同種異體移植物炎性因子-1在糖尿病睪丸大鼠模型中的表達(dá)及意義

李德朝 張明津 藍(lán)一筆 馬春雷 付偉金

1賀州市中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科（廣西賀州 542899）；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（南寧 530022）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種代謝性疾病，表現(xiàn)為全身內(nèi)環(huán)境的血糖增高，可引起全身多個(gè)系統(tǒng)和器官發(fā)生病變［1］，如糖尿病腎?。―KD）、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病心肌病、糖尿病足潰瘍等［2-4］，嚴(yán)重影響患者身體健康。近年，DM 對(duì)男性生殖系統(tǒng)特別是對(duì)睪丸功能的影響逐漸引起了研究者的重視。DM 可引起氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)［5-6］，激活相關(guān)信號(hào)通路如胰島素和血糖調(diào)控通路FoxO1 等［7］，導(dǎo)致睪丸細(xì)胞凋亡和生精細(xì)胞減少［8-9］，影響睪丸功能，具體機(jī)制仍有待研究。

同種異體移植物炎性因子-1（allograft inflammatory factor-1，AIF-1）是一種與巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)密切相關(guān)的炎癥因子［10-11］，已經(jīng)證實(shí)AIF-1 參與DKD 發(fā)病過程，并促進(jìn)炎性因子IL-6、TNF-α 等過表達(dá)［12］，提示AIF-1 誘發(fā)的炎癥反應(yīng)可能在DM發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。那么AIF-1 在DM 睪丸中表達(dá)情況及是否會(huì)引起炎癥反應(yīng)，目前研究相關(guān)報(bào)道較少。本研究擬建立Ⅰ型DM 睪丸大鼠模型，探討AIF-1 在DM 睪丸大鼠模型中的表達(dá)及意義，為DM睪丸病變?cè)\斷和治療提供新策略和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4～6 周齡，雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SD大鼠飼養(yǎng)在SPF 級(jí)屏障環(huán)境，濕度40%～70%，溫度20～26 ℃，光照12 h，所有大鼠自由飲水及飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2022-KT-國(guó)基-254），所有操作均根據(jù)國(guó)家研究委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器鏈脲佐菌素（STZ）、檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)至美國(guó)Sigma公司，AIF-1 兔抗鼠單克隆抗體（ab283319）、NFκB p65 鼠單克隆抗體（ab32536）購(gòu)至美國(guó)Abacm公司，HRR 標(biāo)記羊抗鼠二抗IgG（GB21302）、組織自發(fā)熒光淬滅劑（G1221）購(gòu)至武漢賽維爾公司，免疫組化染色試劑盒購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，分析天平購(gòu)至盛平公司，電子天平購(gòu)至力辰公司，血糖儀（卓越型）購(gòu)至ROCHE 公司，病理切片機(jī)（RM2016）購(gòu)至上海徠卡儀器有限公司，白光顯微鏡（E100）和正置熒光顯微鏡（Eclipse C1）購(gòu)至上海尼康儀器有限公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組42 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（DM 組，n=24）和正常對(duì)照組（normal control，NC 組，n=18）?？崭箷r(shí)，DM 組單次腹腔注射pH=4.5，0.1 mmol/L 的檸檬酸緩沖液溶解的STZ，50 mg/kg。注射STZ 后3 d，尾靜脈采血，隨機(jī)血糖高于16.7 mmol/L 時(shí)，出現(xiàn)多飲、多食、多尿等癥狀時(shí)，判定為糖尿病大鼠模型成功［13-14］；NC 組僅腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。

24 只實(shí)驗(yàn)組大鼠中，造模成功20 只，將DM 大鼠隨機(jī)分組：（1）糖尿病睪丸4 周組（DMT4W 組，n=6）：成模4 周后處死。（2）糖尿病睪丸8 周組（DMT8W，n=6）：成模8 周后處死。（3）糖尿病睪丸12 周組（DMT12W，n=6）：成模12 周后處死。NC 分組：（1）正常對(duì)照4周組（NC4W，n=6）：4 周后處死。（2）正常對(duì)照8 周組（NC8W，n=6）：8 周后處死。（3）正常對(duì)照12 周組（NC12W，n=6）：12 周后處死。

1.4 測(cè)量大鼠血糖和體質(zhì)量每周記錄大鼠的進(jìn)食量和飲水量，用天平測(cè)量空腹時(shí)各組大鼠體質(zhì)量；尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定各組大鼠隨機(jī)血糖值。

1.5 標(biāo)本采集斷頸法處死各組大鼠后摘取雙側(cè)睪丸，天平稱量睪丸重量。PBS 液清洗后將睪丸組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，4 μm切片。左側(cè)睪丸組織用于HE染色，行組織病理學(xué)檢查；右側(cè)睪丸組織用于免疫組化和免疫熒光檢查。

1.6 組織病理學(xué)檢查切片放入酒精脫蠟后，浸泡蘇木素3 min，自來(lái)水清洗后1%鹽酸酒精分化5 s，返藍(lán)5 min，伊紅液浸泡20 s，洗滌后，切片浸沒于不同梯度酒精和二甲苯液體脫水，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，細(xì)胞核染為藍(lán)色，胞質(zhì)染為紅色，按100 ×、200 ×、400 ×倍數(shù)拍片。

1.7 免疫組織化學(xué)檢查切片脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min 后，滴加一抗AIF-1（濃度1∶2 000），4 ℃孵育過夜，滴加HRR標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶300），37 ℃孵育20～30 min，PBS 洗滌后室溫下孵育30 min。PBS 洗滌后滴加DAB 顯色劑。自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染30～60 s，1%鹽酸乙醇分化后，返藍(lán)，無(wú)水乙醇，二甲苯脫水透明后封片鏡檢。顯微鏡觀察，拍片。

AIF-1 蛋白陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。免疫組化結(jié)果判定參考既往文獻(xiàn)［15-16］，隨機(jī)檢測(cè)4 個(gè)高倍視野（400 ×），結(jié)果采用半定量計(jì)分方法，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性細(xì)胞比例（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的比例）的乘積來(lái)判定。染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分為無(wú)特異性著色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色；染色陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分：0 分為＜5%，1 分為5%～25%，2 分為6%～50%，3 分為＞51%。兩種評(píng)分相乘（A×B），將結(jié)果分為：0～3 分為低表達(dá)；4～9 為高表達(dá)。

1.8 免疫熒光檢查清洗及浸泡切片后，山羊血清封閉，室溫孵育60 min 后滴加一抗AIF-1（濃度1∶300）和NF-κB p65（濃度1∶500），4 ℃過夜。PBS清洗，滴加熒光素標(biāo)記二抗（濃度1∶200），室溫孵育60 min 后PBS 清洗，DAPI 染核15 min，PBS 清洗，加抗熒光淬滅劑，封片后熒光顯微鏡下觀察（400 ×）。AIF-1 和NF-κB p65 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為紅色特異性熒光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphpad Prism 5 軟件作圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；成組設(shè)計(jì)兩樣本過均數(shù)比較，滿足獨(dú)立性、正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若不滿足方差齊性及正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖、睪丸情況實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠體質(zhì)量、隨機(jī)血糖，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。DMT組大鼠于造模成功6周、9周時(shí)各死亡1 只，最后共存活16 只，分別為DMT4W組6 只，DMT8W 組5 只及DMT12W 組5 只，總體來(lái)說(shuō)，STZ 誘導(dǎo)1 型DM 大鼠模型成模率較高，誘導(dǎo)周期短，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。NC 組18 只，在飼養(yǎng)過程中無(wú)死亡，分別為NC4W 組6 只，NC8W 組6 只，NC12W 組6 只。

表1 實(shí)驗(yàn)前糖尿病組和對(duì)照組大鼠體質(zhì)量、血糖比較Tab.1 Body weight and blood glucose in diabetic and control rats before experiment ±s

表1 實(shí)驗(yàn)前糖尿病組和對(duì)照組大鼠體質(zhì)量、血糖比較Tab.1 Body weight and blood glucose in diabetic and control rats before experiment ±s

注：與NC組相比，*P＜0.05

組別NC4W DMT4W NC8W DMT8W NC12W DMT12W血糖（mmol/L）7.70±1.32 7.47±1.29*6.30±0.77 7.20±1.17*6.97±0.70 7.35±0.38*數(shù)量6 6 6 6 6 6體質(zhì)量（g）171.43±12.36 178.55±15.29*179.23±12.89 182.80±13.52*172.61±10.34 173.27±6.29*

各實(shí)驗(yàn)組大鼠每周稱量體質(zhì)量及監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖。與NC 組比較，DWT 組大鼠飲食、飲水增加，從4 周開始體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01），血糖升高（P＜0.01）；到了8、12 周各實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量大鼠持續(xù)下降（P＜0.01）；而血糖繼續(xù)升高（P＜0.01，表2）。

表2 糖尿病組和對(duì)照組大鼠體質(zhì)量、睪丸重量、血糖比較Tab.2 Body and testicular weight，and blood glucose in diabetic and control rats ±s

注：與NC組相比，*P＜0.05；**P＜0.01

組別NC4W DMT4W NC8W DMT8W NC12W DMT12W睪丸（g）1.67±0.11 1.64±0.10 1.87±0.10 1.65±0.11*1.94±0.16 1.52±0.03*數(shù)量6 6 6 5 6 5體質(zhì)量（g）289.55±32.16 201.47±28.12**384.85±17.84 203.44±23.11**469.93±29.37 231.52±36.86**血糖（mmol/l）7.23±0.94 28.30±3.22**7.23±0.86 26.92±1.98**8.21±1.95 26.20±3.72**

分別于造模成功4、8、12 周后處死各組大鼠，與NC 組相比，DWT4W 組大鼠睪丸重量雖然降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2），8、12 周時(shí)，睪丸重量持續(xù)下降（P＜0.01，表2）。

2.2 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)變化組織病理學(xué)結(jié)果表明，與NC 組相比，DMT4W 組大鼠生精小管形態(tài)不規(guī)則，睪丸間質(zhì)和支持細(xì)胞減少，生精細(xì)胞從基底膜分離，形狀不規(guī)則、排列紊亂，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞數(shù)量減少、畸形增多。到了DMT8W、DMT12W 時(shí)，生精小管進(jìn)一步萎縮，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞進(jìn)一步減少，提示隨著DM 病程加重，DM 組睪丸組織萎縮，結(jié)構(gòu)改變明顯（圖1）。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)圖片F(xiàn)ig.1 Histopathological images of the rat testicular tissues in different groups

2.3 各組大鼠睪丸AIF-1 蛋白表達(dá)情況免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，NC 組睪丸組織中AIF-1 為低表達(dá)或陰性表達(dá)，與NC 組相比，DMT 各組大鼠睪丸組織內(nèi)AIF-1 陽(yáng)性表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。DMT4W 組中AIF-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)最明顯。雖然DMT8W、DMT12W 組AIF-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)減弱，但仍高于NC 組（表3、圖2）。

圖2 各組大鼠睪丸組織AIF-1 蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of AIF-1 protein in the rat testicular tissues of different groups

表3 AIF-1 蛋白在各組睪丸組織的表達(dá)Tab.3 The expression of AIF-1 protein in the testicular tissues of different groups

2.4 各組大鼠睪丸AIF-1 和NF-κB p65 免疫熒光表達(dá)情況免疫熒光染色結(jié)果顯示，AIF-1 和NFκB p65 主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。與NC 組相比，DWT 各組睪丸組織AIF-1 和NF-κB p65 熒光染色強(qiáng)度明顯增加。DMT4W 組中AIF-1 和NF-κB p65熒光染色最明顯，DMT8W、DMT12W組AIF-1和NF-κB p65 熒光表達(dá)相對(duì)減弱，但仍高于NC 組。陽(yáng)性表達(dá)除見于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核也呈陽(yáng)性表達(dá)（圖3、4）。

圖3 各組大鼠睪丸組織AIF-1 蛋白免疫熒光表達(dá)Fig.3 The immunofluorescence staining expression of AIF-1 protein in the rat testicular tissues of different groups

圖4 各組大鼠睪丸組織NF-kB p65 蛋白免疫熒光表達(dá)Fig.4 The immunofluorescence staining expression of NF-kB p65 protein in the rat testicular tissues of different groups

3 討論

DM 患者長(zhǎng)期處于高血糖環(huán)境，睪丸結(jié)構(gòu)及生精功能受到損害，表現(xiàn)為少精、弱精癥等，其損傷機(jī)制可能與DM 時(shí)產(chǎn)生的持續(xù)高血糖內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致活性氧（ROS）及炎性因子IL-1、IL-6 等表達(dá)增加，激活氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)［17-18］，提示炎癥反應(yīng)可能參與了DM 誘導(dǎo)的睪丸損傷。

AIF-1 是一種17 千道爾頓（17 kDa）單位的鈣結(jié)合蛋白。它是INF-Y 合成，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，可與多種靶點(diǎn)相互作用，與多種炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、間質(zhì)纖維化等發(fā)病密切相關(guān)［19-20］。在1 型DM 大鼠模型和胰島素分泌Ⅰ型細(xì)胞（INS-1）中，AIF-1 可誘導(dǎo)一氧化氮（NO）增多和免疫細(xì)胞活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在Ⅱ型DKD 患者血清AIF-1 表達(dá)水平與蛋白尿增加呈正相關(guān)。AIF-1 在DKD 動(dòng)物模型腎組織和高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（MRGECs）中過表達(dá)，可激活炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)［12］。

目前還不清楚AIF-1 在DM 患者睪丸中表達(dá)情況，是否激活相關(guān)炎癥因子調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路。由于倫理學(xué)原因，真實(shí)世界中無(wú)法對(duì)人DM患者睪丸組織的AIF-1 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。本研究擬對(duì)DM 大鼠模型睪丸進(jìn)行體內(nèi)研究。目前有1 型和2 型DM 動(dòng)物模型，相比2 型，1 型DM 大鼠模型成功率高，是大多數(shù)DM 研究首選動(dòng)物模型［21-22］，因此本研究選取1 型DM 大鼠模型。

本研究首先對(duì)雄性SD 大鼠腹腔注射SMZ，破壞胰島素功能，制作1 型DM 大鼠模型。為模擬體內(nèi)DM 真實(shí)發(fā)病進(jìn)程，本研究分別在誘導(dǎo)DM 大鼠模型成模4、8、12 周時(shí)，檢測(cè)各組大鼠體重和血糖，與NC 組相比，在4、8、12 周時(shí)，DMT 各組大鼠體重持續(xù)下降（P＜0.05）；同時(shí)DMT 各組大鼠血糖持續(xù)增高（P＜0.05），提示DM 造模成功，可模擬體內(nèi)DM 疾病的發(fā)展過程。

組織病理學(xué)結(jié)果表明，與NC 組相比，DMT4W組大鼠生精小管形態(tài)不規(guī)則，間質(zhì)和支持細(xì)胞減少，生精細(xì)胞從基底膜分離，形狀不規(guī)則、排列紊亂，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞數(shù)量減少、畸形增多。到了DMT8W、DMT12W 時(shí)，生精小管進(jìn)一步萎縮，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞進(jìn)一步減少，提示隨著DM 病程加重，睪丸組織結(jié)構(gòu)萎縮，睪丸功能進(jìn)一步受損，與既往研究相符合。

而免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與NC 組相比，DMT 組大鼠睪丸組織生精小管內(nèi)AIF-1 棕黃色或棕褐色陽(yáng)性細(xì)胞多，染色程度深，提示DMT 組睪丸中AIF-1 蛋白表達(dá)明顯升高，表明炎癥因子AIF-1蛋白可能參與DMT 的發(fā)生發(fā)展。

核因子κB（NF-κB）是從B 淋巴細(xì)胞核抽提物中檢出的一種能夠與免疫球蛋白k 鏈和重鏈基因增強(qiáng)子序列特異結(jié)合的核蛋白因子，與細(xì)胞增殖、分化、免疫應(yīng)激以及細(xì)胞周期和凋亡等密切相關(guān)。NF-κB p65 是NF-κB 中由p65 亞單位構(gòu)成的一種異源二聚體，其表達(dá)增加可促進(jìn)相關(guān)炎癥因子增多和激活炎癥反應(yīng)［23］。相關(guān)研究［24-25］證實(shí)過表達(dá)AIF-1 后，通過IkBa 激酶磷酸化和促進(jìn)p65/p50 異源二聚體從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，激活NFκB 信號(hào)通路，導(dǎo)致NF-κB p65 表達(dá)增加。那么在DMT 大鼠模型睪丸內(nèi)AIF-1 過表達(dá)后，是否會(huì)促進(jìn)NF-κB p65 表達(dá)增加？

為證實(shí)這一假說(shuō)，本研究進(jìn)一步結(jié)果顯示，與NC 組相比，DMT 各組大鼠睪丸組織AIF-1 和NFκB p65 免疫熒光表達(dá)增加（P＜0.05），提示DMT大鼠模型中，AIF-1 過表達(dá)后，有可能激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致NF-κB p65 表達(dá)增加，從而促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致睪丸功能受損。

本研究還存在以下不足：（1）沒有對(duì)DMT 各組大鼠睪丸模型中的精子活力和精液常規(guī)進(jìn)行檢測(cè)，因而無(wú)法探討精子活力與AIF-1 表達(dá)的相關(guān)性。（2）沒有檢測(cè)AIF-1 調(diào)控相關(guān)炎性因子IL-6、TNF-α 等表達(dá)。（3）沒有進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從而探討AIF-1 調(diào)控NF-κB p65 表達(dá)的機(jī)制和信號(hào)通路。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)DMT 大鼠模型睪丸組織中AIF-1 過表達(dá)，有可能調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路，因而促進(jìn)NF-κB p65 過表達(dá)，激活炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而破壞睪丸組織結(jié)構(gòu)，影響睪丸功能。AIF-1 有可能成為治療DMT 病變的新靶點(diǎn)和診斷標(biāo)記物。

【Author contributions】ZHANG Mingjin，LAN Yibi and YANG Meizi performed the experiments and wrote the article.MA Chunlei performed the experiments.LI Dechao revised the article.FU Weijin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.