辨率組織成像。右旋糖苷一種生物相容性多糖，是巨噬細胞靶向劑。DENG等［21］使用納米晶體包裹含汞的核，攜帶右旋糖苷，形成一種基于近紅外量子點的多模態(tài)探針，用于在體內、體外和原位對肥胖嚙齒動物巨噬細胞進行高效靶向和多尺度成像。與廣泛使用的天然葡聚糖相比，多模態(tài)納米探針在細胞和組織水平上具有靶向性，在肥胖小鼠靜脈給藥后2～24 h，體內動態(tài)PET 成像，超過60%的炎癥單核/巨噬細胞高顯影，使用相同的激發(fā)帶、發(fā)射濾波器和成像條件，用3D 層析近紅外熒光成像與相關PET 成像結果一致。

WU 等［22］開發(fā)了一種基于納米耀斑的DNA 傳感器，可以報告AS 斑塊典型標記次氯酸根離子（ClO-）的分布。將ClO-硫代磷酸鹽插入DNA，然后與金屬納米顆粒核心組裝，形成ClO-特異性納米耀斑探針。ClO-的水解觸發(fā)開啟探針熒光，表現(xiàn)出極佳的靈敏度、特異度。此外，納米探針在追蹤活體小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）內源性和外源性ClO-的變化方面表現(xiàn)出卓越的性能。經靜脈注射后，在小鼠的AS 模型的斑塊中觀察到探針的有效積累和熒光信號的增強。綜上所述，納米技術結合影像學檢查能夠早期、靈敏地檢測到斑塊，準確地判斷AS 的進展和消退。納米技術為AS 的診斷提供新機遇，加速納米醫(yī)學在AS性血管疾病診斷方面的臨床轉化。

3 納米顆粒在AS 診療中的應用

3.1 納米顆粒與PET為了延長無創(chuàng)成像的單劑量持續(xù)時間，以高靈敏度和明確的空間和時間分辨率進行，一種簡便的策略是制備超微納米造影劑作為PET 和計算機斷層掃描的雙模顯像劑。由三碘苯甲酰乙基丙烯酸酯和低聚丙烯酸酯單體修飾的碘聚合物，可直接溶于水，形成具有高碘水濃度，與常規(guī)小分子造影劑相當的黏度的熱力學穩(wěn)定溶液。通過動態(tài)和靜態(tài)光散射技術，在水中形成了水動力直徑約為10 nm的超微碘化納米顆粒［23］。研究發(fā)現(xiàn)，人類AS 組織中趨化因子受體2（chemokine receptor 2，CCR2）的高表達與AS 疾病的狀態(tài)相關。SULTAN 等［24］利用CCR2 與細胞外環(huán)1 反肽相結合，融入被雙金屬銅-金修飾表面的納米簇，注入高脂飲食喂養(yǎng)4 周ApoE-/-小鼠的早期AS 模型中，24 h 后PET 成像顯影，納米簇能在小鼠主動脈弓有很強的信號，而普通造影劑顯影僅在高脂飲食喂養(yǎng)10 周后小鼠主動脈弓處顯影且信號不強，并且活體影像學檢測病變程度與病理學免疫熒光染色的結果相一致。這提示納米簇能敏感檢測小鼠早期AS 病變和斑塊進展。

3.2 納米顆粒與治療藥物納米顆粒表面可以被多肽、金屬、膠束、褐藻酸、β-環(huán)糊精、天然及仿生細胞膜修飾，多肽的優(yōu)點是低免疫原性、高靶向性和易于修飾［25］。見表1。如RGD 肽是含有精氨酸-甘氨酸-門冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的一類短肽，它修飾的納米顆粒很大程度上延長了雷帕霉素藥物在AS 斑塊周圍的停留時間，同時也降低了AS 小鼠主動脈和血清病變的炎癥微環(huán)境，有效減緩斑塊的進展，并且有著良好的安全性和生物相容性［26］。S2P 短肽抑制巨噬細胞分子鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱγ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase γ，CaMKⅡγ），靶向AS 斑塊中巨噬細胞促炎基因，特異性識別AS 斑塊中的特有的炎癥因子，將藥物遞送到此部位，達到靶點治療的目的，改善凋亡細胞吞噬作用，減少壞死核面積，增加纖維冠厚度，穩(wěn)定AS 斑塊［27］。CCR2 靶向肽能促進平滑肌細胞中的膠束吸收和內體逃逸，研究者對高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠 2 周的早期AS 模型和喂養(yǎng)14 周的中期AS 模型腹腔注射攜帶藥物的納米顆粒，結果顯示，4 h后達到100%的藥物釋放，并在溶酶體內腔室內保留了82%～94%，早期AS 模型被抑制其49%病變面積，中期抑制了35%～43%的斑塊生長，其主要作用機制是納米顆粒攜帶的miR-145 與靶向肽協(xié)同作用，共同促進平滑肌細胞收縮表型，減少AS 中不穩(wěn)定斑塊［28］。脂化肽與M2 巨噬細胞膜雜交，促進AS 部位炎癥細胞內化，抑制炎癥、改善內皮功能、促進膽固醇外流，減少AS 斑塊面積，并且納米顆粒所攜帶的藥物半衰期延長（28.1±3.4）h，細胞攝入量增強1.3 倍［29］。

表1 納米顆粒在動脈粥樣硬化治療上的作用機制Tab.1 Mechanisms of nanoparticles in atherosclerosis

膠束是常用的納米顆粒的表面修飾物，膠束表面活性劑分子的疏水基聚集構成膠束內核，親水的極性基團構成膠束外層，其優(yōu)勢是減少聚集，增加溶解度，增強滲透性，提高生物利用度，促進細胞吸收［30］。金屬材料的高表面粗糙度和面積大等優(yōu)勢，增強了ROS 清除，比如鉑具有超氧化物歧化酶和過氧化氫酶相似的催化活性，二氧化鈰的晶格結構和與納米顆粒結構互補，實現(xiàn)對ROS 的重復清除，且在檢測劑量下未見明顯毒副作用［31］。介孔結構以及MnO2中豐富的金屬配位位點提高姜黃素載藥能力，其改善的藥代動力學性能、活性靶向性以及良好的抗AS 效果［32］。膽固醇對β-環(huán)糊精的親和力高于他汀類藥物，被β-環(huán)糊精修飾的納米顆粒與膽固醇相互作用后，靶向AS 斑塊，通過貨物交換釋放他汀類藥物并清除膽固醇，降低斑塊中膽固醇和巨噬細胞的含量，可有效預防AS的發(fā)生和減輕已經形成斑塊面積［33］。

此外，天然及仿生細胞膜修飾后的納米顆粒，躲避巨噬細胞吞噬，大大提升了藥物在體內循環(huán)時間，特異性靶向炎癥血管，實現(xiàn)了低免疫原性、可調控和多功能抗AS 作用［34-35］。如仿生膜結合傳統(tǒng)中藥青蒿素，調節(jié)脂質流入和膽固醇流出，實現(xiàn)炎癥性巨噬細胞中可控藥物的釋放，緩解AS 病變，且生物安全性高，無不良反應［36］。

4 總結與展望

基于納米技術的診斷和治療療效已經成功地在臨床前試驗中得到充分驗證，合適的藥物載體對于確保特定位點的持續(xù)藥物輸送至關重要。目前基于AS 的特異性受體的納米技術也在不斷研發(fā)，解決了當下AS 診斷中存在的瓶頸，但在臨床轉化中仍面臨著多種問題，如價格昂貴、多步驟制備、大規(guī)模生產等問題，靶向方法的差異也為進一步優(yōu)化納米技術的設計提出了更嚴格的要求。隨著科學技術的不斷發(fā)展和進步，利用人工智能、生物醫(yī)學、大數據分析和生物信息學等領域的前沿科學理論與納米技術進行融合，有望突破納米技術研發(fā)過程中的瓶頸。因此，納米技術在AS 領域有潛在的應用價值，值得深入研究，進一步推動AS 的診治走向前沿領域。

【Author contributions】WANG Tingting was responsible for the overall conception，table editing and paper writing.YU Lili，SHEN Xiangli and ZHENG Junmeng revised the paper.CHEN Yushan and SHANG Shasha were responsible for the supervision and guidance of the paper and the overall responsibility of the paper.WANG Jianru was responsible for the quality control and financial support of the paper.All authors read and approved the final manuscript submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.