江西省耐多藥結核分枝桿菌鏈霉素基因突變特征

于圣銘 夏良華 詹佳歡 劉思琦 王偉 晏亮 陳開森，4

1南昌大學第一附屬醫院高新醫院（南昌 330096）；2南昌大學公共衛生學院（南昌 330019）；3江西省胸科醫院（南昌 330006）；4南昌市腫瘤基因診斷與創新治療研究重點實驗室（南昌 330038）

據《全球2022年結核病報告》報道，2021年結核（tuberculosis，TB）發病人數比2020年上升了3.6%，耐多藥結核病（multidrug-resistantM.tuberculosis，MDR-TB）的發病患者數也呈現上升趨勢［1］。雖然近年來我國TB 數及MDR-TB 感染人數下降明顯［2］，但由于人口基數大及地區發展不平衡，目前感染人數仍處于全球前列，TB 特別是MDR-TB 的防控形勢依舊嚴峻［3］。鏈霉素（streptomycin，SM）屬于氨基糖苷類抗生素，是治療TB 的一線藥物及傳統性藥物［4，5］，由于SM 殺菌能力強，肌肉注射效果好，也常用于MDR-TB 感染的聯合治療［6］。

氨基糖苷類抗生素作用機制是，直接與核糖體小亞基相互作用，干擾翻譯校對，從而導致蛋白質合成的抑制［7］。目前基因組學研究證明，核糖體蛋白S12（rpsL）、16S rRNA（rrs）和7-甲基鳥苷（m7G）甲基轉移酶（gidB）與SM 耐藥密切相關［8-10］。由于結核菌生長慢，以培養為基礎的常規的表型檢測技術很難適用MDR-TB 高負擔地區及國家，迫切需要被新的技術取代［11］。此外，TB 的流行、耐藥特征及進化與菌型具有重要關系［12］。前期研究證實江西省流行的結核菌主要是北京基因型菌，但該型別菌是否與SM 基因突變及表型耐藥具有關聯未見探討。本研究收集南昌大學第一附屬醫院高新醫院及江西省胸科醫院2021年度臨床分離的MDR-TB 菌株，檢測菌株是否為北京基因型，同時檢測SM 耐藥相關的基因，分析菌株耐藥是否與TB 型別具有關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源菌株來源于南昌大學第一附屬醫院高新醫院及江西省胸科醫院，就醫患者來源于全省各地。結核分枝桿菌H37Rv 標準株（NC 000962.3）為參考菌株。

1.1.2 主要試劑與儀器MGIT 960 及配套的各類試劑：美國BD 公司；羅氏固體培養基、對硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧基肼（TCH）等購于江西全景生物科技有限公司；高速低溫離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電泳儀BG-Power600：北京百晶生物技術有限公司；熱循環PCR 儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定按照《綜合醫院結核分枝桿菌感染實驗室檢查共識》［13］進行分離培養及菌種鑒定。操作人員穿防護服及戴N95 口罩，及在具有負壓的AII 生物安全柜內操作。具體操作如下，所獲得痰標本經酸堿處理，3 500 r/min 離心沉淀15 min 后取沉淀物0.1 mL 接種于改良羅氏培養基斜面培養上，置于35 ℃恒溫培養箱內培養。3、7 d各觀察1 次，隨后每周觀察1 次，取生長培養物行抗酸染色，陽性菌落則觀察其在含對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧基肼（TCH）的培養基上的生長情況，如果PNB 陰性而TCH 陽性則判定為結核分枝桿菌復合群。滿8 周培養基斜面無菌生長則判斷為陰性。

1.2.2 藥敏試驗培養陽性的結核菌采用（Mycobacterial Growth Indicator Tube）MGIT960 液體培養法做結核藥物敏感試驗，各檢測藥物的濃度及判讀標準參照廠家提供的數據。實驗操作嚴格按照相關實驗操作規程、儀器或試劑說明書進行。

1.2.3 DNA 提取、PCR 擴增和測序刮取經80 ℃滅活30 min 的L-J 斜面培養基上的結核菌落到含有TE 緩沖液（400 μL）的塑料管中，煮沸10 min 后放于冰塊上冷卻，13 000 ×g離心5 min，上清液轉移到另一個干凈的EP管中，-20 ℃保留備用。rpsL，rrs和gidB基因和北京基因型擴增區域105RD 采用的引物見文獻［14-15］，所有PCR 擴增采用50 μL 反應體系，包括25 μL 反應MIX、各2.5 μL 正向和反向10 μmol/L 引物、2.5 μL 反應模板及17.5 μL 雙蒸餾水。引物及反應試劑由上海生物工程有限公司合成。rpsL，rrs和gidB基因的擴增反應條件為：預變性：94 ℃ 5 min；35 循環（94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR 產物送上海生物工程有限公司測序。

北京基因型及非北京基因型菌鑒別的反應條件為：預變性：94 ℃ 5 min；25 循環（94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min）；最后72 ℃延伸7 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外成像儀下觀察、判斷結果。非北京家族擴增產物為1 466 bp，而北京家族菌株的擴增產物為761 bp（圖1）。

圖1 北京基因型及非北京基因型菌鑒別PCR 擴增圖Fig.1 PCR amplification map for identifying Beijing genotype and non-Beijing genotype bacteria

1.3 數據分析和統計學方法以結核菌H37Rv（NC 000962.3）為參考菌株，采用BioEdit 軟件（版本7.2.5）對測序序列進行排列及突變位點分析。SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析，兩樣本間率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本特征及耐藥譜本研究收集了106 例非重復的耐多藥結核分枝桿菌，鏈霉素耐藥76 例（71.7%）。在鏈霉素耐藥的菌株中，克拉霉素的耐藥率57.9%（44/76），其次為乙胺丁醇，耐藥率為44.7%（34/76）；在鏈霉素敏感的菌株中，卡那霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、丙硫異煙氨、環絲氨酸、對氨基水楊酸均敏感，克拉霉素的耐藥率為56.7%（17/30），除開SM 敏感株左氧氟沙星耐藥率明顯低于SM 耐藥株外（P＜0.05）外，其他抗生素間無差異（圖2）。

圖2 106 株鏈霉素敏感及耐藥MDR-TB 對一二線抗生素的耐藥圖Fig.2 Drug resistance spectrum of 106 streptomycin-sensitive and resistant MDR-TB strains to first- and second-line antibiotics

2.2 rpsL、rrs 和gidB 基因突變特征106 株菌都擴增出rpsL、rrs和gidB基因片段（圖3），測序后比對發現58 例rpsL基因出現43A＞G 突變，突變類型為賴氨酸→精氨酸（Lys43Arg），8 例出現88A＞G 突變，突變類型賴氨酸→精氨酸（Lys88Arg）。5 例出現rrs基因突變，主要出現在rrs530 環核苷酸位置的堿基取代，其中2 例為514A＞T、1 例為514A＞C、1例為462C＞T 和1 例為517C＞T。3 例gidB基因突變中，包括1 例102G 缺失及1 例115C 缺失，另有1 例gidB102G 缺失和rpsLLys88Arg 雙基因突變，具體結果見表1。

表1 MDR-TB 鏈霉素耐藥結核菌核苷酸突變分布Tab.1 Distribution of nucleotide mutations in streptomycin-resistant MDR-TB

圖3 SM 耐藥基因rpsL、rrs 和gidB 基因擴增圖Fig.3 Amplification maps of SM resistance genes rpsL，rrs，and gidB

2.3 北京基因型結核菌SM 表型耐藥特征與基因突變關系本研究共鑒別出94 株北京基因型結核菌，分離率為88.7%（94/106），94株北京基因型菌中，共有69 株發生SM 基因突變，12 株非北京基因型菌中共計4 株出現突變，北京基因型菌突變率明顯高于非北京基因型菌（P＜0.05），但SM 的表型耐藥兩者間差異無統計學意義（表2）。通過分析北京基因型與非北京基因型SM 耐藥的突變位點，發現北京基因型菌的rpsL突變主要集中于43A＞G和88A＞G，非北京型菌rpsL突變只出現于88A＞G，未見rrs突變（表3）。

表2 譜系和基因突變與表型耐藥情況統計Tab.2 Statistics of genealogy & gene mutations and phenotypic resistance株

表3 北京基因型與非北京基因型SM 突變分布Tab.3 Distribution of SM mutations in Beijing genotype and non-Beijing genotype

2.4 SM 表型耐藥與基因突變關系為了解SM 表型耐藥與基因突變關系，我們將基因突變與表型耐藥進行了比較，7 株表型耐藥菌未檢測到基因突變，而4 株表型敏感株出現了基因突變，SM 基因型改變與表型符合率為89.6%（95/106）（表4）。通過基因突變預測SM 耐藥的敏感度為90.8%（69/76），特異度為86.7%（26/30）。

表4 rpsL、rrs 及gidB 基因對應表型耐藥情況Tab.4 Results of rpsL，rrs and gidB genes corresponding to phenotypic drug resistance

3 討論

SM 抗TB 是通過結合到30S 核糖體亞基干擾蛋白質合成，從而發揮殺菌作用。本研究對106株來源于江西省各地區臨床非重復的耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株進行SM 耐藥基因rpsL、rrs和gidB的PCR 擴增及序列分析，表型檢測顯示76 例出現了SM 耐藥，耐藥率為71.7%，共有73 例檢出了基因突變，突變率為 68.87%，基因突變率與廣東地區（67.15%）相近［16］，低于國內南方地區（72.48%）［5］，高于西部地區（52.60%）［17］；顯著高于伊朗報道（31.25%）［18］，但與緬甸（69.50%）相近［19］，這表明結核菌SM 耐藥的基因突變率存在地理差別。本研究顯示SM 突變主要集中于rpsL基因，突變類型為43A＞G 和88A＞G，未檢測到其他相關突變位點，不同于河北省SM 耐藥的rpsL突變位點［14］。此外，我們還發現rpsL43 突變只出現于北京基因型菌中，表明江西地區該位點與北京基因型之間存在緊密關聯，但也可能與本研究中的非北京基因型菌分離率過低有關［18，20］。另一項研究表明，rpsL43A＞G突變與高水平SM耐藥性相關，rrs突變和gidB缺失突變與低水平耐藥性相關，SM不同耐藥水平可能取決于rpsL、rrs或gidB基因上突變的位置、基因組背景［19-20］。

本研究發現SM 耐藥rrs突變率低（表3），與四川（7.2%）相近［19］，且均出現于北京基因型菌中，表明rrs突變對SM 耐藥可能具有潛在貢獻。未檢測到rrs和rpsL突變共同發生，這表明單基因突變可能會減少對rrs或rpsL的修飾需求［18］。除rpsL和rrs基因突變外，gidB基因突變也被認為與SM耐藥具有重要關系［21］。該基因可有錯義突變和沉默突變，錯義突變與鏈霉素耐藥表型相關更密切［22］。早期的研究觀察到gidB基因具有高度多態性［23-24］，說明該基因容易受到外界因素的影響，包括環境改變和抗生素壓力等。本研究也表明北京型MDR-TB 更容易出現SM 耐藥相關基因突變，這與國內外研究相似［15，24］。大量的研究表明，在感染北京型結核分枝桿菌的情況下，耐藥性風險似乎更高，這可能與北京型菌具有更強的適用能力有關［25-26］。

為進一步了解表型耐藥與上述基因型突變的關系，我們將基因突變與表型耐藥狀況進行了比較，結果發現7 株表型耐藥菌未出現基因突變，4 株表型敏感出現了基因型突變，這說明還有其他機制介導SM 耐藥。例如結核分枝桿菌DosR調節基因Rv2004c 通過氨基糖苷類磷酸轉移酶活性介導SM 耐藥性，lipF（Rv3487c）基因的表達減少，結核分枝桿菌同型半胱氨酸合酶MetC（Rv3340）的過表達，轉錄調節因子whiB7 的表達，Tap 外排泵（Rv1258）的過度表達等等［27-30］。

通過對106 株MDR-TB 進行了SM 耐藥基因rpsL、rrs和gidB的檢測分析，發現基因突變技術預測SM 耐藥的敏感度為90.8%，特異度為86.7%，表明聯合檢測這3 個基因能較為準確地預測SM 耐藥性。由于分子生物學檢測周期短，結果準確性高，可以為江西地區進一步建立結核分枝桿菌SM耐藥性的快速分子診斷方法提供基礎。

【Author contributions】YU Shengming：DNA extraction，data analysis and thesis writing；XIA Lianghua：PCR amplification for identification of Beijing genotypes and non-Beijing genotypes；ZHAN Jiahuan：strain screening，data collection and data organization；LIU Siqi：PCR amplification of drug resistance genes；WANG Wei：DNA extraction and data organization；YAN Liang：strain collection，recovery culture，identification and drug sensitivity testing；CHEN Kaisen：overall experimental design and thesis writing Instruction.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.