大黃素抑制胃癌AGS細胞YAP1、FOXD1基因表達及相關機制

顧天 劉春宏 張飛 錢薇 朱艷秋 褚明亮 劉杰民

貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 1檢驗科（貴陽 550001）；2研究生院（貴陽 550002）；3貴州省人民醫(yī)院內鏡中心（貴陽 550002）

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，雖然近年來胃癌的治療方法進展迅速，但是晚期胃癌患者的病死率依然居高不下［1-2］，還需繼續(xù)探尋新的治療方式及治療藥物。大黃是傳統(tǒng)中醫(yī)常用的一味藥材，其具有瀉熱毒、破積滯、行瘀血的功效［3］，大黃素是大黃的重要有效成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節(jié)、利膽保肝、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用［4］。糖酵解代謝途徑是腫瘤細胞獲取能量的主要方式［5］，其中己糖激酶Ⅱ（HK2）是催化糖酵解代謝途徑的首個關鍵酶。HK2 在腫瘤細胞中的異常表達升高意味著糖酵解代謝的高度活化，可以顯著促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等［5-8］。Yes 相關蛋白1（YAP1）是Hippo 信號通路的核心效應因子，叉頭盒基因D1（FOXD1）是進化保守的叉頭盒基因家族成員。二者均被認為是一種致癌基因，在肺癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌及腎細胞癌等腫瘤細胞中表達上調，參與細胞的惡性轉化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等［9-11］。

迄今為止，致癌基因YAP1、FOXD1 在胃癌中表達情況尚無報道，大黃素是否抑制二者表達及其相關機理尚不清楚。因此，本研究將通過TCGA生物信息數(shù)據(jù)庫及相關體外實驗對大黃素在胃癌細胞AGS 中的作用進行研究，期望為其今后的臨床應用提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑大黃素、丙酮酸（純度98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HK2、YAP1、FOXD1 和GAPDH 抗體購自Proteintech 公司；胃癌細胞AGS 由新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理教研室惠贈；胃正常上皮細胞GES-1 由上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院臨床干細胞研究中心惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫生物信息分析UALCAN 在線分析網站［12］（https：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）是一款TCGA 數(shù)據(jù)庫的可視化在線網站，通過該網站分析 TCGA 數(shù)據(jù)庫中胃癌腫瘤樣本和正常組織樣本中HK2、YAP1 和FOXD1 基因的表達情況。

1.2.2 檢測大黃素在GES-1 和AGS 細胞中的半數(shù)致死量及對AGS 細胞增殖能力影響取對數(shù)生長期的GES-1 和AGS 細胞接種于96 孔板中并過夜培養(yǎng)至細胞貼壁。在胃正常上皮細胞GES-1 實驗組中加入已經配平無水乙醇溶解劑的大黃素藥物（0、25、50、75、100、125 μmol/L）。在胃癌細胞AGS 實驗組中分別加入已經配平無水乙醇溶解劑的大黃素藥物（0、5、10、20、30、60 μmol/L）；設置不含藥物及細胞的培養(yǎng)基作為空白組。每組設置3 個復孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 及48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育1 h，并在酶標儀（450 nm）上檢測每孔的OD值，并計算細胞活性。通過IC50 結果，本實驗在隨后實驗中取10、20、30 μmol/L 的終濃度作用于胃癌細胞AGS 48 h后，檢測其對AGS 的增殖能力影響。以上實驗重復3 次。

1.2.3 使用劃痕實驗檢測AGS 細胞遷徙能力 將胃癌AGS 細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，分組加入含不同濃度大黃素（10、20、30 μmol/L）的1%胎牛血清RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 和48 h。按照說明書的操作步驟進行試驗，以上實驗重復3 次。

1.2.4 使用Transwell 實驗檢測AGS 細胞侵襲能力將胃癌AGS 細胞制成3 × 106個/ mL 的細胞懸液，Transwell 下室加入含20% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)液800 μL。Transwell 上室加不同濃度大黃素的胃癌細胞AGS（細胞濃度2 × 106/mL，1% FBS RPMI1640 培養(yǎng)液），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。最后用4%多聚甲醛固20 min 后，通過結晶紫對上室底部細胞進行染色，并擦拭掉上室內部的細胞，并在顯微鏡下觀察并分別計數(shù)。以上實驗重復3 次。

1.2.5 添加外源性丙酮酸實驗將AGS 細胞分為空白對照組和丙酮酸組（丙酮酸和培養(yǎng)基按照1∶2 000 添加），分別干預處理48 h 后，提取蛋白檢測YAP1、FOXD1 蛋白的表達變化。以上實驗重復3 次。

1.2.6 使用Western blot 方法檢測HK2、YAP1、FOXD1 蛋白的表達收集各組胃癌AGS 細胞，并用RIPA 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，并用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度及煮沸加熱變性。SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉后加抗體HK2、YAP1、FOXD1、GAPDH 及二抗等，最后運用ECL化學發(fā)光法進行顯影，并在Image J 軟件上分析蛋白表達量。以上實驗重復3 次。

1.2.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檢測大黃素在AGS 和GES-1 細胞中的半數(shù)致死量及大黃素對AGS 的增殖能力影響半數(shù)致死量（IC50）結果顯示，大黃素對AGS 細胞的藥理抑制能力非常強，其24 h 和48 h 的IC50［（38.24±6.12）μmol/L 和（20.44±3.66）μmol/L］，顯著低于胃正常上皮細胞GES-1 24 h 和48 h 的IC50［（68.49±7.75）μmol/L 和（124.7±2.07）μmol/L］（圖1A，1B，1C，均P＜0.05）。

圖1 大黃素在不同濃度和不同時間點對胃上皮細胞GES-1 與胃癌細胞AGS 細胞活力的影響Fig.1 Effect of emodin on the viability of gastric epithelial GES-1 cells and gastric cancer AGS cells at different concentrations and time points

通過IC50結果，本實驗在隨后實驗中取10、20、30 μmol/L 的終濃度作用于胃癌細胞AGS，進行下一步相關實驗。CCK8 增殖實驗顯示10、20、30 μmol/L 的終濃度大黃素均可以顯著抑制胃癌細胞AGS 48 h的增殖能力（圖1D，均P＜0.05）。

2.2 檢測大黃素對胃癌細胞AGS 遷移能力的影響通過劃痕實驗的結果顯示，大黃素干預后的胃癌細胞的愈合率低于對照組，且濃度越高遷移率就越低，其中30 μmol/L 濃度大黃素可以顯著抑制胃癌細胞AGS 24 h 和48 h 的遷移能力，有顯著的統(tǒng)計學意義（圖2，均P＜0.05）。

圖2 大黃素在不同濃度和不同時間點對胃癌細胞AGS 劃痕遷移的影響Fig.2 Effects of emodin on AGS scratch migration of gastric cancer cells at different concentrations and time points

2.3 檢測大黃素對胃癌細胞AGS 侵襲能力的影響通過Transwell 侵襲實驗的結果顯示，大黃素干預后的胃癌細胞的侵襲能力低于對照組，且濃度越高侵襲率就越低。0、10、20 和30 μmol/L 大黃素干預后，各自穿膜的細胞數(shù)分別為3 093±210、1 550±350、816±76、527±64個。與0 μmol/L相比較，10、20、30 μmol/L 大黃素濃度處理后的胃癌細胞AGS 穿膜細胞數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（圖3，均P＜0.05）。

圖3 不同濃度大黃素對胃癌細胞AGS 侵襲能力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of emodin on the invasion ability of gastric cancer AGS cells

2.4 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中HK2、YAP1 和FOXD1在胃癌及正常組織中的表達情況使用UALCAN在線在線分析網站（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）分析 TCGA 數(shù)據(jù)庫中胃癌腫瘤樣本和正常組織樣本中HK2、YAP1 和FOXD1 基因差異表達情況。結果顯示HK2、YAP1 和FOXD1 基因在胃癌組織中的表達均顯著高于正常胃組織（圖4，均P＜0.05）。

圖4 UALCAN 在線分析HK2、YAP1、FOXD1 在胃癌組織和正常組織中的表達Fig.4 HK2，YAP1 and FOXD1 expression were analysed through UALCAN online in gastric cancer tissues and normal tissues

2.5 檢測大黃素對胃癌AGS 細胞中HK2、YAP1和FOXD1 的蛋白表達影響使用不同濃度大黃素干預胃癌細胞AGS，Western blot 結果顯示與對照組（0 μmol/L）相比，10、20 μmol/L 和30 μmol/L濃度大黃素干預AGS 24 h 后，糖酵解代謝通路關鍵酶HK2 蛋白表達水平明顯被抑制，結果具有統(tǒng)計學意義（圖5，均P＜0.05）。伴隨著糖酵解代謝通路關鍵酶HK2 的下降，致癌基因YAP1、FOXD1蛋白表達水平也明顯被抑制，結果具有統(tǒng)計學意義（圖5，均P＜0.05）。

圖5 大黃素對胃癌細胞AGS 中HK2、YAP1、FOXD1 蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of emodin on HK2，YAP1，and FOXD1 protein expression in gastric cancer AGS cells

2.6 檢測外源性丙酮酸對胃癌細胞AGS 中YAP1、FOXD1 蛋白表達的影響外源性丙酮酸可以增強糖酵解代謝通路［13］，因此本試驗中，單獨補充外源性糖酵解產物丙酮酸，檢測胃癌細胞AGS 糖酵解代謝通路強化后，YAP1 和FOXD1 的表達情況。Western blot 結果顯示，補充外源性糖酵解產物丙酮酸后，與空白對照組比較，胃癌細胞AGS 中致癌基因YAP1 和FOXD1 的蛋白表達顯著增高（圖6，均P＜0.05）。

圖6 丙酮酸提高胃癌細胞AGS 中YAP1 及FOXD1 的蛋白表達Fig.6 Pyruvate increases the protein expression of YAP1 and FOXD1 in gastric cancer AGS cells

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，部分患者特別是農村患者確診后多屬于晚期，無法進行根治性手術切除，而靶向性等藥物治療相對昂貴，對家庭和社會造成重大的經濟負擔［2，14-15］。大黃味苦性寒，涼血解毒，清熱瀉火，活血祛瘀，其化學成分有100 多個，大黃素是其主要成分之一，具有明顯抗腫瘤作用［4］。

本實驗結果表明，大黃素對胃癌細胞AGS 的藥理抑制作用非常明顯，其24 h 和48 h 大黃素的IC50在胃癌細胞AGS 中顯著低于胃正常上皮細胞GES-1（圖1A，1B，1C）。CCK8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的大黃素（10、20 和30 μmol/L）均可以顯著抑制胃癌細胞AGS 的增殖能力。

劃痕實驗顯示30 μmol/L濃度的大黃素可以顯著抑制胃癌細胞AGS 的遷移能力。Transwell 實驗表明，不同濃度的大黃素（10、20和30 μmol/L）均可以顯著抑制胃癌細胞AGS 的侵襲能力。以上提示大黃素體外具有明顯抗胃癌AGS 細胞作用。

糖酵解代謝途徑是腫瘤細胞獲取能量的主要方式，其與腫瘤細胞的多種生物學惡性特征密切相關［5］。HK2 是糖酵解代謝通路中的首個重要關鍵酶，其表達量不僅反映了腫瘤細胞糖酵解代謝的程度，并且反映了腫瘤的惡性程度［6-8］。本研究結果顯示HK2 基因在胃癌組織中表達顯著高于胃正常組織，而大黃素處理胃癌細胞AGS 后，HK2 蛋白表達水平顯著降低，推測大黃素可以抑制胃癌AGS 腫瘤細胞的糖酵解代謝途徑。

YAP1 是Hippo 信號通路中一種重要的信號因子，它在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，包括肝癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等，參與腫瘤細胞的增殖及抗凋亡等［16-17］。研究［18］顯示在胃癌細胞中通過調控YAP1 可抑制癌細胞的增殖和遷移，過表達YAP1的胃癌細胞MKN45可以促進巨噬細胞糖代謝從而促進自身對5-Fu 的化療抵抗［19］。FOXD1是轉錄因子forkhead box 家族成員之一，廣泛參與細胞信號轉導、周期調控、生理代謝等過程。FOXD1 在多種腫瘤組織中表達上調，包括肺癌、胰腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結直腸癌、乳腺癌及腎細胞癌等，參與腫瘤細胞的惡性轉變及發(fā)生進展［9-11，20-23］。近期的研究［10，24］亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD1 與糖酵解代謝途徑密切相關，能通過該途徑促進胰腺癌、鼻咽癌等腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。本研究通過UALCAN 在線網站分析TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)YAP1 和FOXD1 基因在胃癌組織中的表達均顯著高于正常組織。而使用大黃素干預胃癌細胞AGS 后，Western blot 實驗結果顯示，YAP1 和FOXD1 蛋白表達水平均明顯下調，提示大黃素對其有明確的抑制作用。由于本研究同時發(fā)現(xiàn)大黃素可以顯著抑制AGS 細胞的糖酵解代謝關鍵酶HK2，那么大黃素是否通過糖酵解代謝途徑抑制了致癌基因YAP1 和FOXD1 的表達？丙酮酸是糖酵解的中間產物，在糖酵解代謝中發(fā)揮著重要作用，研究表明增加外源性丙酮酸可以增強糖酵解代謝通路［13］，因此本試驗中，單獨補充外源性丙酮酸，檢測胃癌細胞AGS 糖酵解代謝通路強化后，YAP1 和FOXD1 的表達情況。結果顯示，補充外源性丙酮酸后，YAP1 和FOXD1 的蛋白表達都顯著升高，即其表達伴隨著糖酵解代謝的增強而增高。以上結果提示，大黃素可能通過抑制AGS 細胞的糖酵解代謝途徑，進一步抑制致癌基因YAP1 和FOXD1 的表達，從而抑制細胞的增殖、遷移和侵襲等腫瘤生物學表型。

總之，本實驗初步揭示了大黃素和胃癌AGS細胞糖酵解代謝途徑及致癌基因YAP1 和FOXD1的部分關系。希望以上研究能為大黃素未來的臨床應用提供一些理論基礎。

【Author contributions】GU Tian and LIU Chunhong performed the experiments and wrote the article.CHU Mingliang and LIU Jiemin designed the study and reviewed the article.ZHANG Fei ，QIAN Wei and ZHU Yanqiu participated experiment research，data analysis.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.